用於選擇遺傳轉化細胞的方法

2023-10-04 18:12:59

專利名稱：用於選擇遺傳轉化細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於選擇遺傳轉化細胞的方法。
已知通過轉化手段將遺傳物質引入細胞群體時，只有一定數目的細胞被成功轉化。轉化後，必須對被轉化細胞進行鑑定並從被轉化的和未被轉化的細胞群體中選擇出轉化細胞。出於此目的，除了所需要的轉基因外，通常還向細胞中引入一個選擇基因。這裡的選擇基因編碼例如一種特性，利用這種特性可以對遺傳轉化細胞進行鑑定。這種選擇基因的實例是例如編碼針對抗生素或除草劑的抗性的基因。轉化後，使被轉化的和未被轉化的細胞群體與對未被轉化的(「野生型」)細胞具有毒性的抗生素或除草劑接觸，這樣就只有轉化細胞由於存在被引入的選擇基因而能存活下來並生長。
然而這種編碼抗生素或除草劑抗性的選擇基因的使用對被大規模引入環境中的轉基因農作物通常不理想，尤其對食品農作物不理想。這種選擇機制的另一個缺點是例如未被轉化的通常會相繼死掉，此外當細胞群體是粘在一起的細胞組織或整個有機體時，被轉化細胞也可能會因例如由死亡的非轉化細胞分泌的有害化合物而死亡。
本發明的目的是提供一種用於從被轉化的和未被轉化的細胞群體中選擇轉化細胞的方法，其克服了上述缺陷。
本發明通過提供包括以下步驟的方法實現了該目的a)將至少一種目的核苷酸序列和至少一種選擇-核苷酸序列引入細胞當中，從而獲得一種遺傳轉化細胞，其中所述選擇-核苷酸序列含有編碼參與海藻糖代謝的蛋白的區域；b)使含有被轉化的和未被轉化的細胞的群體與海藻糖和/或其衍生物接觸；和c)基於轉化細胞能夠代謝海藻糖和/或衍生物的能力，從所述群體中選擇出轉化細胞。
海藻糖是由多種生物體產生的葡萄糖的het α-1，1-二糖，所述生物體包括細菌、酵母菌和真菌以及若干高等植物。它是昆蟲體內最重要的血糖。由於海藻糖能夠提供保護對抗蛋白質變性和膜損傷，所以海藻糖愈來愈多地被特別用於疫苗的製備以及器官移植方案。
細胞特別是植物細胞通常不能在其中存在增高濃度的海藻糖而不存在另一種可代謝碳源的培養基中生長。在本發明的方法中，利用這一點來選擇轉化細胞。出於此目的，除了利用目的基因外，還用選擇-核苷酸序列對細胞進行轉化，其中所述選擇-核苷酸序列含有編碼參與海藻糖代謝的蛋白的區域。然後例如通過向培養基中添加海藻糖和/或其衍生物，使被轉化的和未被轉化的細胞群體與海藻糖和/或其衍生物接觸。因此轉化細胞區別於未被轉化的細胞，不僅在於含有相關的引入的轉基因而且還在其基因組中存在有編碼能夠代謝海藻糖的蛋白的核苷酸序列。轉化細胞因而能夠在具有海藻糖和/或海藻糖的衍生物的培養基中生存，而未被轉化的細胞則不能進一步生長發育。因此基於轉化細胞能夠代謝海藻糖和/或衍生物的能力，能夠以這種方式將轉化細胞從總細胞群體中選擇出來。
本文中的術語「參與海藻糖代謝的蛋白」是指能夠分解海藻糖和/或其衍生物從而降低海藻糖和/或其衍生物濃度的一種蛋白，例如一種酶。
術語「海藻糖的衍生物」是指經修飾形式的海藻糖，這種經修飾形式的海藻糖如甲基化形式的或滷化形式的海藻糖也可以被相關蛋白所代謝並且可以在細胞內誘導與海藻糖同樣的反應。
在本發明方法的一個優選實施方案中，被引入的選擇-核苷酸序列含有一個編碼具有海藻糖酶活性的胞內蛋白的區域，所述蛋白即能夠將胞內海藻糖和/或其衍生物水解成葡萄糖的酶。由於轉化細胞中存在這種蛋白，而未被轉化的細胞中不存在這種蛋白，所以只有轉化細胞能夠分解進入細胞的海藻糖和/或衍生物。轉化細胞中的胞內海藻糖濃度因而被降低，而被釋放出來的葡萄糖還能被轉化細胞當作額外營養源來利用。
多種細胞，尤其是高等植物細胞，諸如大豆(Glycine max.)和鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，在其基因組中含有編碼內源性海藻糖酶的基因(Aeschbacher R.A.等人，Plant Physiol.119(2)489-496，1999；Mueller等，Plant Physiol.125(2)1086-1093，2001)。然而，這些內源性海藻糖酶基因通常編碼一種胞外海藻糖酶，該酶在細胞內不具有活性。可以利用常規的分子生物學技術對這種內源性基因進行修飾。在本發明方法的一個優選實施方案中，選擇-核苷酸序列因而含有一個經修飾的內源性海藻糖酶基因，該基因編碼在胞內有活性的海藻糖酶。在此內源性海藻糖酶基因被改造成使表達的海藻糖在胞內有活性，例如通過缺失或誘變使蛋白-分泌信號失活、改變蛋白靶向序列或酶活性位點的pH敏感性。
在本發明方法的一個特別合適的實施方案中，被引入的選擇-核苷酸序列含有得自大腸桿菌(E.coli)的TreF基因(Horlacher R.等，J.Bacteriol.178(1)6250-6257，1996)。利用常規的分子生物學技術很容易將該基因分離出來並引入不同的細胞當中。
在本發明的另一個有利的實施方案中，選擇-核苷酸序列含有得自鼠耳芥屬的AtTRE1基因(Locus At4G24040，AGI no.2134960)。
本發明的方法優選地在步驟b)之前或過程中進一步包括使細胞群體與至少一種內源性胞外海藻糖酶的抑制劑進行接觸的步驟。對可能存在的內源性胞外海藻糖酶的抑制防止了培養基中的海藻糖在胞外被部分或全部分解從而使得非轉化的細胞也能夠進一步生長發育。
用於本發明方法的合適抑制劑的實例是suidatestrin和一種修飾形式的擬-低聚糖抗生素有效黴素(Asano N.等，J.Antibiot.40(4)526-532，1987；Goddijn O.J.等，Plant Physiol.113(1)181-190，1997；Knuesel I.等，Comp.Biochem.Physiol.B.Biochem.Mol.Biol.120(4)639-646，1998)。有效黴素在本發明中必須經過修飾以使其不能再進入細胞。然而抑制內源性胞外海藻糖酶活性而且又不被攝取到細胞之中的其它化合物也能被用於本發明。
本發明的術語「細胞群體」被理解為指根據本發明一群個體細胞以及組織和器官或其部分的細胞；或整個生物體如植物體中的細胞，其中所述整個植物體或其部分可由遺傳轉化細胞組成。
本發明的方法優選地被用於選擇基因修飾的植物細胞。例如鼠耳芥的幼苗不能在含有增加濃度的海藻糖的培養基上進一步生長發育。儘管種子會發芽，擴展根系的形成以及第一片葉子階段的發育受到存在海藻糖的抑制。由於引入了選擇-核苷酸序列，遺傳轉化植物能夠表達海藻糖酶，特別是在細胞質中，因此進入細胞中的海藻糖可被分解成葡萄糖。所述葡萄糖接著可被用作植物的營養源。遺傳轉化植物因而繼續生長發育，而非轉化的植物的發育出現滯後。當本發明的方法被用於選擇植物中的遺傳轉化細胞時，通過視覺能輕易地將轉化植物識別出來。
因此本發明的方法提供了一種用於轉化細胞、特別是用於遺傳轉化植物的簡便而環保的選擇系統。海藻糖是一種簡單化合物，該化合物的生產成本較低並且還發現對於人類和動物是無毒性的。因此人類長期以來將大量的海藻糖應用於酵母發酵產品如麵包和啤酒中，並且由於在腸道菌群中存在著產生海藻糖的微生物，所以人類和動物與海藻糖一直保持著接觸。
根據本發明，任何編碼具有海藻糖酶活性的蛋白的核苷酸序列可以被用作遺傳轉化細胞中的選擇-核苷酸序列。例如可以利用外源性海藻糖酶基因，例如來源於細菌如大腸桿菌的外源性海藻糖酶基因，但是也可以使用內源性海藻糖酶基因，其中所述內源性海藻糖酶基因被修飾成能夠編碼修飾形式的內源性海藻糖酶，例如編碼通常只具有胞外活性的海藻糖酶的胞內形式。利用這種內源性海藻糖酶基因的優勢在於細胞當中沒有引入額外的外來遺傳物質。
可以將所需的轉基因和選擇-核苷酸序列利用常規的分子生物學技術引入用於轉化的細胞當中。儘管不是必需的，但是在此可以將轉基因和選擇基因彼此連接起來以使得選擇基因的存在總能表示轉基因也存在。所述轉基因和選擇基因可任選地組成同一遺傳構建體的一部分並且通過相同的載體被引入細胞。為了確保選擇-核苷酸序列在轉化細胞當中進行表達，這種遺傳構建體還將進一步含有調節序列如組成型或調節型啟動子。
本發明的方法可以以特別合適的方式被用來選擇轉基因植物。可適用於本發明方法的植物實例是例如玉米(玉蜀黍(Zea mays L.))、小麥(普通小麥(Triticum aestiym L.))、大麥(大麥(Hordeum vulgare L.))、稻子(稻(Oryza sativa L.))、大豆(菜豆(Phaseolus vulgaris L.))、甜菜(甜菜(Beta vulgaris L.))、菊苣(菊苣(Cichorum intybus L.))、油菜籽(歐洲油菜(Brassica napus L.))、甘蔗(甘蔗(Saccharum officinarum L.))、甜薯(甘薯(Diocorea esculenta L.))、樹薯(木薯(Manihot esculenta L.))、馬鈴薯(馬鈴薯(Solanum tuberosum L.))、番茄(番茄(Lycopersiconesculentum L.))和禾本科植物(例如黑麥草屬、早熟禾屬和羊茅屬)。
本發明進一步涉及利用本發明的方法選擇出的轉化細胞，特別是植物細胞，和由其再生的植物及其種子和子代。
參照所附的實施例和附圖對本發明進行進一步的說明。


圖1顯示兩個不同的鼠耳芥accession對海藻糖的敏感性。A在有100mM甘露醇存在的條件下培養的種子(對照)；B在有100mM海藻糖存在的條件下培養的種子。
圖2顯示用於胞質表達大腸桿菌海藻糖酶基因的不同構建體。
圖3顯示被轉化的和未被轉化的鼠耳芥Col.O幼苗在有100mM海藻糖存在條件下的培養物。
圖4顯示來源於大腸桿菌的TreF基因的核苷酸序列。
圖5顯示鼠耳芥AtTre1的mRNA序列。
圖6顯示來源於大豆的GMTre1的mRNA序列。
實施例實施例1鼠耳芥Col.O和La-er的幼苗對海藻糖的敏感性在Eppendorf管中利用Clough和Bent(1998)的氣相方案對種子進行滅菌(Clough S.J.，Bent A.F.，Plant J.16(6)735-743，1998)。然後將已滅菌的種子重新懸浮在無菌水中並排列在0.8％w/v的瓊脂培養基上，該培養基含半強度的Murashigue和Skoog培養基(MS培養基；Murashigue T，Skoog F，Physiol.Plant.15473-497，1977)、維生素和MES緩衝液(pH5.7)，同時補充添加了終濃度為100mM的甘露醇或海藻糖。
如圖1所示，在有100mM甘露醇存在條件下培養的種子長成根系擴展的植物，而觀察到在有100mM海藻糖存在條件下培養的植物生長發育程度較低。這裡的圖1A顯示在有100mM甘露醇存在條件下培養的種子(對照)以及圖1B顯示在有100mM海藻糖存在條件下培養的種子。上一排的植物是鼠耳芥Landsberg erecta(La-er)，下一排的植物是鼠耳芥Colombia(Col.O)。
實施例2以大腸桿菌胞質海藻糖酶基因(TreF)作為選擇基因的表達載體利用PCR-引物Tre1d(CTC TGC AGA TGC TCA ATC AGA AAATTC AAA ACC)和Tre1u(TGC ACT GCA GTT ATG GTT CGC CGTACA AAC CAA)由大腸桿菌的基因組DNA擴增TreF。然後將擴增的TreF克隆到pGEMT載體(Promega，US)中。TreF基因被進一步修飾以利用PCR引物TRe2d(AGC ACT GCA GCC ATG GCT TTG GTTACC CTC AAT CAG AAA ATT CAA AAC CCT)和Tremyc(TTA CAGATC TTC TTC AGA AAT AAG TTT TTG TTC TGG TTC GCC GTACAA ACC AAT TAA)在蛋白質的C-末端引入myc-標記物，並再次被克隆到pGEMT中以用於序列證實。得到的修飾TreF序列利用Pst1限制酶進行酶切並被引入A.pCAMBIA2201(CAMBIA，澳大利亞)。TreF片段的外端經鈍化並將該片段連接到經Nco1和BstEII消化和鈍化的pCAMBIA220質粒中。
B.pCambia 2380的Pst1位點；為了這一目的，將鼠耳芥的遍在蛋白10啟動子作為鈍化的Xhol-Spe 1片段加到pCambia 2380-TreF的鈍化HindIII位點。
C.pACN質粒的Pst1位點(Zeneca，Caddick M.X.等，Nat.Biotechnol.16(2)177-180，1998)。然後將得到的構建體用HindIII進行消化，其中釋放出片段，其上具有雜合AlcA/minimal 35S啟動子，後面連接著TreF序列和Nos PolyA終止子。將該片段插入到SRN二元載體(Zeneca)的HindIII位點，從而獲得了所示的構建體。
圖2顯示所獲得的構建體。LB左T-DNA邊界；RB右T-DNA邊界；treF編碼胞質海藻糖酶的大腸桿菌基因；NptII新黴素磷酸轉移酶基因II；AlcR編碼醇誘導系統的調節子的基因；CaMV35S花椰菜花葉病毒35S啟動子；Ubi10鼠耳芥的遍在蛋白10基因的啟動子；AlcA/35S與CaMV35S啟動子融合的對乙醇誘導起反應的AlcA啟動子元件。
實施例3轉基因鼠耳芥幼苗的選擇通過「floral dip」方案(Clough和Bent，上文)，採用帶有實施例2C中所記載的二元質粒的農桿菌對鼠耳芥Col.O植物進行轉化。將獲得的幹種子滅菌，然後播種到0.8％w/v的固體瓊脂培養基上，該培養基中含有半強度的MS-鹽(1/2 MS-鹽)，維生素和MES緩衝液pH5.7，並且添加了終濃度為100mM的海藻糖。在4℃下將平皿培養3天(分層)，然後蓋內滴加一滴乙醇並將平皿轉移到22℃下。
圖3顯示12天後獲得的幼苗。被轉化的抗性幼苗是綠色的，具有很長的根和初生葉。而另一方面未被轉化的敏感幼苗積聚花色素苷，沒有長出初生葉而且根不長於3mm。在潮溼條件下，子葉變淡。
在約4000株播種植物中，鑑定出24株抗性幼苗。這表明轉化頻率與利用其它選擇系統獲得的轉化頻率相當。將12株幼苗轉移到黑土中並且長成不能區別於非轉化野生型植物的植物。
實施例4編碼海藻糖酶的選擇基因在鼠耳芥轉基因系中的穩定表達在獨立的鼠耳芥轉基因系中利用連接到本發明的選擇基因的常規卡那黴素選擇基因對編碼海藻糖酶的選擇基因的表達穩定性進行測試。
將從實施例3中的10株自花授粉的T1植物獲得的T2種子滅菌並播種在0.8％的固體瓊脂培養基上，所述培養基中含有1/2MS-鹽並添加了1％w/v的蔗糖和25mg/l的卡那黴素，在4℃下培養3天，轉移到22℃下並以16小時光照/8小時黑暗這樣的周期培養12天。發芽率為100％。
卡那黴素敏感幼苗發芽但具有發白的子葉，沒有根發育而且沒有初生葉期。卡那黴素抗性幼苗是綠色的，長出初生葉和根。
如表1所示，T1植物的轉基因構建體總是傳到T2代。表1顯示在每個測試系中對卡那黴素具有抗性的幼苗數目。
鼠耳芥通過自體受精來產生種子並且是二倍體植物。當T1代植物在其基因組中具有至少一個穩定的轉基因時，T2代將由至少3/4的抗性植物和最多1/4的敏感植物組成。當轉基因未以穩定的方式被插入T1植物的基因組時，在T2代中將不會發現轉基因。表1顯示通過對T2代進行卡那黴素選擇，在每個T1系中可發現具有轉基因的T2幼苗。
表權利要求
1.用於從細胞群體中選擇遺傳轉化細胞的方法，包括a)將至少一種目的核苷酸序列和至少一種選擇-核苷酸序列引入細胞當中，以獲得遺傳轉化細胞，其中所述選擇-核苷酸序列含有編碼參與海藻糖代謝的蛋白的區域；b)使具有被轉化的和未被轉化的細胞的群體與海藻糖和/或其衍生物接觸；和c)基於轉化細胞能夠代謝海藻糖和/或衍生物的能力，從所述群體中選擇出轉化細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有編碼具有海藻糖酶活性的胞內蛋白的區域。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有編碼在胞內有活性的海藻糖酶的經修飾的內源性海藻糖酶基因。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有源自大腸桿菌的TreF基因。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有源自鼠耳芥的AtTRE1基因。
6.如權利要求1至5中的任一項所述的方法，其特徵在於所述方法還進一步包括在步驟b)之前或過程中使所述細胞群體與至少一種內源性胞外海藻糖酶的抑制劑接觸。
7.如權利要求1至6中的任一項所述的方法，其特徵在於所述細胞是植物細胞。
8.利用權利要求1至7中的任一項所述的方法選擇出的遺傳轉化細胞，其中所述細胞的基因組含有至少一個選擇-核苷酸序列，該序列包含編碼參與海藻糖代謝的蛋白的區域。
9.如權利要求8所述的細胞，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有編碼具有海藻糖酶活性的胞內蛋白的區域。
10.如權利要求8或9所述的細胞，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有編碼在胞內有活性的海藻糖酶的經修飾的內源性海藻糖酶基因。
11.如權利要求8或9所述的細胞，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有源自大腸桿菌的TreF基因。
12.如權利要求8或9所述的細胞，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有源自鼠耳芥的AtTRE1基因。
13.如權利要求8至12中的任一項所述的細胞，其特徵在於其為植物細胞。
14.由權利要求13的轉化植物細胞再生的植物。
15.如權利要求14所述的植物的種子。
16.如權利要求14所述的植物的子代。
17.海藻糖和/或其衍生物用於從被轉化和未轉化細胞的群體中選擇轉化細胞的用途，其中轉化細胞的基因組含有至少一個選擇-核苷酸序列，該選擇-核苷酸序列含有編碼參與海藻糖代謝的蛋白的區域。
18.如權利要求17所述的用途，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有編碼具有海藻糖酶活性的胞內蛋白的區域。
19.如權利要求17或18所述的用途，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有編碼在胞內有活性的海藻糖酶的經修飾的內源性海藻糖酶基因。
20.如權利要求17或18所述的用途，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有源自大腸桿菌的TreF基因。
21.如權利要求17或18所述的用途，其特徵在於所述選擇-核苷酸序列含有源自鼠耳芥的AtTRE1基因。
22.如權利要求17至21中的任一項所述的用途，其特徵在於所述細胞為植物細胞。
全文摘要
一種用於從由被轉化和未被轉化的細胞組成的群體中選擇轉化細胞的環保且無毒性的方法。該方法包括下列步驟a)將至少一種目的核苷酸序列和至少一種選擇－核苷酸序列引入細胞當中，以獲得遺傳轉化細胞，其中所述選擇－核苷酸序列含有編碼參與海藻糖代謝的蛋白的區域；b)使具有被轉化的和未被轉化的細胞的群體與海藻糖和/或其衍生物接觸；和c)基於轉化細胞能夠代謝海藻糖和/或衍生物的能力，從所述群體中選擇出轉化細胞。
文檔編號C12N15/09GK1622999SQ02823127
公開日2005年6月1日 申請日期2002年11月6日 優先權日2001年11月6日
發明者J·C·M·斯米肯斯, H·施盧普曼 申請人:技術科學基金會