Rho蛋白質檢測的製作方法

2023-10-19 17:16:52 3

專利名稱：Rho蛋白質檢測的製作方法
專利說明Rho蛋白質檢測 發明領域 本發明部分地涉及活化Rho蛋白質的檢測方法。

背景技術：
Rho GTP酶是Ras超家族的一類結構和功能獨特的GTP酶(Wennerberget al.，2005，J.Cell Sci.，118843-846；Takai et al.，2001，Physiol.Rev.，81153-208)。它們參與多種多樣的細胞功能，包括調節肌動蛋白和微管蛋白動力學、細胞極性、膜轉運途徑和轉錄因子活性(Ridley et al.，1992，Cell，70389-399；Braga et al.，1997，J.Cell Biol.，1371421-1431；和Coso et al.，1995，Cell，811137-1146)。然而，該家族中一些成員(如RhoBTB1，RhoBTB2和RhoH)似乎與經典的成員，例如RhoA、Rac1和Cdc42，在功能上關係並不緊密(Aspenstrom et al.，2004，Biochem J.，377327-337)。因此，本領域技術人員公認，通過序列同源性來界定Ras超家族GTP酶中的Rho GTP酶是最為明確的。
若對超過150個哺乳動物Ras超家族成員的全部GTP酶功能區進行比對並根據比對結果分類形成系統樹，20個Rho蛋白質構成Ras超家族樹的一個單獨的分支(Wennerberg et al.，2005，J.Cell Sci.，118843-846)。Rho蛋白質在GTP酶域內的整體同源性將它們與Ras超家族的其他成員區分開來。Rho蛋白質在GTP酶內共有40-95％的同源性，與其他的Ras超家族GTP酶具有30％或更低的同源性。此外，Rho蛋白具有一個這種小GTP酶類的GTP酶特有的基序。該基序稱作Rho插入域(Rho insert domain)，位於小GTP酶域第5β摺疊鏈和第4α螺旋之間(Zong et al.，2001，Mol.Cell Biol.，215287-5298)。
因此，如果一種小G蛋白在與其他Ras超家族蛋白進行比對時落在Rho分支內(例如該蛋白質與其他Rho蛋白具有至少40％的同源性)，並含有Rho插入域，則認為該小G蛋白是Rho家族蛋白。
已知Rho GTP酶參與許多致病過程——例如轉移性侵襲、細菌和病毒感染和高血壓——的進展(Symons，1995，Curr.Op.Biotech.，6668-674；Chenet al.，1996，Science，2742115-2118；和Uehata et al.，1997，Nature，389990-994)。由於它們在基本細胞功能和致病過程中的多種作用，因此開發可允許研究人員分析細胞中Rho GTP酶活性的測定方法吸引了人們大量的興趣。而且，人們在開發適合於靶向Rho GTP酶或Rho GTP酶轉導途徑的藥物發現高通量篩選的測定方法以及適合於診斷應用的測定方法方面投入了很大的興趣。
由Rho GTP酶介導的細胞活動依賴於GTP酶的活化狀態。當GTP與Rho GTP酶結合時，它們處於活化狀態，並且能夠結合效應物並傳遞信號級聯，引起特定的細胞響應。當GDP與Rho GTP酶結合時，Rho蛋白處於非活化狀態(Takai et al.，2001，Physiol.Rev.，81153-208)。已經開發出了數種用於監視Rho GTP酶活化狀態的測定方法。
有一種測定方法稱為Rho效應物沉降(pull down)測定法，它最初由Ren等開發用於RhoA GTP酶(1999，EMBO J.，18578-585)，和由Benard等開發用於Rac1/Cdc42 GTP酶(1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)，是一種經典的、最廣泛使用的測定方法。該方法包括通過結合在珠子上的效應物捕獲活化的Rho GTP酶蛋白質，從珠子釋放GTP酶蛋白質，分離珠子和釋放GTP酶蛋白質，隨後進行SDS-PAGE，並通過western印跡對GTP酶蛋白質進行分析。該測定方法的重複性差，因為在測定執行過程中需要多重操作處理，並且靈敏度較低。它也不適合於高通量應用(Teusch et al.，2006，Assay and Drug Devel.，4133)。
