病原微生物dna的提取方法
2023-10-05 00:12:59 4
專利名稱：：病原微生物dna的提取方法病原微生物DNA的提取方法
技術領域：
本發明涉及的是一種病原微生物DNA的提取方法，屬微生物化學中分離DNA的
技術領域：
背景技術：
分子生物學技術的廣泛應用有力促進了微生物快速診斷技術的發展，改變了傳統病原微生物鑑定需經過分離培養、生化反應與血清疑集等一系列操作複雜耗時長久的實驗，傳統方法已遠遠不能適應突發公共衛生事件應急處理要求。在病原微生物各種快速鑑定技術中，實時螢光PCR技術是目前國際上公認的最靈敏、特異、重複性最好的核酸定性、定量檢測方法，已廣泛應用於突發公共衛生應急處理中病原微生物的檢測。但現有的實時螢光PCR模板製備即病原微生物DNA提取方法所需時間都在30分鐘以上，其中目前最先進的柱式核酸提取法用於細菌與病毒DNA提取需10個步驟共計40~60分鐘時間；經典的煮沸裂解法用於細菌DNA^是取需菌液濃縮、裂解與分離3個步驟，需30~35分鐘，用於病毒DNA提取可省去濃縮，需20~25分鐘。所以如何」提高病原微生物DNA提取速度是當前急需解決的技術問題。
發明內容針對上述不足，本發明為解決上述技術問題提出一種新的快速的病原微生物DNA的提取方法。本發明提供的病原微生物DNA的提取方法，用於細菌DNA提取時，先取樣品懸浮液上清lml放入1.5ml的微量離心管中在15000r/min轉速條件下離心lmin,然後倒去上清後加入5(M提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中7K浴2min,再在15000r/min轉速條件下離心lmin，最後移取上清即為病原孩￡生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9%的NaCl、重量體積百分比為0.01%的SDS、體積百分比為0.1%的P-巰基乙醇、其餘為水構成。SDS為十二烷基硫酸鈉的縮寫。本發明提供的病原微生物DNA的提取方法，用於病毒DNA提取時，先取樣品懸浮液上清5(W放入1.5ml的微量離心管中，然後加入5(Vl提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中水浴2min,再在15000r/min轉速條件下離心lmin,最後移取上清即為病原微生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9°/。的NaCl、重量體積百分比為0.01%的SDS、體積百分比為0.1%的|3-巰基乙醇、其餘為水構成。以上方法中提取細菌DNA或病毒DNA的第一步的不同是因為對於細菌來說，離心可以使它們濃縮，而對於病毒來講，離心方法尚不能使它們濃縮，所以在提取病毒DNA時不用濃縮一步而直接採用樣品上清進行提取。本發明提供的病原微生物DNA的提取方法，用於細菌DNA提取需45分鐘，用於病毒DNA提取需3~4分鐘。使提取時間從現有技術需要30分鐘以上縮短至5分鐘以內。與實時螢光PCR技術配合可在15~30分鐘內完成病原菌的診斷檢測。經實際試用，本發明方法的效果不低於現有技術的煮沸裂解法、柱式核酸提取試劑盒的效果，並略勝於某些品牌的柱式核酸提取試劑盒的效果，而且操作十分簡便、成本低廉。本發明提供的病原微生物DNA的提取方法，使實時螢光PCR的檢測速度有了質的飛越，對今後食物中毒、傳染病爆發等突發公共衛生事件的病原菌快速診斷具有重要的應用價值，為正確制訂突發公共衛生事件的處置方案、及時採取針對性控制措施、臨床病人搶救治療及預後評估提供科學依據。具體實施方式以糞便為樣品的實時螢光PCR模板製作，即糞侵_樣品病原微生物DNA的提取過程是1、取糞便懸浮液上清lml放入1.5ml的微量離心管中，在離心機中以15000r/min的轉速離心lmin;2、倒去上清加入50jnl以9gNaCl、0.1gSDS、lmlP畫巰基乙醇配製成1000ml水溶液為提取劑混勻，置沸水中進行水浴2min;3、在離心才幾中以15000r/min的轉速離心lmin，移取上清即為該糞4更樣品中病原孩i:生物的DNA溶液。以上共用時不足5min。以本發明方法提取的病原微生物DNA與其他方法提取的病原微生物DNA經實時螢光PCR後用結果比較其效果，比較時按上例重複三次獲得三管DNA溶液一、比較用病原微生物進行病原微生物DNA的提取以金黃色葡萄球菌(ATCC26112)、副溶血弧菌(ATCC17802)、腸出血型大腸埃希菌(0157:H7)(DEL933)、B型肝炎病毒(HBV)與白斑綜合症病毒(WSSV)為樣品，提取過程按本發明方法進行。每個樣品重複三次各得三管DNA溶液。二、用比較方法對同一樣品進行病原孩i生物DNA的提取柱式核酸提取試劑盒分別採用QIAGEN公司生產的MiniKit(批號74104)、日本Takara公司生產的DV801A、DV818並按試劑盒說明書對上述樣品進行操作。每個樣品重複三次各得三管DNA溶液。煮沸裂解法提取劑選用上海之江生物科技有限公司產品並按其說明書對上述樣品進行操作。每個樣品重複三次各得三管DNA溶液。三、DNA實時螢光PCR法測定吸每管DNA溶液2nl進行實時螢光PCR,取實時螢光PCR的ct值(每個反應管內的螢光信號到達設定閥值時所經歷的循環數)作為提取效果的評價指標。DNA實時螢光PCR基礎試劑盒為日本Takara公司生產DRR039s、特異性引物與Taqman探針由大連寶生物工程有限公司製作，LightCycler實時螢光PCR儀購自瑞士羅氏公司。實時螢光PCR反應條件:按試劑盒DRR039s說明書要求進行95。C預變性10s，然後95。C5s,60°C20s擴增40個循環，共計25分鐘。四、三種方法的提取效果比較1、對用QIAGEN柱式核酸提取試劑盒法、煮沸裂解法與本發明方法提取的白斑綜合症病毒的DNA提耳又液和副溶血弧菌的DNA提取液進行實時螢光PCR,取ct值作比較參數，結果顯示三種方法對同一種病原菌的擴增曲線形態、靈敏度與重複性均高度一致，詳見表l、表2。表l:白斑綜合症病毒(拷貝數5x107/ml)的三種方法提取效果比較tableseeoriginaldocumentpage5表2:副溶血弧菌(菌落數5xl03/ml)的三種方法提取效果比較tableseeoriginaldocumentpage02、對用本發明方法與用TaKaRa柱式核酸提取試劑盒提取的白斑綜合症病毒的DNA提取液與0157:H7的DNA提取液進行實時螢光PCR,結果顯示前法略優於後法，詳見表3、表4。表3:白斑綜合症病毒(拷貝數5x107/ml)的兩種方法提取效果比較tableseeoriginaldocumentpage0表4:0157:H7(菌落數5x107/ml)的兩種方法提取效果比較tableseeoriginaldocumentpage03、對用本發明方法與煮沸裂解法提取的金黃色葡萄球菌的DNA提取液、0157:H7的DNA提取液以及HBV的DNA提耳又液進行實時螢光PCR,經統計分析結果顯示兩種方法的擴增曲線形態一致，說明本發明方法對不同結構的病原微生物DNA的提取效果與經典的煮;弗裂解法具有相同效果。詳見表5、表6、表7。表5:金黃色葡萄球菌(菌落數5x108/ml)的兩種方法提取效果比較tableseeoriginaldocumentpage0表6:0157:H7(菌落數5xl07/ml)的兩種方法提取效果比較tableseeoriginaldocumentpage7權利要求1、一種病原微生物DNA的提取方法，其特徵是用於細菌DNA提取時，先取樣品懸浮液上清1ml放入1.5ml的微量離心管中在15000r/min轉速條件下離心1min，然後倒去上清後加入50μl提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中水浴2min，再在15000r/min轉速條件下離心1min，最後移取上清即為病原微生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9％的NaCl、重量體積百分比為0.01％的SDS、體積百分比為0.1％的β-巰基乙醇、其餘為水構成。2、一種病原微生物DNA的提取方法，其特徵是用於病毒DNA提取時，先取樣品懸浮液上清50nl放入1.5ml的微量離心管中，然後加入5(Vl提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中水浴2min,再在15000r/min轉速條件下離心lmin，最後移取上清即為病原微生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9%的NaCl、重量體積百分比為0.01%的SDS、體積百分比為0.1%的P-巰基乙醇、其餘為水構成。全文摘要本發明提供的病原微生物DNA的提取方法，先取樣品濃縮液加入50μl提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中水浴2min，再在15000r/min轉速條件下離心1min，最後移取上清即為病原微生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9％的NaCl、重量體積百分比為0.01％的SDS、體積百分比為0.1％的β-巰基乙醇、其餘為水構成。本發明提供的病原微生物DNA的提取方法，提取DNA時間僅需3～5分鐘。使提取時間從現有技術需要30分鐘以上縮短至5分鐘以內。經實際試用，本發明方法的效果不低於現有技術且略有勝出，而且操作十分簡便、成本低廉。文檔編號C07H21/04GK101402663SQ20081012131公開日2009年4月8日申請日期2008年10月6日優先權日2008年10月6日發明者王建躍,王忠發,薛超波申請人:舟山市疾病預防控制中心