一種葛仙米藻膽蛋白的提取、純化方法及純化的藻紅蛋白與流程

2023-10-05 12:38:44 1

本發明涉及一種高效提取及純化葛仙米藻紅蛋白的方法和純化的藻紅蛋白。
背景技術：
：葛仙米(nostocsphaeroidskutzing)，學名擬球狀念珠藻，屬藍藻門(nostocaceae)念珠藻屬(nostoc.)，與髮菜同屬，古稱天仙米、天仙菜，又名水木耳、田木耳、地木耳(nostoccommunevauch)，是我國傳統出口的珍貴藥食兩用固氮藍藻。它是一種多細胞的絲狀植物，其細胞結構簡單、個體由圓球形細胞組成不分枝的單列絲狀體，絲狀體呈念珠狀，群體呈膠質狀、球狀或其他不規則形狀，藍綠色或黃褐色，肉眼可見，具有固氮能力。《本草綱目》、《藥性考》、《全國中草藥彙編》等稱葛仙米的功效為明目益氣、令人有子、解熱清隔、利腸胃、痰火能療、久食延年、消除疲勞、收斂、治夜盲症、燙火傷等。藻膽蛋白是廣泛存在於紅藻、藍綠藻和隱藻的藻膽體(phycobilisomes，pbs)中的捕光色素蛋白，包括藻藍蛋白(phycocyanin，pc)、藻紅蛋白(phycoerythrim，pe)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，pec)和別藻膽蛋白(allphycocyanin，apc)四類。葛仙米藻膽蛋白含量豐富，優於其他藻類。藻紅蛋白是一類附加值非常高的螢光色素蛋白，可用於免疫分析中可溶性抗原、抗體檢測診斷試劑、螢光探針、螢光標記等。目前市面上1mg純度在95％以上的藻紅蛋白售價達到5000元以上，純度越高售價劇增。藻膽蛋白的純化通常首先需要經過如鹽析法、等電點法或結晶法等初步分離除去雜蛋白後，再通過柱層析法純化，包括羥基石灰石吸附層析法、纖維素系列離子交換層析法、親和層析和分子排阻層析法。在藻膽蛋白粗提粉中，雜蛋白含量極高。要分離得到商品應用標準的藻紅蛋白，用已報導的藻膽蛋白分離純化方法，操作複雜，導致生產成本太高，無法大量製備以滿足潛在的市場需求。因此，有必要開發一種簡單有效的適合大量製備分離純化藻紅蛋白的方法，為實現葛仙米藻紅蛋白的工業化生產提供技術基礎。技術實現要素：本發明的目的是提供一種高效提取及純化葛仙米藻紅蛋白的方法和純化的藻紅蛋白。為實現上述目的，本發明提供了一種葛仙米藻膽蛋白的提取方法，包括以下步驟：(a)將葛仙米乾粉加入水中；(b)加入液氮，不斷攪拌，待液氮揮發完全；(c)離心過濾，得到葛仙米藻膽蛋白提取液；(d)冷凍乾燥得到葛仙米藻膽蛋白粗提粉末。步驟(a)中，所述水可以是純水、去離子水、蒸餾水等。步驟(a)中，所述葛仙米乾粉和水的質量比為1:40～1:70；優選地，為1:50，或1:60。步驟(b)中，所述液氮的加入量為葛仙米乾粉和水總質量的0.5％～1％。步驟(b)中，所述攪拌的時間為4h-10h；優選地，為6h。步驟(c)中，所述離心的轉速為5000rpm-8000rpm；離心的時間為20min-30min；可以採用碟式離心機離心過濾。本發明還提供了一種葛仙米藻紅蛋白的純化方法，包括以下步驟：(1)選用陰離子交換柱過柱；(2)配置pb緩衝液buffera和pb-nacl緩衝液bufferb，過濾；(3)葛仙米藻膽蛋白粗提粉末用pb緩衝液buffera溶解，離心，過濾；(4)洗泵，用pb緩衝液buffera平衡離子交換柱；(5)將步驟(3)製備的溶解於pb緩衝液buffera中的葛仙米藻膽蛋白直接上樣，pb-nacl緩衝液bufferb梯度洗脫，收集洗脫液；(6)用鹽溶液清洗離子交換柱，然後用鹼溶液溶液反向衝洗；(7)對步驟(5)的洗脫液進行超濾濃縮，透析，得到純化的葛仙米藻紅蛋白水溶液；(8)步驟(7)得到的葛仙米藻紅蛋白水溶液0～10℃保存。步驟(1)中，所述過柱前先用去離子水置換陰離子交換柱中的20％的乙醇水，其目的是陰離子交換柱用20％的乙醇水保存，使用前應該將其置換掉。步驟(1)中，所述陰離子交換柱為agarosixff-deae陰離子交換柱。所述陰離子交換柱的介質為粒徑為50～150μm，交聯度為6％的瓊脂糖凝膠組成；優選地，為粒經為90μm，交聯度為6％的交聯瓊脂糖凝膠組成；所述瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網狀結構，網狀結構的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，瓊脂糖凝膠的結構是穩定的，可以在許多條件下使用(如水，ph4-9範圍內的鹽溶液)；瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，不能高壓消毒，可用化學滅菌活處理。交聯瓊脂糖凝膠是生物分離中常用的色譜基質，利用不同的功能基對其表面的羥基進行修飾，進而製備出疏水色譜、離子交換色譜和親和色譜等商業填料。步驟(2)中，所述pb緩衝液的ph為5～6.5，電導率為5～10μs/cm；優選地，ph為6～6.5，電導率為6～8μs/cm；進一步優選地，ph為5、6、6.3、6.5，電導率分別為8.5μs/cm、8.0μs/cm、7.1μs/cm、6.0μs/cm。步驟(2)中，所述pb-nacl緩衝液的ph為5～6.5，電導率為5～10μs/cm；優選地，ph為6～6.5，電導率為6～8μs/cm；進一步優選地，ph為5、6、6.3、6.5，電導率分別為8.5μs/cm、8.0μs/cm、7.1μs/cm、6.0μs/cm。步驟(2)中，進一步優選地，pb緩衝液ph為5時，電導率為8.5μs/cm時，pb-nacl緩衝液ph為5，電導率為8.5μs/cm；或，pb緩衝液ph為6時，電導率為8.0μs/cm時，pb-nacl緩衝液ph為6，電導率為8.0μs/cm；或，pb緩衝液ph為6.3時，電導率為7.1μs/cm時，pb-nacl緩衝液ph為6.3，電導率為7.1μs/cm；或，pb緩衝液ph為6.5時，電導率為6.0μs/cm時，pb-nacl緩衝液ph為6.5，電導率為6.0μs/cm。步驟(2)中，所述pb-nacl緩衝液的配製方法為在配置好的pb緩衝液中添加nacl固體，邊加邊測電導率，直至電導率達到要求。步驟(2)中，所述過濾是指用0.2μm的過濾膜減壓過濾，除去固體雜質；採用減壓泵減壓抽濾的方法進行減壓步驟(3)中，所述葛仙米藻膽蛋白粗提粉末可以按上述方法製備得到；或所述葛仙米藻膽蛋白粗提粉末是由葛仙米乾粉和純水(料液比1:60)提取6h，過濾，冷凍乾燥得到。步驟(3)中，所述葛仙米藻膽蛋白粗提粉末、pb緩衝液的用量比5g:1l～15g:1l；優選地，為10g:1l。步驟(3)中，所述離心轉速可以但不限於5000～10000r/min，如8000r/min。步驟(3)中，所述離心時間為20min～40min；優選地，為30min。步驟(3)中，所述過濾優選採用0.2μm的濾膜過濾。步驟(4)中，所述洗泵時用去離子水洗1～1.5個柱體積；優選地，用去離子水洗1個柱體積。步驟(4)中，所述平衡過程用3～10個柱體積的pb緩衝液；優選地，用4～6個柱體積的pb緩衝液；進一步優選地，用5個柱體積的pb緩衝液buffera。步驟(5)中，所述pb緩衝液的ph為5～6.5，電導率為5～10μs/cm；優選地，ph為6～6.5，電導率為6～8μs/cm；進一步優選地，ph為6、6.3、6.5，電導率分別為8.0μs/cm、7.1μs/cm、6.0μs/cm。步驟(5)中，所述pb-nacl緩衝液的ph為5～6.5，電導率為5～10μs/cm；優選地，ph為6～6.5，電導率為6～8μs/cm；進一步優選地，ph為6、6.3、6.5，電導率分別為8.0μs/cm、7.1μs/cm、6.0μs/cm。步驟(5)中，進一步優選地，pb緩衝液ph為5，電導率為8.5μs/cm時，pb-nacl緩衝液ph為5，電導率為8.5μs/cm；或，pb緩衝液ph為6，電導率為8.0μs/cm時，pb-nacl緩衝液ph為6，電導率為8.0μs/cm；或，pb緩衝液ph為6.3，電導率為7.1μs/cm時，pb-nacl緩衝液ph為6.3，電導率為7.1μs/cm；或，pb緩衝液ph為6.5，電導率為6.0μs/cm時，pb-nacl緩衝液ph為6.5，電導率為6.0μs/cm。步驟(5)中，所述上樣量為2～4個柱體積；優選地，為2、2.5、3、4個柱體積。步驟(5)中，所述收集的洗脫液為4～5個柱體積20～100％的洗脫液，優選為40～100％的洗脫液。步驟(6)中，所述鹽溶液優選為nacl或kcl，所述鹽溶液的濃度為0.02～0.1m；優選地，為0.05m。步驟(6)中，所述鹽溶液的用量為1～2個柱體積。步驟(6)中，所述鹼溶液優選為naoh或koh，所述鹼溶液的濃度為0.1～0.5m；優選地，為0.1m。步驟(6)中，所述鹼溶液的用量為3～4個柱體積。步驟(7)中，所述超濾膜孔徑為1000d～8000d；優選地，為3000d。步驟(7)中，所述透析可採用任何常規透析方法進行。步驟(8)中，所述水溶液保存的溫度優選為4℃。具體地，本發明藻紅蛋白的純化方法，包括以下步驟：將葛仙米藻膽蛋白粗提粉末用ph為6～6.5、電導率為6～8μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；agarosixff-deae陰離子交換柱過柱，用去離子水置換的6％的交聯瓊脂糖凝膠介質灌柱，用1個柱體積的去離子水洗泵，5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡，上樣4個柱體積，收集ph為6～6.5、電導率為6～8μs/cm的pb-nacl緩衝液bufferb的梯度洗脫液4～5個柱體積，用3000d的超濾膜超濾濃縮，透析，水溶液4℃保存。本發明還提供了一種由上述純化方法純化得到的葛仙米藻紅蛋白；所述藻紅蛋白的藻紅蛋白的相對分子量為67kd-70kd。與現有技術相比，本發明的有益效果在於：i)本發明選用的陰離子交換柱如agarosixff-deae陰離子交換柱顯著提高了純化效率，省去現有純化方法中需採用硫酸銨沉澱的步驟，並且大大提高了藻紅蛋白的濃度和純度，方法簡單，效果明顯，可處理量大，為工業化應用提供了基礎。