還有幾種基於細胞的測定方法，其使用螢光生物探針(bio-probes)檢測活化的Rho GTP酶(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)。此類測定方法中有幾個版本是依靠報導系統監視體內Rho GTP酶的活化。因此，這些基於細胞的測定方法並不監視GTP酶的實際內源水平(Itoh et al.，2002，Mol.Cell Biol.，226582-6591；Pertz et al.，2006，Nature，4401069-1072；和Vadim et al.，2000，Science，290333-337)。基於細胞的測定方法的其他版本使用與環境染料(environmental dye)直接連接的效應物域監視體內內源GTP酶的活化。因為在任何特定探針上布置環保染料都需要大量的分析，而且特定的效應物可能不適合於與染料連接，所以任何特定效應物的有效性都是不能預測的(Nalbant et al.，2004，Science，3051615-1619)。而且，因為在體內使用直接效應物檢測導致往往識別多於一種GTP酶的探針，所以在這些測定方法中，特異性是一個問題。這類測定方法的另一個問題是外源效應物的引入實際上會改變Rho GTP酶的活化水平，該問題產生了一種在技術上具有挑戰性的測定方法(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)。
螢光生物傳感器探針也已用於體外測定，但它們的靈敏度非常低。而且，染料會對環境變化作出響應，這也為藥物篩選應用帶來了問題(Hahn etal.，美國專利申請6,951,947B2)。
有人報導了一種用於基於酶的Rho活化檢測方法(Chen et al.，2003，J.Biol.Chem.，2782807)。該測定方法利用GST-效應物-GBD來親和沉澱活性GTP-Rho。GTP在偶聯的酶測定中被洗脫並轉變成ATP。然後通過螢火蟲螢光素酶法測量ATP。這種測定方法高度依賴於GST沉降測定，因此具有與該測定法相關的大多數缺點。而且，因為在這種方法中不涉及Rho特異的抗體，所以該測定法的特異性有限。
還報導了一種自動化的基於細胞的Rho活化測定方法(Teusch et al.，2006，Assay and Drug Devel.，4133)。這種測定方法是被開發用來代替GST沉降測定的，因為後者不適於高通量篩選且重複性差。該測定法基於Rho調節肌動蛋白細胞骨架的能力。因為肌動蛋白細胞骨架受多種信號途徑的調節，所以這種測定方法的特異性非常有限。
因此，需要有一種簡單、對特定GTP酶蛋白特異、可重複、靈敏且適合於高通量篩選應用的Rho GTP酶活化測定方法。本發明即是為了這一需要以及其他的方面提供的。
發明概要 本發明涉及用於檢測活化Rho GTP酶蛋白質的方法，所述方法通過1)使固體支持物與包含活化Rho GTP酶蛋白質的樣品接觸，其中固體支持物與活化Rho GTP酶結合肽連接，並且其中樣品中的活化Rho GTP酶與活化Rho GTP酶結合肽結合；和2)檢測樣品中活化的Rho GTP酶蛋白質，其中在檢測期間活化的Rho GTP酶蛋白質保持與固體支持物聯結(remainsassociated with the solid support)。在一些實施方案中，固體支持物是微量滴定板或微陣列。
在一些實施方案中，該樣品包括含有內源活化Rho GTP酶蛋白質的細胞裂解物。在一些實施方案中，該樣品包含少於50μg的總蛋白。在一些實施方案中，該細胞裂解物是從少於105個細胞製備的。在一些實施方案中，該細胞裂解物未被澄清。在一些實施方案中，該樣品包含外源GTP、GDP或GTPγS。
在一些實施方案中，在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質之前，添加抗原提呈緩衝劑(Antigen Presenting Buffer)。該抗原提呈緩衝劑包括一種或多種能夠減少活化Rho GTP酶蛋白質自固體支持物的損失的化合物或處理。在一些實施方案中，抗原提呈緩衝劑包括熱變性、尿素處理、戊二醛、乙醇或三氯乙酸，或其任意組合。在一些實施方案中，三氯乙酸的最終濃度為大約0.5％至大約15％v/v。
在一些實施方案中，在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質之前，添加結合緩衝劑(Binding Buffer)。在一些實施方案中，所述結合緩衝劑包括水溶性聚蔗糖(ficoll)、葡聚糖或聚乙二醇，或其任意組合。在一些實施方案中，該聚乙二醇是PEG 4000或PEG 8000，其終濃度為大約2％至大約40％v/v。
