一種可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的檢測引物組及方法與流程

2023-10-19 03:45:37 4

本發明屬於分子生物學
技術領域：
，涉及實驗動物相關病原的檢測方法，具體涉及一種可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的檢測引物組及方法。
背景技術：
：非人靈長類動物在進化上與人類密切相關，且具有自然分布廣、數量多，易於飼養等特點被廣泛應用於生殖生理、藥物毒理、生物製品和人類疾病模型的研究。我國非人靈長類資源豐富，主要集中在我國廣東、廣西、雲南、四川、海南等南方地區，目前飼養的企業有50餘家，存欄規模30萬隻以上，每年用於科學研究的實驗猴有3萬餘只，每年出口2萬餘只。隨著實驗用猴和飼養企業的增多，猴類自身攜帶的病原逐漸引起人們的關注，使得人類在與猴接觸的過程中，感染病原的機會明顯增加，特別是那些目前很難治癒的諸如AIDS等疾病的出現，更加增加了職業人員的風險。另外，實驗猴攜帶病原也嚴重影響科學研究結果的準確性和真實性，損害了企業的經濟效益。而目前在實驗猴中三種最常攜帶的病毒為猴D型逆轉錄病毒(SRV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和猴T淋巴細胞趨向性病毒(STLV)。在現有的實驗的動物質量檢測標準中，對上述三個病原的檢測方法仍然採用的ELISA或IFA的檢測方法，該檢測方法特異性差，靈敏度低，假陽性高，還必須結合WB檢測特異性抗體才能最終確診。ELISA法和IFA法檢測的假陽性率高及WB法操作程序複雜，在一定程度上限制了其應用範圍。因此，不論是為了保障整個飼養猴群的健康還是飼養人員、科研人員的人身安全，都有必要建立一種方便、快捷、靈敏、特異性強的檢測方法。技術實現要素：本發明的一個目的在於提供一種可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的檢測引物組。本發明的另一個目的在於提供一種可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的方法。本發明所採取的技術方案是：一種可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的檢測引物組，包括三對引物，其核苷酸序列如下所示：SIV引物：SIV-F：5』-ACGACCCGGCGGAAAGAAAAAGT-3』(SEQIDNO:1)；SIV-B：5』-TGCACCAGATGACGCAGACAGT-3』(SEQIDNO:2)；SRV引物：SRV-F：5』-AYGGGGCTACTGCYCCATA-3』(SEQIDNO:3)；SRV-B：5』-GCCATTACCKGCYTGTTGATT-3』(SEQIDNO:4)；STLV引物：STLV-F：5』-GTGCCAATCATGGACCTGCC-3』(SEQIDNO:5)；STLV-B：5』-TCCTGGAGCGTCGATTAGAAGG-3』(SEQIDNO:6)。優選的，引物SIV-F、SRV-F、STLV-F引物序列的5』端通過間隔臂序列添加有Tag序列。優選的，引物SIV-F、SRV-F、STLV-F引物的Tag序列分別為：SIV-F的Tag序列為：5』-ATCTCAATTACAATAACACACAAA-3』(SEQIDNO:7)；SRV-F的Tag序列為：5』-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3』(SEQIDNO:8)；STLV-F的Tag序列為：5』-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3』(SEQIDNO:9)。優選的，引物SIV-R、SRV-R、STLV-R引物序列的5』端添加有生物素標記。一種可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的方法，包括如下步驟：1)提取待檢樣品RNA和合成cDNA；2)PCR擴增反應；3)PCR產物與螢光編碼微球雜交。4)信號檢測及結果判讀。優選的，PCR擴增反應程序為94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循環33次；72℃延伸5min。優選的，PCR產物與螢光編碼微球溶液的雜交體系為：螢光編碼微球溶液20μl，鏈黴親和素-藻紅蛋白溶液75μl，PCR產物5μl。優選的，螢光編碼微球分別標記有與上述所述Tag序列反向互補的序列。優選的，PCR產物與螢光編碼微球雜交的程序為：45℃雜交35min。本發明的有益效果是：本發明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、成本低、結果準確易讀等有益效果：1)高特異性：本發明根據SIV、SRV、STLV三個病毒高度保守序列，分別設計了三套特異性引物，三套引物Tm值接近，可接受高退火溫度進行PCR反應，保證了可以進行多重PCR反應和高特異性；2)高靈敏度：由於採取螢光信號讀取方式判定檢測結果，該檢測方法比傳統的PCR檢測方法要高出1至2個數量級。3)快速高效：只需提取一份樣本即可同時對三個病毒進行檢測並予以區分，大大縮短了檢測時間和樣本量；3)成本低：由於只需要一份試劑便可檢測一份樣本的多個指標，打破傳統方法一份試劑檢測一份樣本的一個指標的局限，實現真正的高通量檢測，大大降低了檢測試劑的成本；4)結果準確易讀：檢測螢光信號通過Luminex200儀器進行讀取，不需要進行電泳，檢測結果容易判定，準確度高，該檢測方法符合現代化檢測的需求。附圖說明圖1是實施例3特異性的檢測結果圖；圖2是實施例4各病毒質粒的靈敏度檢測結果圖。具體實施方式以下結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。實施例1可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的檢測引物組的設計分別以猴逆轉錄病毒(SIV)的主要核心蛋白gag基因部分序列(GenBank登錄號為M74931.1)、猴逆轉錄病毒(SRV1，SRV2，SRV3)的p27蛋白中的部分保守基因序列(GenBank登錄號分別為M11841.1、AF126467.1、M12349)、猴T淋巴細胞趨向性病毒Ⅰ型的env基因部分序列主要為靶基因，利用PrimerPremier6設計特異性的引物，分別對設計的上遊引物的5』端添加Tag序列，Tag序列與引物序列之間用SpacerC18隔開，下遊引物5』端添加生物素標記。