用於沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基及製備方法

2023-10-19 22:54:52

專利名稱：用於沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基及製備方法
技術領域：
本發明屬於致病菌的前增菌培養基，特別是涉及一種同時對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基及其製備方法。
背景技術：
全球範圍內，每年由沙門氏菌和志賀氏菌感染帶來的胃腸道疾病致死人數高達百萬，給各國均帶來了較大的負擔。金黃色葡萄球菌不僅能夠汙染食品，還是臨床病人感染的主要源頭之一。我國的調查顯示，沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌都位居感染率最高的食源性致病菌之列，其中沙門氏菌在整個感染病例中所佔比例最大。依賴於基因的檢測方法現在已經廣泛應用，成為國際上檢測食源性致病菌的主要方法之一。PCR技術發展迅速，螢光定量PCR也已經成熟，而多重螢光定量PCR的應用也為 同時檢測多種細菌指明了方向。這種方法效率高，準確性高，通量高，但一般都需要一個前增菌過程。當前的前增菌培養基已有很多，沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌均有各自的選擇性前增菌培養基，能夠特異的生長。營養肉湯等通用增菌培養基能夠同時擴增多種細菌，但是缺乏抑制劑去選擇目標菌，不合適於高背景微生物的原材料及未經處理的樣品，因此研製一種能夠能同時對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌進行增菌同時能夠抑制其他非目標菌的培養基成為當前的必要。

