重組人幹擾素γ在製備抗病毒藥物中的應用的製作方法

2023-10-05 12:14:19 2

專利名稱：：重組人幹擾素γ在製備抗病毒藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術，具體涉及重組人擾素Y在製備抗病毒藥物中的應用。
背景技術：
：幹擾素Y是Wheelock於1965年發現的，也稱為免疫幹擾素，是由有絲分裂原或外來抗原誘導的T淋巴細胞產生，具有較強的免疫調節功能，能增強抗原遞呈細胞功能，加快免疫複合物的清除和提高吞噬異物功能，對淋巴細胞具有雙向調節功能，提高抗體依賴的細胞毒反應，增強某些免疫活性細胞HLA-II類抗原表達。它的生物活性主要包括1、抑制細胞增殖作用幹擾素Y對細胞有直接抑制作用，而且對分裂迅速的細胞有選擇性抑制。2、免疫調節作用可以激活效應細胞，增加B細胞抗體產生和單核細胞的細胞毒性；增強免疫細胞表面抗原和受體的表達；刺激其他細胞因子的產生。天然幹擾素Y的分子量為3.5—7.0萬，這是由於糖基化程度不同和形成聚合體的結果。重組人幹擾素Y是採用基因工程技術，由含有高效表達人幹擾素Y基因的大腸桿菌，經發酵、分離和高度純化所得。與天然幹擾素Y相比，有同等的生物活性。另外，也有人認為幹擾素Y具有抗病毒作用，它通過細胞基因組編碼的一些蛋白質來發揮作用。當幹擾素Y與細胞接觸時，它首先與耙細胞表面結合，然後進入細胞，誘導基因組合成抗病毒蛋白。但是，目前重組人幹擾素Y臨床治療的適應症為類風溼性關節炎和肝纖維化，並無其它適應症的報導。現代醫學認為生殖器皰疹和單純皰疹是由單純皰疹病毒(HSV)感染所致的一種病毒性傳播疾病，其中生殖器皰疹是最常見的性傳播疾病之一。尖銳溼疣和扁平疣是由人乳頭瘤病毒(HPV)感染引起的傳染性疾病，尖銳溼疣主要通過性傳播，近年來臨床發病率呈上升趨勢。目前臨床上採用的常規治療方法有一定的治療效果，但不能消除尖銳溼疣的復發。此前曾有文獻報導，國外應用幹擾素a及幹擾素e聯合其它療法治療尖銳溼疣有效，但目前為止沒有任何報導表明幹擾素y亦有同樣效果。
發明內容本發明要解決的技術問題在於研究重組人幹擾素y(rhIFN-y)對某些病毒的抑制作用，設計製備抗病毒藥。本發明提供了重組人幹擾素y在製備抗病毒藥物中的應用。此項發明中，本發明人應用重組人幹擾素y對單純皰疹病毒(HSV)進行了體內外藥效學實驗研究，結果表明，重組人幹擾素y對HSV病毒有確切療效。其作用機理為，重組人幹擾素y作用於細胞後，促使誘導基因組合成抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白可以抑制病毒在細胞內的複製，增加NK細胞的活性及其它免疫調節作用，有效地遏制病毒感染的發生。本發明人在重組人幹擾素y體內對豚鼠皮膚感染HSV-1的藥效學實驗中，HSV-1感染豚鼠皮膚後肌注重組人幹擾素y，重組人幹擾素y3x105—7.5x104IU/kg劑量對豚鼠皮膚感染HSV-1有抑制作用，且與等量重組人幹擾素a2a作用強度相當。重組人幹擾素y在體外細胞培養中對HSV-1、HSV-2的抑制試驗中，重組人幹擾素y及對照藥重組人幹擾素a2a對HSV-1、HSV-2質控株及HSV-1、HSV-2臨床株分别致HEK-293細胞株病變的半數抑制濃度(IC5。，IU/ml)分別為613.84、953.62、688.85、866.29及701.32、1097.26、692.25、1060.49，提示rhIFN-y體外對HSV-1、HSV-2質控株及臨床株致HEK-293細胞株病變有抑制作用，其效價較對照藥rhIFN-a2a接近或稍高。標準抗HSV藥物ACV20.0Ug/ml對HSV-1、HSV-2質控株抑制率分別為90%及85%，表明本試驗系統處於正常反應狀態。由於目前國內外均未對人乳頭瘤病毒(HPV)建立起可行的藥效學研究模型，而HPV與HSV同屬於DNA病毒，重組人幹擾素Y對DNA病毒的作用機理是一致的，結合以上重組人幹擾素y對HSV病毒的體內外藥效學研究結果，本發明人認為，重組人幹擾素Y對HPV病毒具有同樣療效。