新的肽酶底物的製作方法

2023-10-05 12:37:39

專利名稱：新的肽酶底物的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的化合物，其可用作PH指示劑和/或用作檢測肽酶活性的酶底物。 這些底物可用於包括產生物理化學信號的酶促水解步驟的應用中，特別用於微生物學、生物化學、免疫學、分子生物學、組織學等中。本發明還涉及包含所述底物的反應培養基、所述底物或者所述培養基用於檢測肽酶活性和/或區分革蘭氏陽性細菌與革蘭氏陰性細菌的用途，還涉及使用方法。
背景技術：
目前已有大量用於檢測微生物的培養基。這種檢測具體地可基於使用對期望檢測的微生物的酶具有特異性的特定底物。一般而言，製備酶的合成底物以使該底物與其靶酶代謝的產物具有不同的物理化學性質，從而可區分它們，並且評價是否全部或者部分的底物已被酶轉化成產物。水解酶底物通常由對要顯示的酶活性特異性的第一部分以及用作標記物的第二部分(通常是發色或者發螢光的)組成。因此，在細菌的情況中，通過選擇底物， 根據是否存在反應，可表徵微生物的性質。肽酶活性可具體用來顯示細菌的群、屬或者種。 因此，例如，丙氨酸-氨肽酶活性使得可以區分革蘭氏陰性細菌與革蘭氏陽性細菌。用於檢測肽酶活性的酶發色底物是本領域已知的。可具體提及的是Manafi的文章(Manafi等人，Microbiol Rev 55(3) :335_348，1991)，這是關於用於微生物學的酶底物的綜述。但是，所述的氨肽酶底物通過水解釋放擴散於培養基中的化合物(β_萘基胺， 7-氨基-4-甲基香豆素)。因此，在非均相反應培養基(培養皿上的菌落、組織切片等) 中，不可能準確定位水解的位置。還可提及由本申請人提交的專利申請WO 98/04735和WO 99/38995中所述的底物。但是，雖然這些底物少量擴散於培養基中，但是它們具有某些缺點它們難以合成，純度低，收率低，並且它們對某些微生物具有毒性。

發明內容
因此，本發明提出新的化合物的用途，其用作ρΗ指示劑，或者用作肽酶底物，能夠用來檢測微生物。較之現有的底物，這些新的化合物易於合成，並且可具體地用於凝膠化的培養基中來檢測微生物，因為它們產生的顯色在反應培養基中少量或者根本不擴散。在用作酶底物的情況中，這使得能夠在不表達肽酶活性的其他菌落或細胞器中準確地定位表達肽酶活性的菌落或者細胞器。在進一步描述本發明之前，為了便於公開本發明而作出以下定義。術語「_底物」是指這樣底物，其可被酶水解成允許直接或間接地檢測微生物、細胞或細胞器的產物。所述底物具體地包含對要顯示的酶活性特異性的第一部分以及用作標記物的第二部分。本發明的用作底物的化合物適合用於流式細胞術，由於水解的產物主要保持位於表達酶活性的細胞中，因此可特異性地對表達此活性的細胞進行計數，乃至將它們從樣品的其餘部分分離。
本發明的用作底物的化合物還非常適合用於組織酶學，由於水解的產物主要保持在水解的位置處，因此可特異性地鑑定在組織內表達此活性的細胞或者細胞器。本發明的化合物由於它們的低毒性而非常適合分別用作pH指示劑，或者監測細胞培養物中的肽酶活性。本發明的化合物特別適合用於檢測和/或鑑定培養基，因為它們產生不擴散於反應培養基中的顯色或者螢光。 在本發明中，術語「顯色」涵蓋染色、吸收可見光譜的光或者螢光，以及在一種波長吸收(λ ex)並在更高的波長發射(λ Μ，λ Μ > λ ex)。本發明的化合物可成鹽，即為鹽的形式，例如，氯化物、溴化物、碘化物或者三氟乙酸鹽。術語「pH指示劑」是指顏色和/或螢光隨著培養基的PH改變而改變的化學物質， 其中所述PH改變任選地與在所述培養基上生長的微生物的代謝相關。術語「M」是指能夠通過水解切割肽的醯基殘基與伯胺之間形成的醯胺基團的酶。術語「MM」是指能夠通過水解切割胺基酸的醯基與伯胺之間形成的醯胺基團的酶。 在本申請中，術語「肽酶」可適當地表示以上定義的肽酶和氨肽酶。術語「肽」是指包含1-10個胺基酸，優選1-4個胺基酸的肽鏈。優選地，所述肽是二丙氨酸或者三丙氨酸。術語「a^M」是指本領域技術人員已知的任何天然的或者非天然的胺基酸。根據本發明的一具體實施方案，所述胺基酸是β-丙氨酸或L-丙氨酸或D-丙氨酸，或者甘氨酸、焦穀氨醯基等。所述肽可包含在其N末端的封端劑。本發明的封端劑包括本領域技術人員已知的能夠保護胺的任何封端劑。作為實例，可提及叔丁氧羰基(N-tB0C)、9-芴基氧基羰基、增溶劑如琥珀醯基，或者不可代謝的胺基酸，即非天然的胺基酸如2-哌啶酸，或者胺基酸的 D ·形式如D-苯丙氨酸。封端劑並非系統地存在於本發明的化合物中。術語「烷基基團」是指基於飽和烴基團的鏈，具體而言，例如,C1-C6烷基，即含有 1-6個碳原子的直鏈或支鏈的烷基。