發明內容
本發明旨在提供可以同時支持沙門氏菌，志賀氏菌及金黃色葡萄球菌三種食源性疾病的同時生長，且抑制其他非目標菌的培養基，實現將常規檢測方法中的前增菌步驟和選擇性增菌步驟合二為一，用於在一個檢測平臺上檢測多個致病菌。本發明目的通過如下技術方案實現用於沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基，以質量份數計，其原料配方組成為胰蛋白腖13-16份、大豆蛋白腖4-7份、磷酸二氫鈉2-3份、葡萄糖2-3份、蒸餾水1000份、牛膽鹽O. 07-0. 13份、氯化鈉25-40份、氯化鋰O. 4-1份、甘露醇I. 5-3. 5份和亞碲酸鉀O. 0002-0. 0004份，pH值為7. 1-7. 3。為進一步實現本發明目的，以質量份數計，所述培養基的的配方優選為胰蛋白腖15份、大豆蛋白腖5份、磷酸二氫鈉2. 5份、葡萄糖2. 5份、蒸餾水1000份、氯化鈉35. O份、氯化鋰O. 5份、牛膽鹽O. I份、甘露醇2份，亞碲酸鉀O. 0003份，pH值7. 2。用於沙門氏菌、志賀氏菌及金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基的製備方法，包括如下步驟(I)按照原料配方，將胰蛋白腖、蛋白腖、葡萄糖、磷酸二氫鉀、甘露醇、氯化鋰、氯化鈉、牛膽鹽加入到蒸餾水中，加熱至溶解,冷卻至室溫後,用lmol/L的NaOH進行酸度矯正pH 值至 I. 1-7. 3 ；
(2)混勻，121-125°c滅菌 15_18min ；(3)按原料配方，稱取亞碲酸鉀加入到已滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液；控制蒸餾水的總量為1000質量份；(4)在無菌條件下，加入步驟3中配製的亞碲酸鉀溶液；分裝存於4_6°C下備用。所述步驟(I)的蒸餾水優選為985-990份。所述步驟(3)的已滅菌的蒸餾水優選為10-15份。本發明通過選擇合適的組分，並進行合理混配，經加熱、溶解、混合、高溫滅菌等步驟而獲得一種使沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基。本發明培養基含有抑制劑氯化鋰、牛膽鹽和亞碲酸鉀。其中氯化鋰沙門氏菌和金黃色葡萄球菌沒有明顯的沒有抑制作用，對志賀氏菌有一定抑制作用，但能夠抑制綠膿桿菌、小腸耶 爾森氏菌等食源性致病菌。牛膽鹽能夠抑制大部分的革蘭氏陽性菌，但較低濃度時金黃色葡萄球菌也能夠生長。沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌都具有亞碲酸鉀抗性，添加有壓低酸鹽的培養基可以作為志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的選擇培養基。亞碲酸鉀對0157、普通腸桿菌、霍亂弧菌和白喉桿菌的抑制作用使得其成為此共增菌培養基的成分之一。志賀氏菌和沙門氏菌對氯化鈉有一定的耐受作用，金黃色葡萄球菌本身就耐鹽，故選擇添加較高濃度的氯化鈉。磷酸二氫鉀用於調節pH。胰蛋白腖、蛋白腖、葡萄糖、是培養基中基本的營養和支持成分。選擇甘露醇作為促進劑。相比較沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，甘露醇對志賀氏菌的促進情況更為明顯，能夠一定程度上減弱氯化鋰對志賀氏菌的抑制作用。標本接種後，在37°C培養，增菌24小時後，劃線到三種目標菌各自的選擇性培養基上，分離鑑別。相對於現有技術，本發明具有以下優點本培養基可融合致病菌的前增菌及選擇性增菌兩個步驟，縮短增菌時間至18小時；使得三種常見的致病菌同時增菌而其他的致病微生物生長受到一定的抑制；本發明的培養物可以直接做目標菌的分離培養及生物鑑定實驗，也可以直接用於多重PCR檢測，作出診斷報告。
具體實施例方式為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步地詳細說明，但是本發明要求保護的範圍並不局限於實施例表示的範圍。實施例I稱取胰蛋白腖15g、大豆蛋白腖5g、磷酸二氫鈉2. 5g、葡萄糖2. 5g、氯化鈉35g、氯化鋰O. 5g、牛膽鹽O. lg、甘露醇2g，蒸餾水加至990ml，加熱溶解，冷卻到室溫後用lmol/L的NaOH進行酸度矯正，調整pH值至7. 2 ;混勻，121°C滅菌15min ;稱取O. 3mg亞碲酸鉀加入到IOmL已滅菌的蒸餾水中，配成亞碲酸鉀溶液。在無菌條件下，加入亞碲酸鉀溶液IOmL ；分裝存於4°C下備用，製得用於沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基。將菌濃度都為109cfu/mL的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌及雜菌(具體見表I的十種)培養液分別稀釋IO5倍，然後分別取O. OlmL接入IOmL製備好的用於沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基，使培養基中菌濃度為10cfu/mL，37°C培養18h。用分光光度計在600nm下測定其OD值。以營養肉湯為空白對照。結果見表I。
表I目標菌及雜菌單獨在培養基中的生長情況
權利要求
1.用於沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基，其特徵在於，以質量份數計，其原料配方組成為胰蛋白腖13-16份、大豆蛋白腖4-7份、磷酸二氫鈉2-3份、葡萄糖2-3份、蒸餾水1000份、牛膽鹽O. 07-0. 13份、氯化鈉25-40份、氯化鋰O. 4-1份、甘露醇 I. 5-3. 5 份和亞碲酸鉀 O. 0002-0. 0004 份，pH 值為 7. 1-7. 3。
2.根據權利要求I所述的培養基，其特徵在於以質量份數計，所述培養基的的配方為胰蛋白腖15份、大豆蛋白腖5份、磷酸二氫鈉2. 5份、葡萄糖2. 5份、蒸餾水1000份、氯化鈉35. O份、氯化鋰O. 5份、牛膽鹽O. I份、甘露醇2份，亞碲酸鉀O. 0003份，pH值7. 2。
3.權利要求I所述用於沙門氏菌、志賀氏菌及金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基的製備方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)按照原料配方，將胰蛋白腖、蛋白腖、葡萄糖、磷酸二氫鉀、甘露醇、氯化鋰、氯化鈉、牛膽鹽加入到蒸餾水中，加熱至溶解，冷卻至室溫後，用lmol/L的NaOH進行酸度矯正pH值至 7. 1-7. 3 ； (2)混勻，121-125°C滅菌15-18min ； (3)按原料配方，稱取亞碲酸鉀加入到已滅菌的蒸餾水中，得到亞碲酸鉀溶液；控制蒸餾水的總量為1000質量份； (4)在無菌條件下，加入步驟3中配製的亞碲酸鉀溶液；分裝存於4-6°C下備用。
4.根據權利要求3所述的用於沙門氏菌、志賀氏菌及金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基的製備方法，其特徵在於所述步驟(I)的蒸餾水為985-990份。
5.根據權利要求3所述的用於沙門氏菌、志賀氏菌及金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基的製備方法，其特徵在於所述步驟(3)的已滅菌的蒸餾水為10-15份。
全文摘要
本發明公開了用於沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌複合增菌的培養基及製備方法，該培養基包括胰蛋白腖13-16份、大豆蛋白腖4-7份、磷酸二氫鈉2-3份、葡萄糖2-3份、蒸餾水1000份、牛膽鹽0.07-0.13份、氯化鈉25-40份、氯化鋰0.4-1份、甘露醇1.5-3.5份、亞碲酸鉀0.0002-0.0004份，pH值為7.1-7.3。本培養基在使得三種目標緻病菌同時增菌的同時，抑制其它的致病微生物生長，可直接做目標菌的分離培養及生物鑑定實驗，也可以直接用於多重PCR等基於一個檢測平臺的多個致病菌的檢測技術中，做出診斷報告。
文檔編號C12R1/01GK102827795SQ20121031346
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月29日 優先權日2012年8月29日
發明者餘以剛, 肖性龍, 王永志, 吳暉 申請人:華南理工大學