一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法
2023-10-04 17:56:54
專利名稱：一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法
技術領域：
本發明涉及一種遺傳轉化體系的建立方法，尤其涉及一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，屬於農業生物技術領域或植物基因工程領域。
背景技術：
棗(Ziziphus jujube Mill)是鼠李科棗屬植物，我國是棗樹的起源地和栽培中心，種質資源非常豐富。棗是我國第七大果樹和第一大乾果，耐乾旱、耐瘠薄、耐鹽鹼、適應性強，在果樹的發展中起著重要的作用。冬棗是優良的晚熟鮮食棗品種，風味獨特，產量高，以其極優的品質，富含人體必需的營養物質而倍受消費者青睞，在果樹生產、銷售上具有重要價值。冬棗主產於山東霑化和河北的黃驊，山西、河南、北京、陝西、新疆等省區也有規模不等的引種。霑化冬棗是鮮食品質最好的冬棗品種之一，主產於我省渤海灣地區，適合在低度鹽地生長。隨著市場經濟的發展和果樹品種結構的調整優化，霑化冬棗以其獨特的品種特性，成為許多地區的首選品種，發展十分迅速。
然而，冬棗成熟期集中，貯藏期短，常溫下僅能保存6-7天，而且果實偏小、果核大、果皮薄、病害嚴重。若不能及時攻克這些難題，則會大大限制冬棗的發展，無法擴大栽培及銷售地域和大量進入國際市場。由於冬棗花小，去雄困難，落花落果較嚴重，胚容易退化，目前冬棗育種僅僅限于田間選育優良株系。此外，冬棗貯藏保鮮的研究始於90年代中期，先後從國外引進多套設備進行貯藏保鮮。但常規的速凍儲藏、氣調儲藏、減壓儲藏、輻射儲藏等方法，果實出庫後品質不佳，貨架期也只有3-5天。看來採用現有的貯藏保鮮和育種方法，很難較好地解決這些難題。
冬棗屬於高呼吸強度的非躍變型果實，ABA對其後熟及貯期衰老起著非常重要的作用，影響著棗果後熟過程中各類酶活性和果實貯藏物質的降解速率及硬度，是導致棗果變軟衰老的主要因素。因此通過反義基因技術組織特異性的降低ABA合成強度是延長棗果採收期和貯藏保鮮期的重要途徑。因而，利用植物基因工程技術是有效解決這些問題的首選，成功的基因轉化首先依賴於良好的植物受體系統的建立。
由於棗樹組織培養植株再生的難度較大，缺少合適的再生體系，與其他果樹遺傳轉化相比進展緩慢，迄今僅有幾例相關的研究報導。胡桂兵(2001)研究了4種抗生素對臺灣青棗幼嫩莖段和疏鬆的愈傷組織生長的影響，初步確定進行農桿菌介導的遺傳轉化中抑菌方法和轉化體的篩選方法。何業華等(2003，2004)以根瘤農桿菌介導法將ACC合成酶反義基因轉入棗嫩梢段和下胚軸，獲得了轉基因植株。相對於其它植物的遺傳轉化研究，棗的轉基因工作仍處在探索階段，對於利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，經檢索還未見報導。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法。
本發明以冬棗組培苗的莖尖為遺傳轉化受體，以農桿菌介導法將外源基因導入受體細胞，經選擇獲得轉化細胞及植株。在此基礎上，確立了適宜的農桿菌介導的遺傳轉化的農桿菌濃度、浸染時間、暗培養時間，以及減壓處理等參數，有效提高了轉化頻率，建立起一個高效的基因型制約小的冬棗遺傳轉化體系。
本發明所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，由以下步驟實現1)莖尖培養及誘導叢生芽再生，2)叢生芽的延伸培養，3)以莖尖為受體在抽真空施加負壓下進行遺傳轉化，4)小苗生根和移栽，5)轉基因植株分子檢測；其特徵在於步驟1)所述莖尖培養及誘導叢生芽再生是指冬棗休眠芽在25-27℃培養箱中水培萌發，萌發的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精預殺菌30s，0.1％的升汞消毒8-15min，無菌水衝洗3-4次，然後接種在附加0.5-2mg L-1赤黴素和0.1-1mg L-16-苄基嘌呤的MS誘導培養基上，在溫度25-27℃、光照強度3000-4000Lx、光照12h/天條件下培養，35天繼代一次；步驟2)所述的叢生芽的延伸培養是指將步驟1)再生的小芽接種在添加有1-3mg L-1赤黴素、0.1-0.5mg L-16-苄基嘌呤和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS延伸培養基上以步驟2)所述條件培養，之後切取冬棗莖尖，備用；步驟3)所述的以莖尖為受體在抽真空施加負壓下進行遺傳轉化是指取2-8mm的冬棗莖尖為受體(莖尖受體指十到幾十微米的莖尖分生組織(shoot