綜上所述，重組人幹擾素Y對於單純皰疹病毒確有良好效果，因此，重組人幹擾素y可用於製備抗病毒藥物，尤其是治療生殖器皰疹、單純皰疹、尖銳溼疣、扁平疣等抗病毒藥物。本發明提供的重組人幹擾素Y可與藥用輔料按常規方法製成注射劑(包括注射液及注射用無菌粉末)。本發明提供的重組人幹擾素Y在醫學上新用途，將對治療病毒引起的疾病，尤其是由單純皰疹病毒感染所致的生殖器皰疹及單純皰疹，以及人乳頭瘤病毒感染引起的生殖器尖銳溼疣及扁平疣有治療作用，擴大了在臨床的應用，也對治療該類病症帶來新的機制。具體實施例方式實例一重組人Y-幹擾素在體外細胞培養中對HSV-1和HSV-2的抑制作用1.摘要重組人？幹擾素及對照藥重組人幹擾素a2a對HSV-1、HSV-2質控株及HSV-l、HSV-2臨床株分别致HEK-293細胞株病變的半數抑制濃度(IC5o、IU/ml)分別為613.84、953.62、688.85、866.29及701.32、1097.26、692.25、1060.49，提示兩藥對HSV-1的作用強於對HSV-2的作用。標準抗HSV藥ACV20.0^ig/ml對HSV-1、HSV-2質控株抑制率分別為90%及85%，表明本試驗系統處正常反應狀態。2.試驗目的以抗HSV-1、HSV-2質控株及臨床株致體外培養的HEK-293細胞株病變為指標，檢測重組？幹擾素體外抗病毒活性及其效價，以此預測其抗HSV感染的可能性，按其抗HSV的活性、和幹擾素的廣譜抗病毒特性可以認為本重組Y-幹擾素也具有抗其它病毒的活性。3.試驗材料3.1藥物3.1.1受試藥物3丄L1名稱重組人Y-幹擾素(rhIFN-力。3丄1.2提供單位上海克隆生物高技術有限公司。3.1.1.3編號或批號990321。3丄1.4含量、效價、製劑標示量100萬IU/支(比活性1.4xl07IU/mg)，凍乾粉。3丄1.5溶劑2。/。小牛血清RPMI1640培養基。3丄1.6配製方法以lml上述培養基稀釋成100萬IU/ml原液，待用。3丄2對照藥(l)3丄2.1名稱注射用重組人幹擾素rhlFN-a2a(迪恩安)。3.1.2.2提供單位遼寧衛星生物製品研究所。3.1.2.3編號或批號990701-1。3丄2.4含量、效價、製劑標示量100萬IU/支，凍乾粉。3丄2.5溶劑2。/。小牛血清RPMI1640培養基。3丄2.6配製方法以lml上述培養基稀釋成100IU/ml。3丄2.7選擇依據上市產品，比較兩型rhIFN產品體外相對效價。3丄3對照藥(2)3丄3.1名稱阿昔洛韋(ACV)。3丄3.2提供單位潛江製藥廠。3丄3.3編號或批號9905043。3丄3.4含量、效價、製劑標示量甘泰注射液、250mg/瓶、粉劑。3丄3.5溶劑生理鹽水(NS)。3丄3.6配製方法以5mlNS稀釋成50mg/ml原液，待用。3丄3.7選擇依據已知抗選擇性抗皰疹病毒藥、對HSV有效、為檢驗本實驗系統可靠性。3.2細胞3.2.1類型人胚腎-293傳代細胞株(HEK-293細胞)。3.2.2提供單位中國科學院細胞生物研究所細胞庫。3.3病毒3.3.1株、型HSV-1型Sm44株、HSV-2型333株、HSV-1型臨床分離株、HSV-2型臨床分離株。3.3.2提供單位HSV-l、HSV-2質控株(衛生部生物製品藥品檢驗所)。HSV-1臨床株(中國醫學科學院皮膚病研究所)。HSV-2臨床株(南京醫科大學)。3.4培養基3.4.1種類RPMI1640培養基。3.4.2提供單位GIBCO/BRL。4.試驗方法4.1種類體外試驗。4.2內容體外細胞培養檢測藥物抗病毒活性和效價。4.3選擇依據按《新藥(西藥)臨床前指導原則彙編》P163~168執行。5.劑量設置和給藥方法5.1受試藥rhIFN-Y。5.1.1劑量組終濃度2000、1000、500、250、125IU/ml五個濃度。5丄2途徑體外加於細胞培養瓶中。5.2對照藥(l):注射用rhlFN-a2a5.2.1劑量組終濃度為2000、1000、500、250、125IU/ml五個濃度。5.2.2途徑體外加於細胞培養瓶中。5.3阿昔洛韋(ACV)5.3.1劑量終濃度20昭/ml。5.3.2途徑體外加於細胞培養瓶中。6.