作為實例，可提及甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基。術語「芳基基團」是指衍生自芳香族核，具體而言，例如C6-Cltl芳香族核的官能團 (或取代基)，特別是苯基、苄基、I"萘基或者2-萘基。術語「羧基基團」是指，具體而言,由通過雙鍵與第一氧原子鍵合併通過單鍵與第二氧原子鍵合的碳原子組成的官能團，其本身帶負電荷或者與氫原子相連。取決於分子的 PKa和培養基的pH，羧基基團可以是電離的形式，即不含有與第二氧原子相連的H，由此帶負電荷。術語「反應培養基」是指這樣的培養基,其包含微牛物、細胞或者細胞器的代謝表達和/或生長所需的所有組分。反應培養基可用於流式細胞術、組織酶學、細胞培養等，或者用作檢測和/或鑑定微生物的培養基。所述反應培養基可包含一種或者多種組分的組合，例如，胺基酸、腖、糖、核苷酸、 礦物質、維生素、抗生素、表面活性劑、緩衝劑、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽或者金屬鹽。所述培養基還可包含染料。作為染料的實例，可提及伊文思藍、中性紅、羊血、馬血、遮光劑如氧化鈦、硝基苯胺、孔雀石綠、亮綠等。
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所述反應培養基可以是固體、半固體或者液體。術語「固體培養基」是指，例如凝膠化的培養基。瓊脂是常規的凝膠劑，在微生物學中用於培養微生物，但是可使用明膠或者瓊脂糖。可商購獲得某些配製品，例如，Columbia瓊脂、Trypcase-soy瓊脂、MacConkey瓊月旨、Sabouraud瓊脂，或者，更概括地，Handbook of Microbiological Media (CRC Press)中所述的那些。所沭反應培養基可以是檢測和/或鑑定培養基,即，顯示培養基或者培養且顯示的培養基。在第一種情況中，微生物的培養在接種之前進行；在第二種情況中，檢測和/或鑑定培養基也構成培養基。術語「^li^M^」是指臨床樣品，其來源於生物學流體的樣本或者食物樣品，來源於任何類型的食物，或者來源於任何化妝品或藥物製劑的化妝品或藥物樣品。因此，樣品可以是液體或者固體，並且可非限制性地提及，血液、血漿、尿液或糞便的臨床樣品，鼻、咽喉、皮膚、傷口或者腦脊髓流體樣本的臨床樣品，來自水、飲料如乳品或果汁、酸奶、肉類、蛋類、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚類等的食物樣品；來源於動物飼料的食物樣品，具體而言，例如來源於動物食物的樣品。所述樣品還可來源於臨床環境樣本、家畜樣本，或者食物、化妝品或藥物生產的樣本。術語「環境樣本」具體是指表面、液體、原料或者產品的樣本。因此，術語 「樣品」是指樣本本身(拭子、糞便、食物等)和由所述樣本而得的微生物菌落(例如在凝膠化的培養基上分離後)，或者包含由所述樣本而得的微生物的培養基(例如用所述樣本接種的富集培養液)。對於本發明，術語「微牛物」涵蓋細菌、酵母、黴菌，更概括而言，有機體，其通常是單細胞的有機體，並且是裸眼不可見的，可在實驗室中對其進行倍增或者操作。作為革蘭氏陰性細菌，可提及以下屬的細菌假單胞菌屬(I^seudomonas)、 埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、 J ff ^ M (Enterobacter)、 3 胃 白 ft 胃 M (Klebsiella) > ^ W K ^ M (Serratia)、 變形菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血菌屬(Haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、不動桿菌屬 (Acinetobacter)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、伯克霍爾德氏菌屬(Burldiolderia)、檸檬酸桿菌屬(CitrcAacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、 產鹼菌屬(Alcaligenes)、博德特氏菌屬(Bordetella)、西地西菌屬(Cedecea)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、寡養單胞菌屬 (Stenotrophomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)禾口軍團菌屬(Legionella)。作為革蘭氏陽性細菌，可提及以下屬的細菌氣球菌屬(Aerococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、 芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、利斯特氏菌屬(Listeria)、梭菌屬(Clostridium)、加德納氏菌屬(Gardnerella)、庫克菌屬(Kocuria)、乳球菌屬 (Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、微球菌屬(Micrococcus)、Falkamia、孿生球菌屬(Gemella)、片球菌屬(Pediococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)禾口棒桿菌屬 (Corynebacterium)0
作為酵母，可提及以下屬的酵母假絲酵母屬(Candida)、隱球菌屬 (Cryptococcus)、酵母屬(Saccharomyces)禾口絲抱酵母屬(Trichosporon)。優選地，所述微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)或獎腸球菌(Enterococcus faecalis)0在此方面，本發明涉及式⑴的化合物及其鹽用於檢測肽酶活性和/或PH變化的用途
權利要求
1.式⑴的化合物及其鹽用於檢測肽酶活性和/或PH變化的用途
2.如權利要求1所述的式I的化合物的用途，其中Y1是肽，優選選自甘氨酸、丙氨酸和焦穀氨醯基。
3.如權利要求1或2所述的式I的化合物的用途，其中η= 1。
4.如權利要求1-3中任一項所述的式I的化合物的用途，其中m和W4獨立地為H0
5.如權利要求1-4中任一項所述的式I的化合物的用途，其中X是S或CZ5Z6，優選 CCH3CH3 ο
6.如權利要求1-5中任一項所述的式I的化合物的用途，其中Y是N、N+C3H7或N+CH3。
7.如權利要求1-6中任一項所述的式I的化合物的用途，其中W、Z3和\是H。
8.如權利要求1所述的式I的化合物的用途，其中所述化合物選自L-丙氨醯基-2-(4』 -醯氨基苯乙烯基)苯並噻唑TFA、β-丙氨醯基_2-(4』 -醯氨基苯乙烯基)苯並噻唑TFA、L-丙氨醯基-2-(4』 -醯氨基苯乙烯基)-N-甲基苯並噻唑鐺氯化物、甘氨醯基-2_(4』 -氨基苯乙烯基)-Ν-甲基苯並噻唑鐺碘化物、焦穀氨醯基_2-(4』 -醯氨基苯乙烯基)-Ν-甲基苯並噻唑鐺碘化物、L-丙氨醯基-2-(4』-醯氨基苯乙烯基)-N-丙基苯並噻唑鐺碘化物和L-丙氨醯基_2-(4』 -醯氨基苯乙烯基)-1，3，3-三甲基吲哚鐺二溴化物。
9.檢測微生物中的肽酶活性和/或ρΗ變化的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟a)提供檢測和/或鑑定培養基，其包含式(I)的化合物及其鹽
10.區分細菌屬於革蘭氏陽性細菌或者革蘭氏陰性細菌的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟a)提供檢測和/或鑑定培養基，其包含式(I)的化合物及其鹽 W3W4
11.用於檢測和/或鑑定微生物的培養基，其包含用於檢測肽酶活性和/或PH變化的式(I)的化合物及其鹽
全文摘要
本發明涉及式(I)的化合物及其鹽用於檢測肽酶活性和/或pH變化的用途其中Y1是肽、H或者烷基；W1、W2、W3和W4獨立地為H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或醯胺)、或者上述基團的任何組合；n＝0、1或者2；X是NR、CZ5Z6、S或者O，R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷醯基或者烷基磺醯基，Z5和Z6是烷基；Y是N或N+R，R是烷基、芳烷基、芳基、烷醯基或者烷基磺醯基；Z1、Z2、Z3和Z4獨立地為H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺醯基，包括該羧基或者磺醯基的酯或者醯胺。
文檔編號C12Q1/37GK102482706SQ201080033836
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月27日 優先權日2009年7月30日
發明者A·詹姆斯, J·佩裡, O·法布雷加, S·斯坦福斯, S·歐倫加, V·L·薩爾瓦圖拉 申請人:生物梅裡埃公司