meristem)和大到幾毫米的莖端(shoot tip)，而莖尖分生組織是指頂端生長錐及其鄰近的葉原基)，用解剖針均勻劃傷莖尖頂端分生組織，同時將帶有植物表達載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農桿菌製成OD600值為0.2-1.2的梯度菌液，然後將劃傷莖尖分別浸入梯度菌液中，浸染5-20mins，其間浸染環境附以真空度為0.95×105Pa-0.3×105Pa的負壓條件，以提高農桿菌的浸染效率；浸染結束後，用無菌濾紙將莖尖上剩餘菌液吸乾，轉至MS延伸培養基中，在20-21℃溫度條件下暗培養2-8天；暗培養結束後，將莖尖用無菌水洗2-3次，然後轉至含100mg L-1頭孢黴素MS延伸培養基上，抑菌培養7-14天，之後在含0.5-3mg L-1綠磺隆的MS延伸培養基上進行抗性篩選，連續篩選3-5代，每代7-10天；然後轉入含有1mg L-1赤黴素和0.5mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培養基上恢復培養；步驟4)所述的小苗生根和移栽是指將步驟3)所述恢復培養後存活的莖尖繼續培養，待長至株高為1.5-2cm後，轉入Nitsh生根培養基中生根，根生長至1.5-3cm後，移入砂與蛭石體積比為1∶1的基質中繼續生長；步驟5)轉基因植株分子檢測是指利用PCR、Southern blot、RT-PCR方法對轉基因植株檢測，根據是否有目的基因條帶，確定冬棗轉基因植株。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法中所述冬棗是指鼠李科棗屬植物晚熟的栽培品種(因在寒露節後成熟而得名，豐產穩產，適應性強，是鮮食優良棗品種)。
其中所述冬棗優選霑化冬棗。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法中所述帶有植物表達載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農桿菌優選LBA4404或AGLO。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法中所述升汞滅菌後的單芽莖段接種優選附加0.8-1.5mg L-1赤黴素和0.2-0.8mg L-16-苄基嘌呤的MS誘導培養基。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法中步驟3)所述農桿菌菌液優選是OD600值為0.4-1.0的梯度菌液，所述浸染時間優選8-10mins，所述暗培養時間優選4-6天。
不同農桿菌菌株其較佳的轉化參數有差異。如選用LBA4404時，當菌液濃度OD600值為0.6-0.8，較佳感染時間為8-10mins時，結果顯示莖尖在恢復培養中的存活率高，轉基因植株比例較高。
在述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法中步驟3)所述負壓條件優選0.8×105Pa-0.5×105Pa。
其中步驟3)所述負壓條件最優選0.6×105Pa-0.5×105Pa。
本發明中，培養基及植物生長調節物質熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅菌，在培養基滅菌後加入。
上述的MS基本培養基是指改良MS培養基(KNO31900mgL-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mgL-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，FeSO4·7H2O 27.8mgL-1，ZnSO4·7H2O 10mgL-1，MnSO4·4H2O 22.3mgL-1，H3BO310mgL-1，KI 0.83mgL-1，Na2MoO4·2 H2O 0.5mgL-1，CuSO4·5H2O 0.025mgL-1，CoCl2·6H2O 0.025mgL-1，鹽酸硫胺素10.0mgL-1，鹽酸吡哆醇1.0mgL-1，煙酸1.0mgL-1，甘氨酸2.0mgL-1，肌醇100.0mgL-1，生物素0.05mgL-1，酪蛋白水解物500mgL-1)，蔗糖30gL-1，瓊脂粉6.5gL-1，pH5.8-6.0。
上述MS誘導培養基是指添加有0.5-2mgL-1赤黴素(GA3)、0.1-1mgL-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mgL-1酪蛋白水解物的MS固體培養基；上述MS延伸培養基是指添加有1-3mgL-1赤黴素(GA3)、0.1-0.5mgL-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mgL-1酪蛋白水解物的MS固體培養基；液體培養基則去掉瓊脂粉。
