唐古特大黃藥材dna提取方法

2023-10-05 01:22:14 2

專利名稱：唐古特大黃藥材dna提取方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種藥材DNA提取方法，尤其涉及一種唐 古特大黃藥材DNA提取方法。
背景技術：
唐古特大黃，又名雞爪大黃，隸屬於為蓼科(Polygonaceae)大黃屬(及/^畫 L)，多年生草本植物，分布在西藏東部、青海、甘肅，生於海拔1700-4300 米山坡林緣、灌叢中及半陰坡石堆中，是中國特有種。其乾燥根及根莖入藥， 性寒，味苦；具有瀉熱通腸，涼血解毒，逐瘀通經之功效；為《中華人民共和 國藥典》(2005)中記載的"正品大黃"之一。
隨著分子生物學的發展，DNA分子標記技術已逐漸滲透到中藥研究領域。 基因組DNA的提取是DNA分子標記技術研究的一個重要步驟。大黃中藥材 中含有較多的蒽醌類、多糖和鞣質類等次生代謝物質，這些次生代謝物質抑制 DNA聚合酶的活性，影響後續DNA的擴增工作。因此，大黃藥材DNA的提 取是DNA分子標記技術應用於大黃中藥研究的一個關鍵。
從唐古特大黃藥材DNA提取方法，主要有CTAB法。由於唐古特大黃中
藥材中含有較多的次生代謝物質蒽醌類、鞣質、蛋白質及多糖等，這些物質 難以去除，所得DNA沉澱較多，呈黃色至褐色，難以溶解，CTAB法未能成 功提取到基因組DNA。因此，在提取前，必須對唐古特大黃藥材進行預處理， 如用(TC95。/。的酒精浸泡，或用(TC提取介質I (200mmol/L Tris-HCl,pH8.0， 50mmol/L EDTA pH8.0,0.25mol/LNaCl)浸泡。但是無論用哪種方法對藥材進 行預處理，提取DNA的電泳檢測時均有DNA片斷，但所提取的DNA都有脫 尾現象，說明降解嚴重。另外用Beckman coulter DU640紫外分光光度儀對所 得DNA進行純度檢驗，在260nm及280nm吸光度(A)的比值(A260/A280) 可作為DNA純度的指標，測定用0〔95%的酒精浸泡處理的藥材，所得DNA 提取液的A26o/A28o在1.65-1.83之間；用0"C提取介質I浸泡處理的藥材，所得 DNA提取液的A26o/A28。在1.38-1.57之間，說明所得DNA純度較低。
Komatsu Katsuko(2006)用DNeasyTM Plant Mini Kit(QIAGEN， Germany)
試劑盒對不同來源的大黃藥材提取其基因組DNA，而試劑盒相對來說，成本 高，價格比較昂貴。

發明內容
本發明的目的在於提供一種成本低，提取工藝簡單易行、純度高的從唐古 特大黃藥材提取DNA的方法。
本發明唐古特大黃藥材DNA提取方法，包括以下工藝步驟
(1) 藥材的預處理將唐古特大黃幹藥材用0 4'C的蒸餾水浸泡20 48h， 每隔4h更換一次蒸餾水；以除去儘量多的蒽醌類、多糖和鞣質類等次生代謝 物質。然後切成小碎塊，涼幹備用。提取前用70%乙醇擦洗表面或輕輕刮去表 面的汙染物。
(2) 將經處理的大黃藥材置於研缽中研磨至粉末狀；研磨同時加入大黃 藥材體積2 3% (w/v)的PVP乾粉，目的是有效去除酚類，在研缽中還加入 少許石英砂。
(3) 將研磨好的乾粉轉入離心管中，加入藥材粉末體積5~10倍的提取介 質I和藥材粉末體積0.5 1%的卩-巰基乙醇，在-l-l(TC提取10 15min，以進 一步去除藥材中的次生代謝物質。所述提取介質I是由200mmol/L Tris-HCl(pH8.0)， 50mmol/L EDTA(pH8.0)，0.25mol/LNaCl組成。
(4) 於0 4'C， 2000r/min下離心8 10min，收集沉澱；所得沉澱採用步 驟(3)的工藝繼續提取。
(5) 在收集的沉澱中加入的沉澱體積4~5倍的提取介質II和沉澱體積 0.5~1% 的p-巰基乙醇，在60 65。C下水浴50 60min，不時輕輕搖動；所述 提取介質 II 由 pH8.0 的 100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA,2%(m/V)CTAB,l .4mol/LNaCl混合而成。
(6) 冷卻至室溫，加入反應體系等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒離心管， 抽提後，於0 4-C, 12000r/min，離心8 10min;所述氯仿/異戊醇的體積比為 24:1。
(7) 將步驟(4)離心分離的水相轉入另一離心管，加入水相體積1/10 的CTAB/NaCl，輕輕混勻，再加入水相等體積的氯仿/異戊醇抽提；抽提產物 採用步驟(6)的工藝繼續抽提。所述CTAB/NaCl是由100g/LCTAB， 0.7mol/L NaCl組成；所述氯仿/異戊醇的體積比為24:l。