ii)本發明選用的上樣條件經實驗證明上樣量大，一次可純化的蛋白樣品多，純化方法簡單，成本低，大大提高了藻紅蛋白的純化效率，為實現工業化大生產提供基礎。iii)本發明可以去除藻膽蛋白粗提粉末中大部分的雜質，使得藻紅蛋白的提取率接近100％，損失量少。iv)本發明得到的葛仙米藻紅蛋白濃度和純度都得到顯著提高，可以將藻紅蛋白的純度提高到90％以上，甚至更高。v)本發明純化的藻紅蛋白，產品附加值高，可應用於化妝品、食品、保健食品以及生物醫藥等領域，有廣闊的開發前景。附圖說明圖1表示實施例7中純化的藻紅蛋白的凝膠過濾色譜圖。凝膠過濾層析根據蛋白質的分子量的不同在不同的時間出峰，經過峰面積與總面積的比值計算得到每次檢測樣品的純度。根據出峰位置估算藻紅蛋白的相對分子量為67kd-70kd。圖2表示實施例7中純化的藻紅蛋白與藻紅蛋白對照品的紫外光譜(1.藻紅蛋白；2.藻紅蛋白標準品)。通過對比，兩個樣品的出峰位置基本相同，有相近的共軛結構，是同類樣品。圖3表示實施例7中純化的藻紅蛋白與藻紅蛋白對照品的螢光光譜(1.藻紅蛋白；2.藻紅蛋白標準品)。通過對比，兩個樣品的出峰位置相同，說明是同類樣品。圖4表示三組分sgs-page分析圖(1：marker(mr從下至上分別是14.3kd、20.1kd、29.0kd、44.3kd、66.4kd、97.2kd)；2：按本發明上述方法製備的藻膽蛋白粗提粉末；3：實施例7純化得到的藻紅蛋白；4：藻藍蛋白)根據電泳數據分析藻紅蛋白的亞基分子量約為14kd。具體實施方式結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明。實施本發明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。實施例中未註明的具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可通過正規渠道商購買得到的常規產品。本發明藻紅蛋白濃度的檢測方法為考馬斯亮藍g250染色法，測定波長為595nm處的吸光值，按李合生的《植物生理生化實驗原理和技術》記載方法繪製標準曲線並計算，購買藻紅蛋白標準品所測得的藻紅蛋白標準曲線為od595＝0.8096c+0.0084，r2＝0.9986；濃度的計算方法為：濃度c＝(od595-0.0084)÷0.8096。本發明藻紅蛋白的純度由紫外吸收光譜儀檢測，純度的計算方法為：純度＝a545/a280；純度％＝a545/(a545+a280)×100％。實施例1採用deae-cellulose52陰離子交換柱進行實驗室小試純化藻紅蛋白將50.01g、50.03g、49.99g葛仙米乾粉分別加入2500ml純水，攪拌均勻後加入20ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到10.02g、9.98g、10.01g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末。分別用ph為7.0、電導率為5.7μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用deae-cellulose52陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣2個柱體積。收集40～100％ph為7.0、電導率為5.7μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表1：表1藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次0.964.8783第二次0.964.8783第三次0.964.8783由上表1可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為0.96g/ml，純度均值為4.87(83％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。但是純化的藻紅蛋白的純度和濃度偏低，可見deae-cellulose52陰離子交換柱純化藻紅蛋白效率不高，效果較差。實施例2採用deae-cpato陰離子交換柱進行實驗室小試純化藻紅蛋白將50.11g、50.07g、49.91g葛仙米乾粉分別加入2500ml純水，攪拌均勻後加入20ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到9.97g、10.03g、10.01g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末，分別用ph為7.0、電導率為5.7μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用deae-cpato陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣2個柱體積。收集40～100％ph為7.0、電導率為5.7μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表2：表2藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次1.015.2183.9第二次1.015.2183.9第三次1.015.2183.9由上表2可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為1.01g/ml，純度均值為5.21(83.9％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。同樣，純化的藻紅蛋白的純度和濃度偏低，可見deae-cpato柱純化藻紅蛋白效率不高，效果較差。實施例3採用deae-sephadexfastflow陰離子交換柱進行實驗室小試純化藻紅蛋白將49.98g、50.13g、49.92g葛仙米乾粉分別加入2500ml純水，攪拌均勻後加入20ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到9.96g、9.97g、10.02g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末，分別用ph為7.0、電導率為5.7μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用deae-sephadexfastflow陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣1個柱體積，收集40～100％ph為7.0、電導率為5.7μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表3：表3藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次1.026.0285.8第二次1.026.0285.8第三次1.026.0285.8由上表3可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為1.02g/ml，純度均值為6.02(85.8％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。但純化的藻紅蛋白的純度和濃度不高，可見deae-sephadexfastflow柱純化藻紅蛋白雖然較以上兩種陰離子交換柱純度稍有提高，但是效率仍然不理想，效果較差。實施例4採用agarosixff-deae陰離子交換柱進行實驗室小試純化藻紅蛋白將50.09g、50.03g、49.99g葛仙米乾粉分別加入2500ml純水，攪拌均勻後加入20ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到9.96g、9.91g、10.01g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末，分別用ph為7.0、電導率為5.7μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用agarosixff-deae陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣2個柱體積。收集40～100％ph為7.0、電導率為5.7μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表4：表4藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次2.099.6890.6第二次2.099.6890.6第三次2.129.6890.6由上表4可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為2.10g/ml，純度均值為9.68(94.1％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。另外，經agarosixff-deae陰離子交換柱純化的藻紅蛋白的純度和濃度均有顯著提高，可見agarosixff-deae陰離子交換柱適用於藻紅蛋白的純化。實施例5採用本發明方法進行實驗室小試純化藻紅蛋白將60.01g、60.11g、60.03g葛仙米乾粉分別加入3000ml純水，攪拌均勻後加入25ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到12.51g、12.47g、12.53g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末，分別用ph為5.0、電導率為8.5μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用agarosixff-deae陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣2.5個柱體積。收集40～100％ph為5.0、電導率為8.5μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表5：表5藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次2.5110.0190.9第二次2.5110.0190.9第三次2.5110.0190.9由上表5可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為2.51g/ml，純度均值為10.01(90.9％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。另外，經agarosixff-deae陰離子交換柱純化的藻紅蛋白的純度和濃度均有顯著提高，可見agarosixff-deae陰離子交換柱適用於藻紅蛋白的純化。實施例6採用本發明方法進行實驗室小試純化藻紅蛋白將75.01g、75.03g、75.99g葛仙米乾粉分別加入3750ml純水，攪拌均勻後加入30ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到15.00g、14.97g、15.03g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末，分別用ph為6.0、電導率為8.0μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用agarosixff-deae陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣3個柱體積。收集40～100％ph為6.0、電導率為8.0μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表6：表6藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次3.0313.6293.2第二次3.0313.6293.2第三次3.0313.6293.2由上表6可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為3.03g/ml，純度均值為13.62(93.2％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。另外，經agarosixff-deae陰離子交換柱純化的藻紅蛋白的純度和濃度均有顯著提高，可見agarosixff-deae陰離子交換柱適用於藻紅蛋白的純化。實施例7採用本發明方法進行實驗室小試純化藻紅蛋白將100.01g、100.13g、100.09g葛仙米乾粉分別加入5000ml純水，攪拌均勻後加入40ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到20.02g、19.98g、20.01g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末，分別用ph為6.3、電導率為7.1μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用agarosixff-deae陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣4個柱體積。收集40～100％ph為6.3、電導率為7.1μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表7：表7藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次4.2116.4394.3第二次4.2116.4394.3第三次4.2116.4394.3由上表7可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為4.21g/ml，純度均值為16.43(94.3％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。實驗發現，當上樣條件為：用ph為6.3、電導率為7.1μs/cm的pb緩衝液buffera溶解時，可以達到上樣4個柱體積，所得到的藻紅蛋白濃度最高，為4.21g/ml；同時，洗脫條件為ph為6.3、電導率為7.1μs/cm的pb-nacl緩衝液bufferb梯度淋洗可以得到純度為16.43的藻紅蛋白，大大提高了純化效率。實施例7中純化的藻紅蛋白的凝膠過濾色譜圖如圖1所示。凝膠過濾層析根據蛋白質的分子量的不同在不同的時間出峰，經過峰面積與總面積的比值計算得到每次檢測樣品的純度。出峰位置約為8ml，根據標準圖譜，9ml左右分子量約為67kd，估算藻紅蛋白的相對分子量為67kd-70kd。實施例7中純化的藻紅蛋白與藻紅蛋白對照品的紫外光譜如圖2所示。通過對比，兩個樣品的出峰位置基本重合，吸收峰為542nm和565nm，有相近的共軛結構，判斷為同類樣品。實施例7中純化的藻紅蛋白與藻紅蛋白對照品的螢光光譜如圖3所示。通過對比，兩個樣品的特徵出峰位置相同(575nm)，說明是同類樣品。實施例8採用本發明方法進行實驗室小試純化藻紅蛋白將75.11g、75.03g、74.99g葛仙米乾粉分別加入3750ml純水，攪拌均勻後加入30ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到15.02g、14.92g、15.03g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末，分別用ph為6.5、電導率為6.0μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用agarosixff-deae陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣3個柱體積。收集40～100％ph為6.5、電導率為6.0μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表8：表8藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次3.0214.1293.4第二次3.0214.1293.4第三次3.0214.1293.4由上表8可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為3.02g/ml，純度均值為14.12(93.4％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。實施例9採用本發明方法進行實驗室小試純化藻紅蛋白將50.08g、50.30g、49.94g葛仙米乾粉分別加入2500ml純水，攪拌均勻後加入20ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到10.02g、9.91g、10.01g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末用ph為7.5、電導率為5.8μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；採用agarosixff-deae陰離子交換柱過柱：1)用1個柱體積的去離子水洗泵；2)用5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡；3)上樣2個柱體積。收集40～100％ph為7.5、電導率為5.9μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表9：表9藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次2.113.7178.7第二次2.113.7178.7第三次2.113.7178.7由上表9可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為2.11g/ml，純度均值為3.71(78.7％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。但是pb緩衝液buffera和pb-nacl緩衝液bufferb的ph超過6.5時，純化效果明顯下降。實施例10採用本發明方法進行實驗室小試純化藻紅蛋白將50.02g、49.93g、49.99g葛仙米乾粉分別加入2500ml純水，攪拌均勻後加入20ml液氮，邊加邊劇烈攪拌。待液氮揮發完全後，繼續攪拌，待碎冰完全溶解，離心過濾，冷凍乾燥分別得到9.98g、9.95g、10.03g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末，分別用ph為9.3、電導率為9.2μs/cm的pb緩衝液buffera溶解，8000r/min離心30min，用0.2μm的濾膜過濾；用1個柱體積的去離子水洗泵，5個柱體積的pb緩衝液buffera平衡，上樣4個柱體積，收集40～100％ph為9.3、電導率為9.5μs/cm的pb-nacl洗脫液，結果見下表10：表10藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次2.092.7473.2第二次2.092.7473.2第三次2.112.7473.2由上表10可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為2.10g/ml，純度均值為2.74(73.2％)。經過三次重複實驗驗證了本實驗有很好的重現性。得到的藻紅蛋白的濃度均顯著低於其他實施例，說明該上樣和洗脫的ph範圍是不合適的，適宜的洗脫條件為pb緩衝液buffera的ph為5～6.5，電導率為5～10μs/cm，上樣條件為pb-nacl緩衝液bufferb的ph為5～6.5，電導率為5～10μs/cm。對比例1將10.03g、9.96g、10.02g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末按文獻「李邵蓉，rhodosorusmarinus中藻紅蛋白的純化及其性質的研究」，用tris-hcl緩衝液(ph＝8.4、0.1mol/l，下同)溶解，用1個柱體積的去離子水洗泵，5個柱體積的tris-hcl緩衝液平衡，上樣4個柱體積，用0.1mol/l、0.2mol/l、0.5mol/l的nacl溶液分步洗脫，收集紅色樣品對tris-hcl緩衝液透析，再通過一次同樣的deae纖維柱，收集紅色樣品，將收集的樣品對pb緩衝液(ph＝6.6，0.1mol/l)充分透析，上bio-gelp300柱，收集兩條紅色帶，檢測結果見下表11：表11藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次0.604.381.1第二次0.594.381.1第三次0.604.381.1由上表11可見，三次純化得到藻紅蛋白濃度均值為0.597g/ml，純度均值為4.3(81.1％)，其濃度以及純度均顯著低於實施例1～4。經過三次重複實驗驗證。對比例1中選用的緩衝體系tris-hcl及ph使得純化效果較差，純化操作步驟繁雜，增加了實際操作的成本。本發明方法選用的pb緩衝體系更適合藻紅蛋白的純化，一次層析即可完成純化過程，而且藻紅蛋白純度、濃度高於對比例1。因此，本發明的方法可操作性強，操作簡便，使用成本低，純化得到的藻紅蛋白的濃度和純度高。對比例2將10.01g、10.04g、10.03g葛仙米藻膽蛋白粗提粉末按文獻「程凌江，條斑紫菜中r-藻紅蛋白的純化及其和亞基的分離與發色團含量的測定」，用15％的nh4so4鹽析除雜，用bio-gelp300柱進一步純化，洗脫液為ph＝6.8的0.1mol/l磷酸鹽緩衝液(含1mmol/l疊氮鈉和mmol/lβ-巰基乙醇)，洗脫液流速15ml/h，收集紅色帶，檢測結果見下表12：表12藻紅蛋白濃度(g/ml)純度純度(％)第一次0.678.189第二次0.678.189第三次0.678.189由上表12可見，三次純化得到的藻紅蛋白的濃度均值為0.67g/ml，純度均值為8.1(89％)，其濃度以及純度均顯著低於實施例3～4。經過三次重複實驗驗證。對比例2中選用的pb緩衝體系ph較低，體系偏酸性，使得藻紅蛋白的純化雖然經過兩步純化，但純化的純度不理想，最高僅為89％。本發明方法得到的藻紅蛋白的純度顯著高於對比例2，而且本發明方法通過一次層析即可完成純化過程，得到的藻紅蛋白純度和濃度均高於對比例2。因此，本發明的方法可操作性強，操作簡便，使用成本低，得到的藻紅蛋白濃度高、純度高。由實施例1～10和對比例1～2可見，(1)本發明所選用的agarosixff-deae陰離子交換柱的填料是6％的交聯度瓊脂糖凝膠，在純化中表現出高載量(120mg/ml)和高穩定性(操作溫度4～40℃，操作壓力≦3bar)，性能更好。實驗證明本發明方法適於採用該樹脂用於純化藻紅蛋白，效果明顯優於其他deae陰離子交換柱(包括deae-52纖維素柱以及deae-sephadexfastflow柱)；且藻紅蛋白質損失少，上樣量大，純度高，可能是因為本發明採用的離子交換柱配基與藻紅蛋白結合，而與其他雜質蛋白不結合，提高了藻紅蛋白的吸附量；(2)在緩衝液ph值為5～6.5時，本發明方法得到的藻紅蛋白的純度顯著高於對比例，是因為只有在該合適的ph範圍內，pb體系中的磷酸鹽離子包裹的藻紅蛋白的帶負電部分裸露，使得藻紅蛋白儘可能多地吸附於agarosixff-deae柱上，而其他的雜蛋白不被吸附，在上樣平衡時就會被排除在柱外；tris-hcl體系則很難使藻紅蛋白吸附。(3)本發明可以通過一步agarosixff-deae分離得到純度高、產量高(上樣量大，得到的藻紅蛋白濃度高)的藻紅蛋白，大大簡化了實驗步驟。綜上所述，採用本發明方法可以從葛仙米藻膽蛋白粗提粉末中得到濃度在2.51g/ml以上，純度在10.01(90.9％)以上的藻紅蛋白，並且本發明方法上樣量大、方法簡單、工藝周期短；同時本發明方法還將純化的藻紅蛋白的純度從已有文獻中報導的4.3(81.1％)提高到16.43(94.3％)，顯著提高了藻紅蛋白的純度，具有很大的應用前景。本發明的保護內容不局限於以上實施例。在不背離發明構思的精神和範圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，並且以所附的權利要求書為保護範圍。當前第1頁12