上述Nitsh生根培養基是指添加有0.1-0.5mgL-1吲哚乙酸(IAA)，0.2-1mgL-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養基；上述的農桿菌菌株為分子生物學領域常用菌株，可購自上海坤肯生物化工有限公司，在劉君等(CMO與BADH雙基因表達載體構建及在菸草中的表達，中國生物工程雜誌，2006，26(8)5-9)和王先豔等(植物表達載體構建和轉基因菸草抗除草劑及耐鹽性的分析，農業生物技術學報，2003，11(6)554-560)研究中有應用的報導。本發明試驗中採用的載體構建根據王先豔等(植物表達載體構建和轉基因菸草抗除草劑及耐鹽性的分析，農業生物技術學報，2003，11(6)554-560)的報導及美國冷泉港實驗室出版的《分子克隆實驗指南》(科學出版社，2003)的相關方法進行。
利用本發明建立冬棗遺傳轉化體系的方法能獲得大量的具有很強植株再生能力的冬棗莖尖，再生植株體細胞無性系變異小，轉基因植株多數生長發育正常。
本發明的特點在於1)大幅度減少基因型障礙，2)培養的莖尖轉化頻率較高，3)取材不受季節限制，4)轉基因植株絕大多數保持原基因型的優良特性。
圖1農桿菌菌液濃度對冬棗莖尖遺傳轉化率影響的折線圖其中a，b，c，d代表農桿菌菌液濃度對冬棗莖尖遺傳轉化率的差異顯著性分析標示，相同字母表示在P＝0.05水平上差異不顯著，不同字母表示在P＝0.05水平上差異顯著。
圖2農桿菌浸染時間對冬棗莖尖遺傳轉化率影響的折線圖其中a，b代表農桿菌菌液濃度對冬棗莖尖遺傳轉化率的差異顯著性分析標示，相同字母表示在P＝0.05水平上差異不顯著，不同字母表示在P＝0.05水平上差異顯著。
圖3冬棗轉化植株betA基因的PCR檢測圖具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明實施例1叢生芽的誘導和繼代培養冬棗休眠芽在25-27℃培養箱中水培萌發，萌發的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精預殺菌30s，0.1％的升汞消毒12-15min，無菌水衝洗3次，然後接種在附加0.5mgL-1、1mgL-1、2mgL-1赤黴素和0.1mgL-1、0.5mgL-1、1mgL-16-苄基嘌呤的MS誘導培養基上。在溫度25-27℃、光照強度3000-4000Lx、光照12h/天條件下培養，35天繼代一次；篩選劑濃度的確定將除草劑綠黃隆(瀋陽農藥廠生產，有效成分25％)水溶液過濾滅菌後，加入(培養基溫度低於50℃時)去掉酪蛋白水解物的MS誘導培養基中。綠黃隆濃度分別為0，0.5mgL-1、1mgL-1、1.5mgL-1、2mgL-1、2.5mgL-1、3mgL-17個濃度。將誘導產生的冬棗莖尖接種在含有上述濃度綠黃隆的MS延伸培養基上培養，每10天繼代培養一次，連續篩選三代。根據篩選後冬棗莖尖的存活率，確定冬棗遺傳轉化過程中抗性篩選適宜的綠黃隆濃度為2mgL-1。
農桿菌介導的遺傳轉化將帶有植物表達載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農桿菌(如LBA4404)取單克隆，接種到含有50mg L-1利福平和50mgL-1卡那黴素的YEP液體培養基(酵母提取物10gL-1，蛋白腖10gL-1，NaCl 5gL-1，pH7.0)中，於28℃，180-190r/min振蕩培養。菌液濃度達到1.2(OD600)時以4000rpm離心15min，倒掉上清液，細菌沉澱用液體MS延伸培養基重懸，浸染前向此細菌懸液加入100μm的乙醯丁香酮(acetosyringone，AS)。
為研究農桿菌菌液濃度對冬棗遺傳轉化率的影響，將延伸培養基上培養7天的冬棗莖尖作為遺傳轉化受體，剝去莖端的幼葉，用解剖針均勻劃傷莖尖頂端分生組織，同時將帶有植物表達載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農桿菌分別製成OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2的梯度菌液，然後將劃傷莖尖分別浸入不同OD600值菌液中，浸染10min。浸染結束後，用無菌濾紙將莖尖上剩餘菌液吸乾，轉至MS延伸培養基中，在20-21℃溫度條件下暗培養4天。暗培養結束後，將莖尖用無菌水洗2-3次，然後轉至含100mgL-1頭孢黴素MS延伸培養基上，抑菌培養7天，之後在含2mg L-1綠磺隆的MS延伸培養基上進行抗性篩選，連續篩選3代，每代7天；然後轉入含有1mgL-1赤黴素和0.3mgL-16-苄基嘌呤的MS延伸培養基上恢復培養(見圖1)。