(8) 在抽提後的水相中加入水相體積1/10、濃度為3mol/L的NaAc和水
相體積2/3的異丙醇，搖勻後於-20。C放置2h 3h;棄去液相，沉澱用75%乙 醇洗滌2 3次，去乙醇自然風千，得大黃DNA;然後用滅菌ddH20溶解DNA， 於0 4'C保存，或於-2(TC下放置長期保存。 整個提取過程要溫和，以防DNA的斷裂。
本發明方法提取的DNA，在電泳檢測時，在23kb處有一條清晰的DNA 條帶，說明所提取的基因組DNA是完整的基因組DNA。
另外，用Beckman coulter DU640紫外分光光度儀對本發明所得DNA進 行純度檢驗，發現在260證及280nm吸光度(A)的比值(A26。/A280)， A260/A280=l.8-2.0之間(比值A260/A280可作為DNA純度的指標，A260/A280=l.8-2.0 之間，意指高純度的DNA)，說明所得DNA純度較高。
以本發明法所得基因組DNA作模板，分別用UBC888和UBC891引物對 藥材基因組DNA進行擴增，能得到條帶清晰的圖譜。
本發明不用試劑盒就能從大黃藥材中提取到高質量的基因組DNA，成本 低，工藝簡單，操作方便。


圖1為採用不同方法從唐古特大黃藥材中所提基因組DNA電泳檢測圖 其中l-2: (TC提取介質I處理藥材 3-4: (TC95。/。酒精處理藥材 5-6:本發明方法提取 7-8:高鹽低pH法 9-10:對藥材不作預處理 M:入DNA/歷"週marker
圖2為引物UBC891對唐古特大黃藥材PCR擴增結果 其中1-2為兩個重複，M為200bp marker
具體實施例方式
1、唐古特大黃藥材DNA的提取 (1)將野外採集唐古特大黃根，每3cm切成一段，用線穿起自然晾乾備用。
取2g唐古特大黃藥材用300ml (TC蒸餾水水浸，每隔4h更換一次蒸餾水， 浸泡24h;然後切成小碎塊，涼幹備用。用前用70%乙醇擦洗表面或輕輕刮去
表面的汙染物。
(2) 取O.lg預處理的唐古特大黃藥材置於加有少許石英砂的研缽中研磨 至粉末狀，研磨的同時加入少許PVP乾粉。
(3) 將研磨好的乾粉轉入2ml離心管，加入lml冰冷的提取介質I (200mmol/L Tris-HCl， pH8.0， 50mmol/L EDTA pH8.0， 0.25mol/L NaCl的
混合液)和10pl(3-巰基乙醇在0。C放置10min。在4。C下2 000r/min離心10min， 收集沉澱，再用提取介質I提取，離心，收集沉澱，合併兩次提取的沉澱。
(4) 在所得沉澱中加入900W 65"C預熱的提取介質II (10Ommol/L Tris扁HCl， pH8.0， 20mmol/L EDTA， pH8.0， 2% (m/V) CTAB， 1.4mol/L NaCl) 和10(1lp-巰基乙醇在65-C下水浴60min，不時輕輕搖動。
(5) 冷至室溫後，加入上述體系等體積的氯仿/異戊醇(體積比為24:1)， 輕輕顛倒離心管抽提10min， 4°C 12 000r/min離心10min，將分離的水相轉入 另一離心管。
(6) 在分離得到的水相中，加入水相體積/1 10的CTAB/NaCl(CTAB/NaCl 是由100g/LCTAB， 0.7mol/LNaCl組成)，輕輕混勻，再加入水相等體積的氯 仿/異戊醇(體積比為24:1)抽提。
(7) 在抽提後的水相中加入1/10體積3mol/L的NaAc (pH5.2)和水相 體積2/3的冰冷異丙醇，搖勻後於-2(TC放置2h 3h。棄去液相，沉澱用75% 乙醇洗滌2 3次，去乙醇自然風乾。用滅菌ddH20溶解DNA， 4'C保存，或 -2(TC下放置長期保存。
2、唐古特大黃藥材DNA的ISSR-PCR擴增
將上述提取的大黃藥材DNA，用蒸餾水稀釋20倍，用於ISSR-PCR擴 增，以驗證DNA純度是否能用於PCR擴增等後續工作。 唐古特大黃藥材DNA的ISSR-PCR擴增的具體方法 20pL反應體系包括
10xbuffer (15mmol/LTris-HCl,75mmol/LKCl)): 2.5pL
Mgcl2: 1.25mmol/L
%《DNA polymerase:0.9U
dNTP:0.125 mmol/L
Primer: 0.5fimol/L
Template: 20ng
加超純水至20pL
擴增反應在DyadDisciple Peltier Thermal Cycler型PCR儀上進行。 先94。C預變性5min，然後94。C變性20s， 55。C復性60s， 72"延伸80s，
38個循環最後72'C延伸6min， 4"保存。
擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5pg/mlEB)中電泳，電泳緩衝液為
lxTAE,電壓3-5V/cm， UVP Biolmaging System紫外成像系統拍照記錄電泳結果。
3、結果與分析
本發明方法提取的DNA，在電泳檢測時，在23kb處有一條清晰的DNA 條帶，說明所提取的基因組DNA是完整的基因組DNA。
另外，用Beckman coulter DU640紫外分光光度儀對本發明所得DNA進 行純度檢驗，發現在260nm及280nm吸光度(A)的比值(A26。/A280)， A26o/A280=l .8-2.0之間(比值A26o/A2so可作為DNA純度的指標，A260/A280=l .8-2.0 之間，意指高純度的DNA)，說明所得DNA純度較高。
以本發明法所得基因組DNA作模板，分別用UBC888和UBC891引物對 藥材基因組DNA進行擴增，能得到條帶清晰的圖譜，結果見圖2。
權利要求
1、一種唐古特大黃藥材DNA提取方法，包括以下工藝步驟(1)藥材的預處理將唐古特大黃幹藥材用0～4℃的蒸餾水浸泡20～48h，然後切成小碎塊，涼幹備用；(2)將經處理的大黃藥材置於研缽中研磨至粉末狀；(3)將研磨好的乾粉轉入離心管中，加入藥材粉末體積5～10倍提取介質I和藥材粉末體積0.5～1％的β-巰基乙醇，於-1～10℃提取10～15min；所述提取介質I由200mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L EDTA(pH8.0)，0.25mol/LNaCl組成；(4)於0～4℃，2000r/min下離心8～10min，收集沉澱；(5)在離心分離的沉澱中加入的沉澱體積4～5倍的提取介質II和沉澱體積0.5～1％的β-巰基乙醇，在60～65℃下水浴50～60min；所述提取介質II由pH8.0的100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，2％(m/V)CTAB，1.4mol/LNaCl混合而成；(6)冷卻至室溫，加入反應體系等體積的氯仿/異戊醇抽提後，於0～4℃，12000r/min，離心8～10min；所述氯仿/異戊醇的體積比為24∶1；(7)將步驟(4)離心分離的水相轉入另一離心管，加入水相體積1/10的CTAB/NaCl，輕輕混勻，再加入水相等體積的氯仿/異戊醇抽提；所述CTAB/NaCl是由100g/L CTAB，0.7mol/L NaCl組成；所述氯仿/異戊醇的體積比為24∶1；(8)在抽提後的水相中加入水相體積1/10、濃度為3mol/L的NaAc和水相體積2/3的異丙醇，搖勻後於-20℃放置2h～3h；棄去液相，沉澱用75％乙醇洗滌2～3次，去乙醇自然風乾，得大黃DNA；然後用滅菌ddH2O溶解DNA，於0～4℃保存，或於-20℃下放置長期保存。
2、 如權利要求書1所述唐古特大黃藥材DNA提取方法，其特徵在於 所述預處理工序中，將幹藥材用蒸餾水浸泡中，每隔4h更換一次蒸餾水。
3、 如權利要求書1所述唐古特大黃藥材DNA提取方法，其特徵在於 所述預處理後的藥材，提取前用70%乙醇擦洗表面或輕輕刮去表面的汙染物。
4、 如權利要求書1所述唐古特大黃藥材DNA提取方法，其特徵在於-所述步驟(2)中，研磨的同時加入大黃藥材體積2 3n/。的PVP乾粉；
5、 如權利要求書1所述唐古特大黃藥材DNA提取方法，其特徵在於: 步驟(4)所得沉澱採用步驟(3)的工藝繼續提取。
6、 如權利要求書1所述唐古特大黃藥材DNA提取方法，其特徵在於: 所述步驟(7)中的抽提產物，採用步驟(6)的工藝繼續抽提。
全文摘要
本發明提供一種從唐古特大黃藥材提取DNA的方法，該方法是將唐古特大黃幹藥材用蒸餾水浸泡24h後，切成小碎塊，晾乾，研磨至粉末；再將藥材粉末用提取介質I和β-巰基乙醇進行提取，然後再用提取介質II和β-巰基乙醇進行提取，產物由氯仿/異戊醇抽提後，水相加入NaAc(pH5.2)和冰冷的異丙醇使DNA沉澱，棄去液相，沉澱用75％乙醇洗滌2～3次，去乙醇自然風乾；用滅菌ddH2O溶解DNA，4℃保存或-20℃下放置長期保存。經電泳檢測，提取的大黃藥材DNA是完整的基因組DNA，純度較高(A260/A280＝1.8-2.0之間)。所得基因組DNA作模板，分別用UBC888和UBC891引物對藥材基因組DNA進行擴增，能得到條帶清晰的圖譜。
文檔編號C07H1/00GK101358188SQ20081015022
公開日2009年2月4日 申請日期2008年6月25日 優先權日2008年6月25日
發明者毅 李, 建 楊, 莉 王, 胡延萍, 謝小龍 申請人:中國科學院西北高原生物研究所