採用秀麗線蟲檢測可溶性重金屬持久性毒性的方法

2023-10-05 02:28:09

專利名稱：採用秀麗線蟲檢測可溶性重金屬持久性毒性的方法
技術領域：
採用秀麗線蟲檢測可溶性重金屬持久性毒性的方法，涉及一種採用秀麗線蟲對可溶性重金屬進行涵蓋多個連續世代的持久性暴露，從而檢測該重金屬在長期、低濃度條件下的毒性效應的方法。屬於環境保護、生態毒理學研究、生態風險評價等技術領域。
背景技術：
秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)對外界環境的變化非常敏感，環境脅迫會改變它們的生殖速度、生命周期等發育特徵以及其他行為學特徵。毒理學研究經常採用秀麗線蟲作為毒性測試模式動物，但是對於低濃度、連續性地暴露多個世代周期的持久性毒性的研究並沒有先例。用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品類物質世代毒性的方法已經有所研究，其方法涉及不同世代的秀麗線蟲經過相同的暴露後的效應之間的比較，雖然能夠對重金屬在世代之間的毒性效應得到一定的比較結果，但是該效應及其比較結果相對於真實環境依舊存在差異和不足，主要表現在其一，暴露時間的不連續，每一世代的線蟲其生命周期只有某一段時間接受暴露，並不是全生命階段的暴露，尤其是沒有涵蓋秀麗線蟲對外界環境變化更加敏感的、從蟲卵到成蟲的發育階段；其二，並不能夠反映實際環境下食物與重金屬共存的真實條件，已有研究表明，食物能夠改變秀麗線蟲對重金屬的響應，不考慮食物對秀麗線蟲的影響並不能夠為真實環境條件下的風險進行有力的說明。

發明內容
本發明的目的是公開一種採用秀麗線蟲檢測可溶性重金屬持久性毒性的方法，具體是以蟲卵作為起始受試生物，確定了不影響蟲卵正常孵化的蟲卵起始濃度，以及能夠滿足其生長發育所需的食物起始濃度，在暴露時間、暴露劑量尤其是食物與重金屬共存等方面更加貼近實際環境暴露情形，與現有採用秀麗線蟲進行毒性測試方法比較，具有明確的針對性，對模擬實際環境暴露情形下的毒性研究方法進行了補充和擴展。為了達到上述目的，本發明採用秀麗線蟲對重金屬進行涵蓋多個連續世代的持久性暴露，從而檢測該重金屬在長期、低濃度條件下的毒性效應。本發明確定了不影響蟲卵孵化的蟲卵起始濃度，以及能夠滿足其生長發育所需的食物起始濃度，在暴露時間、暴露劑量尤其是食物與重金屬共存等方面更加貼近實際環境暴露情形。本發明所用秀麗線蟲以及 E. coli 0P50均由復旦大學發育生物學研究所惠贈。具體包括如下步驟A，依照傳統急性毒性測試方法，以秀麗線蟲成蟲作為受試生物，測得該可溶性重金屬的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下設置4個濃度梯度，其中包括3個重金屬濃度， 1個空白對照；其中，測定LC5tl的具體步驟是按照B步驟獲得同步化的卵液，在覆有E. coli 0P50並37°C培養過24h的NGM固體培養基上，置於20°C培養48h，獲得同步化的秀麗線蟲成蟲，然後以96孔板為染毒環境，向每孔中加入15條秀麗線蟲成蟲，染毒24h後採用體視顯微鏡對96孔板中的秀麗線蟲進行觀察，蟲體僵直且對輕微觸碰無反應則認定其死亡，分別記錄秀麗線蟲成蟲的總數與死亡數，計算死亡率；若所設定的濃度梯度沒有同時涵蓋30% 至70%的死亡率，則根據情況調整重金屬的濃度梯度若所設定的濃度梯度所產生的死亡率均小於70%，則保持空白對照不變，將重金屬濃度梯度中的最低濃度不變，增加所採用的等對數間距，設定較高的濃度梯度；若所設定的濃度梯度所產生的死亡率均大於30%，則保持空白對照不變，將重金屬濃度梯度中的最高濃度不變，增加所採用的等對數間距，設定較低的濃度梯度。然後再次以96孔板為染毒環境，向每孔中加入15條秀麗線蟲成蟲，染毒 24h後採用體視顯微鏡對死亡率進行觀察；重複此操作直至獲得的死亡率同時涵蓋30%至 70%，然後以濃度對數為橫坐標、死亡率為縱坐標，採用直線內插法獲得其急性LC5tl值；B,按照傳統方法，在20°C條件下將秀麗線蟲培養三天後，用2mL無菌水將NGM培養基表面的秀麗線蟲衝洗至15mL具刻度的離心管中，靜置30min，去除上清液至蟲液小於 1.5mL，根據傳統同步化方法，按照蟲液clorox溶液=1 7的體積比，將clorox溶液加入蟲液中，混合搖勻，反應20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心;3min，棄上清液，再加入無菌水至離心前相同的刻度，搖勻， 2500rpm離心3min，棄上清液，重複該操作兩次，然後向離心管中加入IOmL按照傳統配方獲得的無菌K-溶液後混勻，採用體視鏡觀察40 μ L該混合液的蟲卵數量，若蟲卵數量多於500 枚，則向離心管中再加入2mL無菌K-溶液再混勻、觀察，若蟲卵數量少於300枚，則靜置沉澱lOmin，去除2mL上清液再混勻、觀察，直至將蟲卵濃度稀釋為每40 μ L含有約400枚蟲卵為止，該密度能夠不影響蟲卵的正常孵化，此為第一批進行染毒的蟲卵，標記為卵液Ptl,待用；C，採用依傳統配方獲得的LB液體培養基在37°C、200rpm條件下將E. coli0P50培養24h至48h，混勻後倒入已滅菌的15mL離心管中，4000rpm離心5min，棄上清液，保留沉於底部的菌體，加入8mL無菌K-溶液混勻，以M孔板為容器、以酶聯免疫檢測儀為檢測儀器，測定每300 μ L該混合液在570nm處的吸光度，若吸光度值小於1. 1或大於1. 3，則將混合液重新離心，棄上清液，保留沉於底部的菌體，加入6mL或IOmL無菌K-溶液混勻，再次測定混合液在570nm處的吸光度，通過減少或增加無菌-K溶液的體積將吸光度值調整至1. 1 與1. 3之間，此時E. coli 0P50的總量約為IO8至IO9個，該數量條件下的菌個數能夠為B 步驟所得秀麗線蟲蟲卵的正常生長發育提供足夠的食物，標記為菌液，待用；D，採用無菌透明的M孔板進行染毒，先將C步驟獲得的菌液搖勻，向M孔板的每孔中加入300 μ L該菌液，將B步驟稀釋好的卵液搖勻，向M孔板的每孔中加入200 μ L該卵液，將M孔板劃分為4行、6列，這些含有蟲卵的M孔，每行作為一組、4行共4組對應於 A步驟確定的4個濃度梯度，對秀麗線蟲進行染毒；在對孔板的孔與孔之間加入ImL無菌 K-溶液以減少染毒期間，蒸發對染毒體系的影響；可根據實際需要對所採用的M孔板的個數及相關布局進行調整；將M孔板置於20°C條件下培養並開始計時；E，在D步驟計時的後，從每行中隨機移取1孔中的秀麗線蟲用於測定相關指標，均標記為Ptl的各指標值；Fdf M孔板中4個濃度梯度對應的混合液分別吸取到4個無菌的15mL離心管中， 並用ImL無菌K-溶液衝洗M孔板每一孔中殘留的蟲體，並將衝洗液轉移至相應的離心管中，靜置沉澱15min，棄上清液保留沉澱，根據傳統同步化方法，加入clorox溶液至12mL刻度線，混合搖勻，反應20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心3min，棄上清液，再加入無菌水至離心前相同的刻度，搖勻，2500rpm 離心;3min，棄上清液，重複該操作兩次，然後按照步驟B中的方法，以無菌K-溶液為稀釋液， 將4個離心管中的蟲卵濃度分別稀釋為每40 μ L含有400枚蟲卵，此批蟲卵為母代的子一代蟲卵，標記為卵液F1，待用；重複步驟C獲得菌液，按照與步驟A相同的受試濃度梯度、重複步驟D、Ε，獲得標記為F1的各指標值；G，重複步驟F，獲得子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx的各指標；H，依照Ε、F、G步驟中獲得的各代秀麗線蟲的指標值之間的顯著性差異分析結果， 參照用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品類物質的世代毒性的方法將該可溶性重金屬的持久性毒性類別分為不具有明確的持久性毒性、有延遲性的持久性毒性、具有可被修復的毒性、具有明確並且不可修復的持久性毒性。本發明的效果和優點是1.與先前採用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品世代毒性的方法相比，本發明步驟更少、操作更簡單，不僅保持了接近實際環境濃度的暴露水平，而且實現了暴露時間的連續性，使得多個連續世代的秀麗線蟲的整個生命周期都涵蓋在暴露時間中，尤其是涵蓋了秀麗線蟲對外界環境變化更加敏感的、從蟲卵到成蟲的發育階段，本發明的暴露時間更加接近實際環境條件下的暴露。2.與先前採用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品世代毒性的方法相比，本發明考慮到食物能夠改變秀麗線蟲對重金屬響應的研究，確定了不影響孵化的蟲卵起始濃度，以及能夠滿足其生長發育所需的食物起始濃度，實現了食物與重金屬的共存，暴露情形更加接近實際環境條件下的暴露。3.該方法秉承了對秀麗線蟲行為學、發育學、神經學等豐富指標的可用性，秀麗線蟲個體水平、生理生化水平、分子水平等多層面的各項毒性指標均可以與本方法相兼容。秀麗線蟲在經過接近實際環境的有食物共存、低濃度、長時間的暴露之後，不同世代(母代P。、 子一代F1、子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx)之間相同指標的相互比較結果，不僅能夠獲得該重金屬的毒性是否傳遞給後代，此種毒性傳遞的強弱、傳遞的途徑，以及不同世代對該重金屬的敏感性是否發生變化等結果，使得所進行的毒性研究更加系統、全面，對於判斷毒性產生作用的順序及機理提供明確的指導方向；而且能夠為該重金屬的評價與管理提供更為合理、更加接近實際環境暴露情形的數據基礎，進而為評價該種重金屬的生態風險提供更加可靠的數據。
具體實施例方式實施例1配製LB(Luria Bertani)培養基、NGM(Nematode Growth Medium)固體培養基、 K-溶液和clorox溶液。①根據《分子克隆試驗指南》(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等)配製LB培養基 (IL) :10g胰蛋白腖、5g酵母浸膏、IOg氯化鈉，用lmol/L NaOH溶液將pH值調為7. 0，在 121°C、0. 105MPa 滅菌 20min。另配製 lmol/L NaOH 溶液(IOOmL) :4g 氫氧化鈉，IOOmL 水。②根據S. Brenner在1974年Genetics刊物上發表的論文(The genetics ofCaenorhabditis elegans)配製 NGM 固體培養基(IL) 17g 瓊脂粉、2. 5g 蛋白腖、3g 氯化鈉、25mL pH = 6. 0 的 K2HPO4-KH2PO4 溶液；121°C、0. 105MPa 高壓滅菌 20min，冷卻至 50°C 左右時，加入經抽濾滅菌處理過的lmol/L MgS04、lmol/LCaCl2、5mg/mL膽固醇/乙醇溶液各lmL，混合均勻後倒入滅菌後的培養皿中，靜置冷卻至室溫凝固後，待接種。另配製 lmol/L K2HPO4-KH2PO4 緩衝液(pH = 6. 0，150mL) :11. 4g K2HPO4 · 3H20，50mL 蒸餾水；6. 8g KH2PO4, 50mL蒸餾水；按前者比後者為2 1比例配成pH = 6. 0的緩衝液。配製膽固醇溶液 (IOOmL) :0. 5g膽固醇，IOOmL無水乙醇溶解；抽濾滅菌。配製lmol/L MgSO4(IOOmL) :24. 6g MgSO4 · 7H20, IOOmL 蒸餾水；抽濾滅菌。配製 lmol/L CaCl2 :11. Ig CaCl2, IOOmL 蒸餾水；抽濾滅菌。抽濾除菌用無菌Φ 13mm孔徑0. 45 μ m的硝酸纖維素膜過濾菌類。將濾膜裝在高溫滅菌處理過的容量為5mL的玻璃注射器靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞杆，壓出液膜的溶液即抽濾除菌後的溶液。③根據 P. L.Williams 等人在 1990 年 Environemtnal Toxicology and Chemistry 幹丨J 物上發表的論文(Aquatic toxicity testing using the nematode, Caenorhabditiselegans)配製 K-溶液(IL) :3. OOg NaCl，2.36g KCl ；在 121°C、0. 105MPa 滅菌20min。(4) S. W. Emmons ^Λ 1979 Proceedings of the National Academyof Sciences 幹^|物上發表白勺論文(An analysis of the constancy of DNA sequencesduring development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans)配fj^clorox溶液(30mL) :5mL NaOCl溶液(有效成分6% )，0. 6g NaOH，25mL蒸餾水。根據需要的量現用現配。將大腸桿菌0P50(E. coli 0P50)接種至滅菌後恢復至室溫的LB培養基中，37°C培養Mh即可使用。將培養好的0P50 E. coli接種至NGM培養基上，37°C培養24h即可使用； 將秀麗線蟲接種至該NGM培養基上，20°C常規培養。本發明所用秀麗線蟲以及E. coli 0P50 均由復旦大學發育生物學研究所惠贈。採用秀麗線蟲檢測可溶性重金屬持久性毒性的方法，具體步驟如下A，依照傳統急性毒性測試方法，以秀麗線蟲成蟲作為受試生物，測得該重金屬的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下設置8個濃度梯度，其中包括7個重金屬濃度，1個空白對照；其中，測定LC5tl的具體步驟是按照B步驟獲得同步化的卵液，在覆有E. coli 0P50 並37°C培養Mh的NGM固體培養基上，20°C培養48h，獲得同步化的秀麗線蟲成蟲，然後以 96孔板為染毒環境，向每孔中加入15條秀麗線蟲成蟲，染毒24h後採用體視顯微鏡對96 孔板中的秀麗線蟲進行觀察，蟲體僵直且對輕微觸碰無反應則認定其死亡，分別記錄秀麗線蟲成蟲的總數與死亡數，計算死亡率；若所設定的濃度梯度沒有同時涵蓋30%至70%的死亡率，則根據情況調整重金屬的濃度梯度若所設定的濃度梯度所產生的死亡率均小於 70%，則保持空白對照不變，將重金屬濃度梯度中的最低濃度不變，增加所採用的等對數間距，設定較高的濃度梯度；若所設定的濃度梯度所產生的死亡率均大於30%，則保持空白對照不變，將重金屬濃度梯度中的最高濃度不變，增加所採用的等對數間距，設定較低的濃度梯度。然後再次以96孔板為染毒環境，向每孔中加入15條秀麗線蟲成蟲，染毒24h後採用體視顯微鏡對死亡率進行觀察；重複此操作直至獲得的死亡率同時涵蓋30%至70%，然後以濃度對數為橫坐標、死亡率為縱坐標，採用直線內插法獲得其急性LC5tl值；B，按照傳統方法，在20°C條件下，將秀麗線蟲常規培養三天後，用2mL無菌水將NGM培養基表面的秀麗線蟲衝洗至15mL具刻度的離心管中，靜置30min，去除上清液至蟲液小於1.5mL，根據傳統同步化方法，按照蟲液clorox溶液=1 7的體積比，將clorox溶液加入蟲液中，混合搖勻，反應20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心;3min，棄上清液，再加入無菌水至離心前相同的刻度，搖勻， 2500rpm離心3min，棄上清液，重複該操作兩次，然後向離心管中加入IOmL無菌K-溶液混勻，採用體視鏡觀察40 μ L該混合液的蟲卵數量，若蟲卵數量多於500枚，則向離心管中再加入2mL無菌K-溶液再混勻、觀察，若蟲卵數量少於300枚，則靜置沉澱lOmin，去除2mL上清液再混勻、觀察，直至將蟲卵濃度稀釋為每40 μ L含有約400枚蟲卵為止，該密度能夠不影響蟲卵的正常孵化，此批蟲卵為第一批進行染毒的蟲卵，標記為卵液Ptl，待用；C，採用按照傳統配方獲得的LB液體培養基在37°C、200rpm條件下將E. coli0P50 培養24h至48h，混勻後倒入已滅菌的15mL離心管中，4000rpm離心5min，棄上清液，保留沉於底部的菌體，加入8mL無菌K-溶液混勻，以M孔板為容器、以酶聯免疫檢測儀為檢測儀器，測定每300 μ L該混合液在570nm處的吸光度，若吸光度值小於1. 1或大於1. 3，則將混合液重新離心，棄上清液，保留沉於底部的菌體，加入6mL或IOmL無菌K-溶液混勻，再次測定混合液在570nm處的吸光度，通過減少或增加無菌-K溶液的體積將吸光度值調整至1. 1 與1. 3之間，此時E. coli 0P50的總量約為IO8至IO9個，該數量條件下的菌個數能夠為B 步驟所得秀麗線蟲蟲卵的正常生長發育提供足夠的食物，標記為菌液，待用；D，將M孔板劃分為4行、6列，採用兩個無菌透明的M孔板進行染毒，先將C步驟獲得的菌液搖勻，向兩個M孔板共48孔中加入300 μ L該菌液，將B步驟稀釋好的卵液搖勻，向以每個M孔板的前三列共12孔、兩板共M孔中加入200 μ L該卵液，這些含有蟲卵的24孔，同一行的3孔作為一組、兩板共8組對應於A步驟確定的8個濃度梯度，對秀麗線蟲進行染毒；向每個M孔板的後三列共12孔、兩板共M孔中加入200 μ L無菌K-溶液作為補充液，這些無蟲卵的M孔，同一行的3孔作為一組、兩板共8組對應於A步驟確定的 8個濃度梯度，用於提供菌液在此受試條件下變化的對照；然後將C步驟準備好的重金屬以每行一個濃度梯度、兩板共8個濃度梯度，向兩板共48孔中分別加入500 μ L重金屬，混勻後立即利用酶標儀測定每孔在570nm處的吸光度值，記為ODfe ；在M孔板的孔與孔之間加入ImL無菌K-溶液以減少染毒期間，蒸發對染毒體系的影響；將對孔板置於20°C條件下培養並開始計時；E，在D步驟計時的後，利用酶標儀測定每孔在570nm處的吸光度值，記為0D#， 每一個孔OD值的變化值為Δ OD = ODfe-OD^ D步驟中含有卵液的8個梯度、共M孔的AOD 均要減去同一濃度梯度、不含有卵液的參照孔的Δ( ，記為飲食量抑制率(Ptl)；從每一濃度梯度中含有卵液的三孔中隨機移取1孔中的秀麗線蟲，測定秀麗線蟲的身體大小、身體彎曲頻率、逆向運動等指標的檢測，具體實施步驟是用移液槍從8組濃度分別取少量秀麗線蟲至1.5mL離心管中，沉澱15min，採用移液槍去除上清液，再加入無菌蒸餾水清洗秀麗線蟲身上黏附的0P50E. coli以及重金屬，沉澱15min，將底部秀麗線蟲轉移至無0P50E. coli 的NGM培養基上，置於20°C培養箱中，池後，水分蒸發並且秀麗線蟲已經適應環境之後，採用體視顯微鏡附帶的成像軟體對秀麗線蟲進行照相併進行60seC的錄像，根據文獻對秀麗線蟲的體長、身體彎曲頻率、逆向運動頻率等指標進行檢測。各項指標均以其佔空白對照組的秀麗線蟲相同指標的比例表示。各項指標分別標記為「體長(Ptl) 」、「身體彎曲頻率(Ptl) 」、「逆向運動頻率(P0)，，； F，將經過E步驟後的2個M孔板中含有卵液的8個濃度梯度對應的混合液分別吸取到8個無菌的15mL離心管中，並用ImL無菌K-溶液衝洗M孔板每一孔中殘留的蟲體， 並將衝洗液轉移至相應的離心管中，靜置沉澱15min，棄上清液保留沉澱，加入clorox溶液至12mL刻度線，混合搖勻，反應20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心;3min，棄上清液，再加入無菌水至離心前相同的刻度，搖勻， 2500rpm離心3min，棄上清液，重複該操作兩次，然後按照步驟B中的方法，以無菌K-溶液為稀釋液，將8個離心管中的蟲卵濃度分別稀釋為每40 μ L含有400枚蟲卵，此批蟲卵為母代的子一代蟲卵，標記為卵液F1,待用；重複步驟C獲得菌液，按照與步驟A相同的受試濃度梯度、重複步驟D、E，獲得標記為F1的各指標值，包括「飲食量抑制率(F1) 」、「體長(F1) 」、 「身體彎曲頻率(F1) 」、「逆向運動頻率(F1)，，;G，重複步驟F，獲得子二代F2的各指標值，包括「飲食量抑制率(ig 」、「體長(ig 」、 「身體彎曲頻率(F2) 」、「逆向運動頻率(F2)，，；子三代F3的各項指標值，包括「飲食量抑制率 (F3) 」、「體長(F3) 」、「身體彎曲頻率(F3) 」、「逆向運動頻率(F3) 」 ；以及子四代F4的各指標， 包括「飲食量抑制率(F4) 」、「體長(F4) 」、「身體彎曲頻率(F4) 」、「逆向運動頻率(F4) 」等；H，依照用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品類物質的世代毒性的方法對重金屬的持久性毒性進行評價，採用美國OriginLab公司推出的數據分析和製圖軟體Origin 7. 5以及滿足該軟體要求的電腦，對包括子一代F1、子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx等的毒性結果與秀麗線蟲母代Ptl的毒性結果進行比較並進行顯著性分析，具體實施步驟如下將 E、F、G步驟獲得的「飲食量抑制率(Ptl) 」、「飲食量抑制率(F1) 」、「飲食量抑制率(F2) 」、「飲食量抑制率(F3) 」的數據輸入Origin 7. 5數據列表，在statistics下打開anova的下拉按鈕中的one-way anova，從候選列表中將「飲食量抑制率(Ptl) 」與「飲食量抑制率(F1)"的數據選擇，並將「顯著性參數」設定為0.05，點擊「計算」，即可獲得飲食量抑制率(F1)與飲食量抑制率(Pq)的顯著性差異結果；若計算結果顯示為「At the 0. 051evel,thepopulation means are not significantly different. 」，即「二者在 0. 05 的水平下，不存在顯著性差異，，；若結果顯不為 「At the 0. 051evel, the population means aresignificantIy different. 」，即「二者在0. 05的水平下，存在顯著性差異」。然後再次在statistics下打開anova的下拉按鈕中的one-way anova,從候選列表中將「飲食量抑制率(I3tl)，，與「飲食量抑制率(ig，，的數據選擇，並將「顯著性參數」設定為0. 05，點擊「計算」，即可獲得飲食量抑制率(F2)與飲食量抑制率(Ptl)的顯著性差異結果；以此類推，獲得飲食量抑制率(F3)與飲食量抑制率(Ptl)的顯著性差異結果以及飲食量抑制率(F3)與飲食量抑制率(Ptl)的顯著性差異結果。若「飲食量抑制率」的比較結果包括"F1與P0」、「F2與P0」、「F3與P0」、「F4與 Po」，均未得到顯著差異的結果，則說明該重金屬對該指標不具有明確的持久性毒性；若"F1 與P0」、「F2與P0，，的比較結果為「不存在顯著性差異」，而"F3與P0」、「F4與P0，，的比較結果為「存在顯著性差異」，而且&、&表現出更為嚴重的毒物抑制效應，則說明該重金屬對該指標有延遲性的持久性毒性；若"F1與WF2與P。」的比較結果為「存在顯著性差異」，而"F3 與Po」、"F4與P/的比較結果為「不存在顯著性差異」，而且F3、F4表現出較為輕微的毒物抑制效應，則說明該重金屬對該指標具有可被秀麗線蟲修復或適應的毒性；若"F1與ΡΛ「Ρ2 與P。」、「F3與P0」、「F4與Ptl」的比較結果均為「存在顯著性差異」，而且"F2與F/，、「F3與F/，、"F4與F,的比較結果，"F3與Π與F2"的比較結果，"F4與F,的比較結果也都為「存在顯著性差異」，而且Pp F1, F2, F3, F4受到的毒物抑制效應也更加嚴重，則說明該重金屬對該指標具有明確的、不可修復的持久性毒性。 對其他的指標進行相同的顯著性差異分析，並對持久性毒性進行評價。綜合考慮各項指標對持久性毒性的評價結果，判斷受到該重金屬的持久性暴露後，秀麗線蟲所表現的毒性效應的先後順序，飲食首先受到影響、行為學活性進而受到影響，或者行為學活性首先受到影響、飲食繼而受到影響，或者其他順序，根據不同的毒性效應的先後順序，可以推斷該重金屬是通過飲食、體表或是其他途徑產生的毒性效應，為研究產生該持久性毒性的致毒機理提供方向。
權利要求
1.採用秀麗線蟲檢測可溶性重金屬持久性毒性的方法，包括A，依照急性毒性測試方法，以秀麗線蟲成蟲作為受試生物，測得該重金屬的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下設置3個重金屬濃度和1個空白對照，其特徵是B，利用無菌具刻度的15mL離心管，採用同步化方法獲得秀麗線蟲蟲卵，然後向15mL 離心管中加入IOmL無菌K-溶液，混勻，採用體視鏡觀察40 μ L該混合液的蟲卵數量，若蟲卵數量多於500枚，則向離心管中再加入2mL無菌K-溶液後再混勻、觀察；若蟲卵數量少於300枚，則靜置沉澱lOmin，去除2mL上清液後再混勻、觀察；直至將蟲卵濃度稀釋為每 40 μ L含有400枚蟲卵為止，此批蟲卵為第一批進行染毒的蟲卵，標記為卵液Ptl，待用；C，採用LB液體培養基在37°C、200rpm條件下將E. coli 0P50培養24h至48h，混勻後倒入已滅菌的15mL離心管中，4000rpm離心5min，棄上清液，保留沉於底部的菌體，加入SmL 無菌K-溶液混勻，以M孔板為容器、以酶聯免疫檢測儀為檢測儀器，測定每300 μ L該混合液在570nm處的吸光度，若吸光度值小於1. 1或大於1. 3，則將混合液重新離心，棄上清液， 保留沉於底部的菌體，加入6mL或IOmL無菌K-溶液混勻，再次測定混合液在570nm處的吸光度，通過減少或增加無菌-K溶液的體積將吸光度值調整至1. 1與1. 3之間，此時E. coli 0P50的總量為IO8至IO9個，該數量條件下的菌個數能夠為B步驟所得秀麗線蟲蟲卵的正常生長發育提供足夠的食物，標記為菌液，待用；D，採用無菌透明的M孔板進行染毒，先將C步驟獲得的菌液搖勻，向M孔板的每孔中加入300 μ L該菌液，將B步驟稀釋好的卵液搖勻，向M孔板的每孔中加入200 μ L該卵液， 將M孔板劃分為4行、6列，這些含有蟲卵的M孔，每行作為一組、4行共4組對應於A步驟確定的4個濃度梯度，對秀麗線蟲進行染毒；在M孔板的孔與孔之間加入ImL無菌K-溶液以減少染毒期間，蒸發對染毒體系的影響；可根據實際需要對所採用的M孔板的個數及相關布局進行調整；將M孔板置於20°C條件下培養並開始計時；E，在D步驟計時的後，從每行中隨機移取1孔中的秀麗線蟲用於測定相關指標，均標記為Ptl的各指標值；F，將M孔板中4個濃度梯度對應的混合液分別吸取到4個無菌的15mL離心管中，用 ImL無菌K-溶液衝洗M孔板每一孔中殘留的蟲體，並將衝洗液轉移至相應的離心管中，靜置沉澱15min，棄上清液保留沉澱，採用同步化方法，獲得4個濃度梯度對應的4組蟲卵，然後依照步驟B中的方法，以無菌K-溶液為稀釋液，將4個離心管中的蟲卵濃度分別稀釋為每40 μ L含有400枚蟲卵，此批蟲卵為母代的子一代蟲卵，標記為卵液F1，待用；重複步驟C 獲得菌液，按照與步驟A相同的受試濃度梯度、重複步驟D、Ε，獲得標記為F1的各指標值； G，重複步驟F，獲得子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx的各指標； H，依照E、F、G步驟中獲得的各代秀麗線蟲的指標值之間的顯著性差異分析結果，參照傳統方法將該可溶性重金屬的持久性毒性類別分為不具有明確的持久性毒性、有延遲性的持久性毒性、具有可被修復的毒性、具有明確並且不可修復的持久性毒性。
全文摘要
採用秀麗線蟲檢測可溶性重金屬持久性毒性的方法，涉及一種採用秀麗線蟲對可溶性重金屬進行涵蓋多個連續世代的持久性暴露，從而檢測該重金屬在長期、低濃度條件下的毒性效應的方法。本發明確定了無重金屬存在下、不影響蟲卵正常孵化的蟲卵起始濃度，以及能夠滿足其生長發育所需的食物起始濃度，在暴露時間、暴露劑量尤其是食物與重金屬共存等方面更加貼近實際環境暴露情形，不同世代之間相同指標的相互比較，獲得該重金屬在長期實際環境暴露情形下的毒性傳遞的強弱、傳遞的途徑等。本發明彌補了現有採用秀麗線蟲進行毒性測試方法的不足，具有明確的針對性，對模擬實際環境暴露情形下的毒性研究方法進行了補充和擴展。
文檔編號G01N33/48GK102183627SQ20111004576
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月25日 優先權日2011年2月25日
發明者于振洋, 尹大強, 張晶 申請人:同濟大學