為研究農桿菌浸染時間對冬棗遺傳轉化率的影響，用OD600值為0.8的農桿菌菌液分別浸染處理好的冬棗莖尖5mins、10mins、15mins、20mins，浸染結束後，用無菌濾紙將莖尖上剩餘菌液吸乾，轉至MS延伸培養基中，在20-21℃溫度條件下暗培養4天。暗培養結束後，將莖尖用無菌水洗2-3次，然後轉至含100mg L-1頭孢黴素MS延伸培養基上，抑菌培養7天，之後在含2mg L-1綠磺隆的MS延伸培養基上進行抗性篩選，連續篩選3代，每代7天；然後轉入含有1mg L-1赤黴素和0.3mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培養基上恢復培養(見圖2)。
為研究農桿菌浸染後暗培養時間對冬棗遺傳轉化率的影響，用OD600為0.8的農桿菌菌液浸染處理好的冬棗莖尖10mins，浸染結束後，用無菌濾紙將莖尖上剩餘菌液吸乾，轉至MS延伸培養基中，在20-21℃溫度條件分別暗培養2天，4天，6天，暗培養結束後，將莖尖用無菌水洗2-3次，然後轉至含100mg L-1頭孢黴素延伸培養基上，抑菌培養7天，之後在含2mg L-1綠磺隆的MS延伸培養基上進行抗性篩選，連續篩選3代，每代7天；然後轉入含有1mg L-1赤黴素和0.3mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培養基上恢復培養。
為研究農桿菌浸染環境附以的負壓條件對冬棗遺傳轉化率的影響，用OD600值為0.8的農桿菌菌液浸染處理好的冬棗莖尖10mins，在浸染過程中輔以0.95×105Pa，0.5×105Pa，0.3×105Pa的負壓處理。浸染結束後，用無菌濾紙將莖尖上剩餘菌液吸乾，轉至MS延伸培養基中，在20-21℃溫度條件下暗培養4天；暗培養結束後，將幼芽用無菌水洗2-3次，然後轉至含100mg L-1頭孢黴素MS延伸培養基上，抑菌培養7天，之後在含2mg L-1綠磺隆的MS延伸培養基上進行抗性篩選，連續篩選3代，每代7天；然後轉入含有1mg L-1赤黴素和0.3mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培養基上恢復培養。
上述不同處理恢復培養的冬棗莖尖長至1.5-2cm高后轉至生根培養基生根，根生長至1.5-3cm後，移入砂與蛭石體積比為1∶1的基質中繼續生長，開始一周用封口膜將容器口封好保持溼度。每隔3天澆適量的1/2MS營養液，環境溫度控制在25℃，相對溼度60-70％。上述環境條件下生長15-20天後移至土壤中，室外條件下生長。移栽成活的小苗取幼嫩葉片用於分子生物學檢測。經PCR等檢測(引物1CGCTACAGGGTAAAC GCTACA AC，引物2CCTCACGGCTGCGAATAAATCC)，較佳的農桿菌菌液濃度為0.8(OD600)，較佳的農桿菌浸染時間為10mins，較佳的農桿菌浸染後暗培養時間為4天，較佳的負壓條件為0.5×105Pa，冬棗遺傳轉化率較高的可達4.3％～5.2％(見圖3)。
本發明中轉化率為產生轉基因植株數/農桿菌感染的莖尖數×100％。
上述的MS基本培養基為改良MS培養基(KNO31900mg L-1，NH4NO31650mg L-1，CaCl2·2H2O 440mg L-1，MgSO4·7H2O 370mg L-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，FeSO4·7H2O 27.8mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2 H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，鹽酸硫胺素10.0mg L-1，鹽酸吡哆醇1.0mg L-1，煙酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，酪蛋白水解物500mg L-1)，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6.5g L-1，pH5.8-6.0。
上述誘導培養基是指添加有1.5mg L-1赤黴素(GA3)、0.5mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養基；液體培養基則去掉瓊脂粉。
上述延伸培養基是指添加有2mg L-1赤黴素(GA3)、0.2mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養基；液體培養基則去掉瓊脂粉。