試驗主要步驟6.1病毒毒力測定6丄10.5ml病毒懸液分別接種生長良好、呈單層的HEK-293細胞培養瓶內，吸附1小時後倒去，補充維持液繼續培養。6丄2至75%以上細胞單層出現明顯細胞病變後洗脫細胞，並反覆凍融3次，離心，收集上清液作病毒毒力測定。6丄3用培養液對上述病毒上清液作10倍或5倍稀釋，接種到已長成單層細胞的10ml培養瓶中，每個稀釋度3瓶，病毒吸附同上，然後換加維持液，37'C繼續培養，培養20~24小時後觀察細胞病變情況。6丄4計數方法用0.5mm網格形測微計置於目鏡內，網格內分100個小方格，移動培養瓶，選擇2個網格，共計數2oo個小方格，計出病變細胞(py正常細胞+病變細胞(N+P)的比率，以3瓶共6個網格計數之和，求出P的百分率。6.1.5TCID5Q計算，病毒半數感染劑量TCID5D計算，按Reed和Muencl法常規。6.2藥物對HEK-293細胞毒性測定6.2.1藥物濃度首管3.2萬IU/ml，對倍稀釋至所需濃度，現配現用。6.2.2細胞選擇生長良好的單層HEK-293細胞，加上含藥的維持液，37。C繼續培養，逐日觀察細胞生長情況，連續一周，以7日結果判斷。6.3抗病毒試驗6.3.1指標病毒接種量為610倍TCIDso，接種於長成單層細胞的培養瓶中，每瓶加入0.3ml病毒液，平行3瓶。吸附時間45分鐘後，再換成含不同濃度藥液或空白維持液，繼續培養約2048小時，以無藥對照瓶細胞病變率達98%左右時中止培養，計數各瓶細胞病變率，計數方法同6.1病毒毒力測定。以N/N+PxlOO。/。計算藥物抑制百分率。上述試驗重複3次，合併計算。7.判斷方法7.1指標定量指標。7丄1病毒毒力測定計算TCID5Q。7丄2藥物對細胞毒性計算TC,TCo。7丄3藥物對病毒作用觀察細胞病變(CPE)、計算ICso及TI。7.2觀察時間7.2.1病毒毒力測定20小時。7.2.2藥物對細胞毒性測定以觀察7日結果為準。7.2.3藥物對病毒作用20-30小時，以無藥對照組病變達98%左右時中止培養。8.計算方法與統計方法8.1計算方法用直線回歸方程，求IC50。8.2統計方法相關係數的顯著性測驗。9.試驗結果9.1病毒毒力測定結果-表1各型HSV對HEK-293的毒力(TCIDso)測定tableseeoriginaldocumentpage9〉50%病變百分數一50距離比=-〉50%病變百分數一320，00020,0000100010001000訓0空白01001990100010009.3rhIFN-Y與rhIFN-a2a及ACV對各型HSV致HEK-293細胞病變的抑制作用表3-lHSV-1(Sm44)株實驗各次實驗病變細胞(P)和正常細胞(N)的比例抑制直線回歸方藥物藥物濃度-123累計率程及rc5\1VJ/1111/—PNPNPNPN(%)(IU/ml)20001585128811893826287y=29.375+100023772278188263237790'0336x50037634060495112617458n=5,P<0.05250653564367129200腦33r=0.88901257624762487132396120IC50=613.8420002575118920805624481y=28.75+100032682278277381219730錢3xrWFN-a2a50048523961534714016053n=5,P<0.0525059416238752519610435r=0.89441257723792187132435719IC50=701.32ACV20嗎128811897933027090tableseeoriginaldocumentpage11表3-2HSV-2(333)株實驗tableseeoriginaldocumentpage11表3-3HSV-1(臨床)株實驗tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12表3-4HSV-2(臨床)株實驗tableseeoriginaldocumentpage12formulaseeoriginaldocumentpage12formulaseeoriginaldocumentpage12HSV-2(333)株，formulaseeoriginaldocumentpage13HSV-l(臨床分離)株，formulaseeoriginaldocumentpage13HSV-2(臨床分離)株，formulaseeoriginaldocumentpage1310.試驗結論rhIFN-Y體外對HSV-l、HSV-2質控株及臨床株致HEK-293細胞株病變有抑制作用,其效價較對照藥rhIFN-a2a接近或稍高。本系統對標準抗HSV藥ACV反應正常。實例二重組人Y-幹擾素體內對豚鼠皮膚感染HSV-l的藥效1.摘要注射用重組人Y-幹擾素3xl05~7.5xl04lU/kg劑量對豚鼠實驗性HSV-l皮膚感染有抑制作用，3xl05IU/kg與等劑量的迪恩安作用強度相當。2.試驗目的用HSV-l感染豚鼠皮膚後每日肌注重組Y-幹擾素，並用重組a-幹擾素作對照，檢測本製劑體內有無抗HSV活性及其效價，按幹擾素廣譜的抗病毒特性，推測其對其它病毒感染的可能效果。3.試驗材料3.1藥物(製劑)3丄1受試製劑3丄1.1名稱注射用重組人？幹擾素(rhIFN-力。3丄1.2提供單位上海克隆生物高技術有限公司。3丄1.3編號或批號990321。3丄1.4製劑標示量100萬IU/支，比活性1.4xl07IU/mg，凍乾粉。3丄1.5溶劑滅菌注射用水。3丄1.6配製方法用滅菌注射用水分別配製成3xl05、1.5x105、7.5x104、3.75xl04/ml，每次用藥新鮮配製。3丄2對照製劑3丄2.1名稱迪恩安。3.1.2.2批號990701-1。3丄2.3提供單位遼寧衛星生物製品研究所，100萬IU。3丄2.4選擇依據為上市產品，比較兩型rfiIFN產品體-內相對效價。3.2細胞3.2.1類型Vero細胞。3.2.2提供單位中國科學院細胞生物研究所細胞庫。3.3病毒3.3.1型、株HSV-l型Sm44株。3.3.2提供單位衛生部生物製品藥品檢驗所。3.4動物3.4.1種屬、品系、來源、合格證白化豚鼠，中國藥科大學實驗動物中心，蘇動環字第97004號，蘇動質字第97004號。3.4.2體重250~300g。3.4.3性別3、？不論。3.4.4各組動物數每次試驗用56組，每組46隻，共3次試驗。4.試驗方法4.1種類體內試驗。4.2內容豚鼠皮膚感染HSV-1後，用不同濃度的重組Y-幹擾素處理，以評分法判斷藥物的藥效，並以迪恩安為對照藥。4.3選擇依據按《新藥(西藥)臨床前指導原則彙編》P163168執行。5.劑量設置和給藥方法5.1受試藥rhIFN-y。5丄1劑量組3xl05、1.5x105、7.5x104、3.75xl04IU/kg四個濃度。5丄2途徑肌肉注射，每100g豚鼠注射0.1ml。5丄3給藥方法在感染2小時後腿肌肉注射，1天1次，連續8天。5.2對照藥rhlFN-a2a(迪恩安)。5.2.1劑量組均為3xl05IU/kg。5.2.2途徑同受試藥。5.2.3給藥方法同受試藥。6.試驗主要步驟6.1病毒毒力測定6丄1病毒上清液準備，同體外試驗(見實驗一、6.1項)。6.1.2用原液及10倍稀釋至10—1~l(T3四個濃度，以0.05ml接種於豚鼠井形劃痕皮膚上，觀察48天左右，以出現皮膚損害為致病。6.2體內抗病毒試驗6.2.1豚鼠皮膚準備及病毒接種豚鼠背中部兩側皮膚用剪刀及腋毛剃刀剃毛約4)4cm區，用銳器作井字形劃破見出血點，每側各接種能引起100%致病率的病毒液0.05ml，逐日觀察和記錄病變情況。6.2.2觀察指標病毒接種部位出紅斑、水皰、硬結、糜爛以及消退後結痂。7.判斷方法7.1指標及評分7丄l病毒毒力測定以出現紅斑及皰損害為致病指標，確定能引起動物100%致病的病毒稀釋度作藥物抗病毒試驗。7丄2藥物抗病毒試驗的皮膚病變評分標準0:正常，無病變0.5:微紅1:紅斑，或伴皮損消退時結痂2:紅斑、水皰，或伴皮損消退時結痂3:紅斑、硬結，或帶有糜面4:紅斑、硬結擴大，或帶水皰或糜面7.2觀察時間7.2.1病毒毒力測定連續觀察10天，觀察自然病程，在d4出現典型病變為致病。7.2.2藥物抗病毒試驗連續觀察到第10天，直至基質對照組病變自然消退為止。8.計算方法與統計方法8.1計算方法求每組每鼠雙側皮損評分平均值及標準誤差。8.2統計方法t檢驗。9.試驗結果9.1病毒致病毒力測定結果表l接種不同濃度HSV-1稀釋液於豚鼠劃痕皮膚的發病情況病毒稀釋度動物數/皮損數致病皮損數致病率(％)原液5/10101000,15/107700.015/106600.0015/10110空白液對照5/1000表2不同濃度的重組Y幹擾素，迪恩安對豚鼠實驗性HSV-1皮膚感染的藥效序藥物濃度動物數/感染第4天起皮膚病變評分值(X±S)號(IU/mg)皮損數d4d5d6d7d81空白對照注射用水4/82,63±0.4811.94±0.3391.47±0.2971.38±0.4810,59±0.359迪恩安3xl054/82.25***±0.481159***±0,3591.19*±0.5091.13*±0,4810.44±0.421Y-幹擾素3xl054/82.06*±0.608163***±0,4361.16**土0.5151,03*±0.5320.25**±0.518Y-幹擾素1.5xl054/82.31*±0.4811.72*±0.4981.19*土0.5091,09*±0.4330.44±0.518Y-幹擾素7.5x1044/82.38*±0.4811.69*±0.5061.19"土0.4691.0**±0.5180.47±0.583Y-幹擾素3.75x1044/82.470"±0,2911,967"±0.2971.469"±0,2971.438"±0.4210.594*±0.3592空白對照注射用水5/102.48±0.2562.40±0,4592.30±0.4431.53±0.4301.0±0,452迪恩安3xl055/102.25,±0.364195***±0.6071.75*±0.5781.15*±0.4900.8*±0.509y-幹擾素3xl055/102.25*"±0.468±0.579±0.5091.15***±0.4900.85*士0.4卯Y-幹擾素1.5x1055/102.20,±0.1472.20*±0.509±0.468±0.4210.925±0.487，幹擾素7.5x1045/102.20***±0.4652.20**±0.443l細"*±0.3761.15***±0.4590.90±0.417，幹擾素5/102.53*±0.2812,28*±0.4682.25*"±0.4081.53±0.3760.90±0.418tableseeoriginaldocumentpage17與陽性對照迪恩安比':PO.05":PO.01PO細表3不同濃度的重組y幹擾素，迪恩安對豚鼠實驗性HSV-1皮膚感染三次試驗合併結果tableseeoriginaldocumentpage17統計學符號同表2。IO.試驗結論AIFN-Y對豚鼠實驗性HSV-1皮膚感染有抑制作用，與等量rhIFN-ct2a作用強度相當權利要求1、一種重組人幹擾素γ在製備抗病毒藥物中的應用。2、根據權利要求1所述的一種重組人幹擾素Y在製備抗病毒藥物中的應用，其特徵在於所述的抗病毒藥的治療病症為生殖器皰疹、單純皰疹、尖銳溼疣或扁平疣。3、根據權利要求1所述的一種重組人幹擾素Y在製備抗病毒藥物中的應用，其特徵在於所述藥物為重組人幹擾素Y與藥用輔料製成的注射劑，包括注射液及注射用無菌粉末。全文摘要本發明提供了重組人幹擾素γ在製備抗病毒藥物中的應用。本發明在重組人γ-幹擾素體內對豚鼠皮膚感染單純皰疹病毒(HSV)的藥效學實驗中，顯示其3×105-7.5×104IU/kg劑量即有抑制作用；在體外細胞培養中對HSV-1、HSV-2的抑制試驗中重組人γ-幹擾素有抑制作用。本發明對製備抗病毒藥，尤其是治療生殖器皰疹、單純皰疹、尖銳溼疣和扁平疣的藥物有較大應用價值。文檔編號A61K9/14GK101396554SQ20071004638公開日2009年4月1日申請日期2007年9月25日優先權日2007年9月25日發明者穎厲,周永春申請人:上海克隆生物高技術有限公司;上海復星醫藥(集團)股份有限公司