最後用於PCR擴增的檢測引物序列見表1。表1.SIV、SRV、STLV檢測引物組實施例2可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的方法的建立。(1)病毒總RNA的提取：採用美基生物公司的病毒總RNA提取試劑盒分別對SIV、SRV病毒培養液中的總病毒RNA進行提取，並採用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄成cDNA.(2)PCR擴增反應：20μl反應體系含有：SIVfd0.2μM，SIVbk0.2μM，SRVfd0.2μM，SRVbk0.2μM，STLV1fd0.2μM，STLVbk0.2μM，MultiplexPCRAssayKit中反應液10.0μl，PCREnzymeMix0.1μl，待檢cDNA2.0μl，用DEPC水補齊到20μl；設置陽性對照和陰性對照；將配製好的PCR管混勻後離心，按如下程序進行PCR反應：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循環33次；72℃延伸5min。(3)PCR產物與螢光編碼微球雜交。A、配製螢光編碼微球溶液：將包被有與設計引物的Tag序列反向互補的螢光微球(3種微球購自Luminex公司，濃度為2500個/μl，具體的SIV、SRV、STLV分別對應的螢光編碼微球號為MTAG-67、MTAG-15、MTAG-56)用1.1×的HybrdizationBuffer稀釋到每微升溶液中含有每種螢光編碼微球50個。B、配製鏈黴親和素-藻紅蛋白溶液：將1mg/ml的SAPE溶液用1×HybrdizationBuffer稀釋到10ug/ml.C、配製雜交體系：試劑體積螢光編碼微球溶液20μl鏈黴親和素-藻紅蛋白溶液75μlPCR產物5μl總體積100μlD、雜交程序：45℃雜交35min(4)信號檢測及結果判讀。通過Luminex200儀器對雜交產物進行檢測及分析，讀取每個樣本中每種螢光微球的MFI值並統計出平均的MFI值作為判定依據。根據儀器軟體設置，選取陰性對照為參考，當樣本的MFI值大於1000時，可判為陽性。實施例3特異性實驗用實施例2的方法同時對SIV、SRV、STLV的混合cDNA模板進行檢測，驗證特異性。檢測結果顯示：三種病毒引物彼此間沒有交叉反應(見圖1)。實施例4靈敏度實驗以每個病毒的cDNA為模板，分別對應的採用SIV-F/SIV-R、SRV-F/SRV-R、STLV-F/STLV-R引物組擴增目標片段並克隆到pMD19-T載體中，構建特定質粒，然後進行10倍梯度進行稀釋，用實施例2的操作方法分別對稀釋後的各梯度質粒DNA進行靈敏度的檢測。檢測結果顯示：對於SIV，SIVfd/SIVbk引物組對質粒的檢測靈敏度為10fg/μl；對於SRV1、SRV2、SRV3，SRVfd/SRVbk引物組對質粒的檢測靈敏度分別為100fg/μl、10fg/μl、10fg/μl，對於STLV，STLVfd/STLVbk引物組對質粒的檢測靈敏度為1fg/μl(見圖2)。實施例5不同引物組檢測效果的比較用實施例2的方法，採用其他的檢測引物組按照實施例4的方法對各濃度的質粒進行靈敏度檢測，其他檢測引物組序列及檢測結果如下表2和表3。表2其他檢測引物組序列表3不同檢測引物組的檢測效果比較備註：檢測引物組A來自於本發明的引物組。檢測結果顯示：本發明的檢測引物組相比其他的引物組具有更高的檢測靈敏度，引物彼此間幹擾更小；引物組B未出現假陽性，但檢測靈敏度有所下降；檢測引物組C的陰性對照檢測為陽性，表明檢測引物組出現了幹擾作用。本發明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、成本低、結果準確易讀等優點，適合於各級檢測單位在實驗動物病原檢測過程中進行推廣應用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。SEQUENCELISTING廣東省實驗動物監測所一種可同時檢測並區分SIV、SRV、STLV的檢測引物組及方法20PatentInversion3.5123DNA人工序列1acgacccggcggaaagaaaaagt23222DNA人工序列2tgcaccagatgacgcagacagt22319DNA人工序列3ayggggctactgcyccata19421DNA人工序列4gccattacckgcytgttgatt21520DNA人工序列5gtgccaatcatggacctgcc20622DNA人工序列6tcctggagcgtcgattagaagg22724DNA人工序列7atctcaattacaataacacacaaa24824DNA人工序列8tacttctttactacaatttacaac24924DNA人工序列9cttaaactctacttacttctaatt241022DNA人工序列10cgacccggcggaaagaaaaagt221123DNA人工序列11tgcgccccaaatagctcagtttt231224DNA人工序列12agctggaatggggacaggttcact241323DNA人工序列13tgcggttttcccttctcccttct231424DNA人工序列14aggcagttggctgggttcggtatt241524DNA人工序列15acccagaagctaagggaacggcat241622DNA人工序列16acagttctgccacctctgcact221724DNA人工序列17atgcgccccaaatagctcagtttt241824DNA人工序列18tggggacaggttcactacctggaa241924DNA人工序列19agccatctccagcccttactggaa242023DNA人工序列20agaagggagaagggaaaaccgca23當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp