蓮草直胸跳甲tubulin基因轉錄水平螢光定量PCR檢測試劑盒的製作方法
2023-10-05 01:42:34 1
蓮草直胸跳甲tubulin基因轉錄水平螢光定量PCR檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種蓮草直胸跳甲tubulin基因轉錄水平螢光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒由SYBRPremixExTaqTM、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水組成。本發明實現了方便快捷的檢測tubulin基因轉錄水平的目的。本發明在檢測基因轉錄水平方面具有靈敏度高、穩定性好、實驗成本低的優點。
【專利說明】蓮草直胸跳甲tubu I in基因轉錄水平螢光定量PCR檢測試 劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種蓮草直胸跳甲微管蛋白（tubulin)基因轉錄水平的螢光定量PCR 檢測試劑盒，屬於分子生物學領域。
【背景技術】
[0002] 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR)，即DNA體外擴增技術，是 1985年由美國Mullis首創的一種生物高技術，隨著耐高溫的Taq酶的出現，擴增自動化的 完善，PCR近年得以迅速推廣，它僅需要微微克水平的模板就能快速特異大量地複製任何所 希望的基因或DNA片斷。
[0003] 螢光定量PCR是一種核酸定量技術，該技術在PCR反應系統中引入了特定的螢光 標記物質，通過檢測每個熱循環後PCR反應體系中的螢光值的變化情況來實時監測DNA的 擴增情況，並獲得每個樣本的螢光定量變化曲線，從而獲得每個反應管的Ct值(螢光變化 達到閾值時的循環數)，以起始模板數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標製備標準曲線，據 此標準曲線和各個標本的Ct值對每個反應的起始DNA模板數進行定量測定。
[0004] SYBR Green是一種結合於雙鏈DNA小溝中的結合染料。利用螢光染料（SYBR Green)與雙鏈DNA分子結合發光的特性來指示擴增產物的增加。在PCR反應體系中，加入 過量SYBR Green I螢光染料，當該染料摻入DNA雙鏈後，螢光信號增強；當DNA變性時SYBR Green I染料釋放出來，螢光急劇減少；隨後在聚合延伸過程中引物退火併形成PCR產物， SYBR Green I染料與雙鏈產物結合，經檢測獲得螢光的淨增量。螢光信號的增加與PCR產 物的增加完全同步。這種高靈敏度、較低毒性的核酸染料在結合雙鏈DNA分子後螢光增強 800-1000 倍。
[0005] SYBR Green在核酸的實時檢測方面有很多優點，由於它與所有的雙鏈DNA相結 合，不必因為模板不同而特別定製，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。此外，由於 一個PCR產物可以與多分子的染料結合，因此SYBR Green的靈敏度很高。但是，由於SYBR Green與所有的雙鏈DNA結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起 的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度後螢光的變化可以幫助降低非特異產物 的影響。由解鏈曲線來分析產物的均一性有助於分析由SYBR Green得到定量結果的準確 性。
[0006] 在螢光定量PCR檢測基因表達水平時，經常檢測某個基因的相對表達量，其中內 參基因常常選擇tubulin。通過大量的實驗研究，我們優化出了一套能夠有效檢測蓮草直胸 跳甲tubulin基因表達量的引物和PCR反應條件，並組裝成tubulin基因表達檢測螢光定 量聚合酶鏈式反應試劑盒，以滿足生命科學、植物保護研究者的檢測需要。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種蓮草直胸跳甲 tubulin基因轉錄水平螢光定量PCR檢測試劑盒。
[0008] 本發明的技術方案如下： 一種蓮草直胸跳甲tubulin基因轉錄水平螢光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒由SYBR? Premix Ex Taq?、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水組成，試劑盒中各組成成分 如下： SYBR Premix Ex Taq?:內含 TaKaRa Ex TaqHS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I 等。
[0009] 引物混合物：引物1為10 Mmol/L、引物2為10 Mmol/L， 引物 1 序列為 V - CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT -3 ^、 引物 2 序列為 5 ' - GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC -3 '; 標準tubulin基因模板：濃度為1. 0 Mmol/L，tubulin基因模板序列為：5 ' - CAGGTG AAGGTATGGACGAAATGGAATTCACTGARGCMGAATCMAACATGAAYGAWTTAGTATCTGAATACCAACAATACCAA GAGGC -3 ;； 超純水組成：純度超過18. 25 ΜΩ · CM。
[0010] 本發明具有以下有益效果： 1.本發明實現了方便快捷的檢測tubulin基因轉錄水平的目的。
[0011] 2.本發明在檢測基因轉錄水平方面具有靈敏度高、穩定性好、實驗成本低的優 點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 附圖為蓮草直胸跳甲tubulin基因轉錄水平的螢光檢測結果。
[0013] 圖1 :蓮草直胸跳甲tubulin基因擴增曲線，橫坐標為PCR循環次數，縱坐標為相 對突光量值（Relative Fluorescence Units, RFU); 圖2 :蓮草直胸跳甲tubulin基因熔解曲線，橫坐標為溫度，縱坐標為單位溫度下相對 螢光值的變化量。
[0014] 擴增曲線結果表明tubulin基因螢光信號值符合標準的"S"型曲線，熔解曲線表 明該螢光定量具有高度的檢測專一性。
【具體實施方式】
[0015] 以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0016] 本試劑盒由SYBR Premix Ex Taq?、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水 組成，試劑盒組成： 表1
【權利要求】
1. 一種蓮草直胸跳甲tubulin基因轉錄水平螢光定量PCR檢測引物，其特徵 在於：引物1序列為V -CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT -3 7、引物2序列為V -GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC -3 7 。
2. -種蓮草直胸跳甲tubulin基因轉錄水平螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於，所 述試劑盒包括SYBR Premix Ex Taq?、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水組成， 試劑盒中各組成成分如下： SYBR Premix Ex Taq?:包含TaKaRa Ex TaqHS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I ； 引物混合物：引物1為10 Mrnol/L、引物2為10 Mmol/L， 引物 1 序列為 V - CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT -3 ^、 引物 2 序列為 5 ' - GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC -3 '; 標準tubulin基因模板：濃度為1. 0 Mmol/L，tubulin基因模板序列為：5 ' - CAGGTG AAGGTATGGACGAAATGGAATTCACTGARGCMGAATCMAACATGAAYGAWTTAGTATCTGAATACCAACAATACCAA GAGGC-3 '; 超純水組成：純度超過18. 25 ΜΩ · CM。
【文檔編號】C12N15/11GK104152560SQ201410401765
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】鄭麗禎, 傅建煒, 史夢竹, 李建宇, 遊泳, 林濤 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所