上述生根培養基是指添加有0.3mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.2mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養基；實施例2叢生芽的誘導和繼代培養冬棗休眠芽在25-27℃培養箱中水培萌發，萌發的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精預殺菌30s，0.1％的升汞消毒8-10min，無菌水衝洗4次，然後接種在附加1.5mg L-1GA3和0.2mg L-16-苄基嘌呤的MS誘導培養基上，在溫度25-27℃、光照強度3000-4000Lx、光照12h/天條件下培養，35天繼代一次；農桿菌介導的遺傳轉化將帶有植物表達載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農桿菌(如LBA4404)取單克隆，接種到含有50mg L-1利福平和50mg L-1卡那黴素的YEP液體培養基(酵母提取物10g L-1，蛋白腖10g L-1，NaCl 5g L-1，pH7.0)中，於28℃，180-190r/min振蕩培養。菌液濃度達到0.8(OD600)時以4000rpm離心15min，倒掉上清液，細菌沉澱用液體MS延伸培養基重懸，浸染前向此細菌懸液加入100μm的乙醯丁香酮(acetosyringone，AS)。
在繼代培養基上培養7天的冬棗幼芽作為浸染用外植體，剝去莖端的幼葉，用解剖針均勻劃傷莖尖頂端分生組織。處理後的冬棗莖尖在OD600值為0.8的農桿菌懸浮液中浸染10mins，並附以0.5×105Pa的負壓環境。浸染結束後，用無菌濾紙將莖尖上剩餘菌液吸乾，轉至MS延伸培養基中，在20-21℃溫度條件下暗培養4天。之後在含有100mg L-1頭孢黴素的莖延伸培養基中抑菌7天，然後在含有2mg/L綠黃隆的MS延伸培養基中篩選3代，每代7天。篩選後存活的幼芽進行恢復培養，長至1.5-2cm高后轉至生根培養基。生根後，移入砂與蛭石體積比為1∶1的基質中繼續生長，開始一周用封口膜將容器口封好保持溼度。每隔3天澆適量的1/2MS營養液，環境溫度控制在25℃，相對溼度60-70％。上述環境條件下生長15-20天後移至土壤中，室外條件下生長。移栽成活的小苗取幼嫩葉片用於分子生物學檢測。經PCR等分子方法檢測(引物1CGCTACAGGGTAAAC GCTACAAC，引物2CCTCACGGCTGCGAATAAATCC)，冬棗遺傳轉化率為可達5.2％。
實施例3基本方法如實施例2，其中農桿菌菌液濃度為0.2(OD600)，浸染10min，負壓條件0.95×105Pa。暗培養4d後在含有100mg L-1頭孢黴素的MS延伸培養基中抑菌7天，然後在含有2mg L-1綠黃隆的MS延伸培養基中篩選3代，每代7天。移栽成活的小苗取葉片用於分子生物學檢測。經PCR等分子方法檢測，冬棗遺傳轉化率為0.6％左右。
實施例4基本方法如實施例2，其中農桿菌菌液濃度為1.2(OD600)，浸染10mins，負壓條件0.80×105Pa。暗培養4d後在含有100mg L-1頭孢黴素的MS延伸培養基中抑菌7天，然後在含有2mg L-1綠黃隆的MS延伸培養基中篩選3代，每代7天。移栽成活的小苗取葉片用於分子生物學檢測。經PCR等分子方法檢測，冬棗遺傳轉化率為1％左右。
實施例5基本方法如實施例2，其中農桿菌菌液濃度為0.8(OD600)，浸染15mins，負壓條件0.85×105Pa。暗培養6d後在含有100mg L-1頭孢黴素的MS延伸培養基中抑菌7天，然後在含有2mg L-1綠黃隆的MS延伸培養基中篩選3代，每代7天。移栽成活的小苗取葉片用於分子生物學檢測。經PCR等分子方法檢測，冬棗遺傳轉化率為2.2％左右。
實施例6基本方法如實施例2，其中農桿菌菌液濃度為1.2(OD600)，浸染5mins，負壓條件0.3×105Pa。暗培養2d後在含有100mg L-1頭孢黴素的MS延伸培養基中抑菌7天，然後在含有2mg L-1綠黃隆的MS延伸培養基中篩選3代，每代7天。移栽成活的小苗取葉片用於分子生物學檢測。經PCR等分子方法檢測，冬棗遺傳轉化率為2.1％左右。
權利要求
1.一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，由以下步驟實現1)莖尖培養及誘導叢生芽再生，2)叢生芽的延伸培養，3)以莖尖為受體在抽真空施加負壓下進行遺傳轉化，4)小苗生根和移栽，5)轉基因植株分子檢測；其特徵在於步驟1)所述莖尖培養及誘導叢生芽再生是指冬棗休眠芽在25-27℃培養箱中水培萌發，萌發的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精預殺菌30s，0.1％的升汞消毒8-15min，無菌水衝洗3-4次後，接種在附加0.5-2mg L-1赤黴素和0.1-1mg L-16-苄基嘌呤的MS誘導培養基上，在溫度25-27℃、光照強度3000-4000 Lx、光照12h/天條件下培養，35天繼代一次；步驟2)所述的叢生芽的延伸培養是指將步驟1)再生的小芽接種在添加有1-3mg L-1赤黴素、0.1-0.5mg L-16-苄基嘌呤和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS延伸培養基上以步驟2)所述條件培養，之後切取冬棗莖尖，備用；步驟3)所述的以莖尖為受體在抽真空施加負壓下進行遺傳轉化是指取2-8mm的冬棗莖尖為受體，用解剖針均勻劃傷莖尖頂端分生組織，同時將帶有植物表達載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農桿菌製成OD600值為0.2-1.2的梯度菌液，然後將劃傷莖尖分別浸入梯度菌液中，浸染5-20mins，其間浸染環境附以真空度為0.95×105Pa-0.3×105Pa的負壓條件，以提高農桿菌的浸染效率；浸染結束後，用無菌濾紙將莖尖上剩餘菌液吸乾，轉至MS延伸培養基中，在20-21℃溫度條件下暗培養2-8天；暗培養結束後，將莖尖用無菌水洗2-3次，然後轉至含100mg L-1頭孢黴素MS延伸培養基上，抑菌培養7-14天，之後在含0.5-3mg L-1綠磺隆的MS延伸培養基上進行抗性篩選，連續篩選3-5代，每代7-10天；然後轉入含有1mg L-1赤黴素和0.3mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培養基上恢復培養；步驟4)所述的小苗生根和移栽是指將步驟3)所述恢復培養後存活的莖尖繼續培養，待長至株高為1.5-2cm後，轉入Nitsh生根培養基中生根，根生長至1.5-3cm後，移入砂與蛭石體積比為1∶1的基質中繼續生長；步驟5)轉基因植株分子檢測是指利用PCR、Southern blot、RT-PCR方法對轉基因植株檢測，根據是否有目的基因條帶，確定冬棗轉基因植株。
2.按照權利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，其特徵在於所述冬棗是指鼠李科棗屬植物晚熟的栽培品種。
3.按照權利要求2所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，其特徵在於所述冬棗是霑化冬棗。
4.按照權利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，其特徵在於所述帶有植物表達載體pCAMBIA1300-als-bet4的根瘤農桿菌是LBA4404或AGL0。
5.如權利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，其特徵在於所述升汞滅菌後的單芽莖段接種在附加0.8-1.5mg L-1赤黴素和0.2-0.8mg L-16-苄基嘌呤的MS誘導培養基上。
6.按照權利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，其特徵在於步驟3)所述農桿菌菌液是OD600值為0.4-1.0的梯度菌液，所述浸染時間為8-10mins，所述暗培養時間為4-6天。
7.按照權利要求1所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，其特徵在於步驟3)所述負壓條件是0.8×105Pa-0.5×105Pa。
8.按照權利要求7所述利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，其特徵在於步驟3)所述負壓條件是0.6×105Pa-0.5×105Pa。
全文摘要
本發明公開一種利用莖尖為受體建立冬棗遺傳轉化體系的方法，主要步驟包括以冬棗休眠芽水培萌發的幼嫩枝條為材料，離體培養誘導莖尖叢生芽的再生，切取莖尖在延伸培養上生長，以莖尖為受體採用農桿菌介導法在抽真空施加負壓下進行遺傳轉化，獲得冬棗轉基因植株。本發明方法中，浸染環境附以真空度為0.95×10
文檔編號C12N15/82GK101016544SQ200710013249
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月19日 優先權日2007年1月19日
發明者谷曉峰, 張舉仁, 楊愛芳, 張可煒, 尹小燕 申請人:山東大學