在一些實施方案中，使用對一種或多種活化Rho GTP酶蛋白質特異的抗體來檢測活化Rho GTP酶蛋白質。
在一些實施方案中，活化Rho GTP酶蛋白質是組成型活性突變體。在一些實施方案中，活化Rho GTP酶蛋白質是RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、或RhoBTB2。
在一些實施方案中，活化Rho GTP酶結合肽結合一種或多種活化RhoGTP酶蛋白質，且其對活化Rho GTP酶蛋白質的親和力是對非活化形式的Rho GTP酶蛋白質的親和力的至少2倍高(at least 2 fold higher)。在一些實施方案中，活化Rho GTP酶結合肽是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH、WASP或Dia1，或它們的突變體或多聚體。在一些實施方案中，活化Rho GTP酶結合肽共價或非共價地連接於固體支持物。在一些實施方案中，共價連接是二硫鍵連接，非共價連接是GST連接。在一些實施方案中，活化RhoGTP酶結合肽是凍幹的。
在一些實施方案中，該方法進一步包括對與活化Rho GTP酶結合肽結合的活化Rho GTP酶蛋白質的量進行定量。在一些實施方案中，使用對一種或多種Rho GTP酶蛋白質特異的抗體對活化Rho GTP酶蛋白質的量進行定量。
在一些實施方案中，活化Rho GTP酶蛋白質的檢測是利用吸光度、發光或螢光來檢測活化Rho GTP酶蛋白質與活化Rho GTP酶結合肽之間的相互作用而進行的。
在一些實施方案中，該方法進一步包括使樣品與測試劑接觸，並確定測試劑是否調節活化Rho GTP酶蛋白質與活化Rho GTP酶結合肽之間的相互作用。
附圖簡述

圖1A描繪了重組效應物-GBD肽的考馬斯染色SDS凝膠。圖1B描繪了野生型和修飾Rho靶蛋白-Cys-GBD的DNA和胺基酸序列。圖1C描繪了選擇性結合活化RhoA的修飾Rho靶蛋白-Cys的Western印跡分析。
圖2A描繪了使用ROCK板通過發光測定法檢測活性RhoA所檢測到的RhoA信號。圖2B描繪了使用POSH板通過490nm吸光度檢測活性Rac1所檢測到的Rac1信號。圖2C描繪了使用WASP板通過490nm吸光度檢測活性Cdc42所檢測到的Cdc42信號。
圖3A描繪了用ROCK-GBD馬來醯亞胺板通過發光測定法檢測到的RhoA信號。圖3B描繪了用POSH-GBD馬來醯亞胺板通過490nm吸光度檢測到的Rac1信號。
圖4描繪的是使用抗RhoA抗體的Western印跡，顯示抗體溫育期間G-LISAGTP酶信號的損失。
圖5A描繪的是顯示用於RhoA G-LISA抗原提呈緩衝劑的開發的發光檢測(白色條形顯示GDP信號，灰色條形顯示GTPγS信號)。圖5B描繪的是通過490nm吸光度檢測的Rac1信號，顯示TCA在Rac1POSH G-LISA中作為抗原提呈緩衝劑。
圖6A描繪了通過490nm吸光度檢測的RhoA信號，顯示在結合緩衝劑的存在下活性RhoA的穩定性(SS是血清飢餓樣品--白色條形；鈣蛋白酶抑制劑(Calpeptin)標記的RhoA誘導的樣品--灰色條形)。圖6B描繪了通過490nm吸光度檢測到的活性RhoA信號，顯示在結合緩衝劑的存在下增強的RhoA信號(SS是血清飢餓樣品--白色條形；鈣蛋白酶抑制劑標記的RhoA誘導的樣品--灰色條形)。圖6C描繪了通過490nm吸光度檢測到的Rac1信號，顯示結合緩衝劑對Rac1信號的影響(SS是血清飢餓樣品--白色條形；EGF標記的RhoA誘導的樣品--灰色條形)。
圖7A描繪的是用於G-LISA開發的RhoA及RhoA，B，C單克隆抗體的篩選策略和Western分級。圖7B描繪了圖7A所示單克隆抗體G-LISA篩選的原始數據。
圖8描繪了用未澄清的細胞裂解物在ROCK馬來醯亞胺板上進行RhoAG-LISA測定的發光。
圖9描繪了在G-LISA測定中用非共價效應物-GBD板通過490nm吸光度檢測的Rac1信號。
圖10描繪了RhoA G-LISA中細胞裂解物的滴定，以及GST-Rho靶蛋白-RBD沉降測定的Western印跡結果。
圖11描繪了G-LISA中組成型活化RhoA滴定的吸光度檢測結果。
圖12描繪了針對Rac1的沉降測定和G-LISA測定的直接比較。
圖13A描繪了被表皮生長因子(EGF)體內活化的Rac1的G-LISA分析。圖13B描繪了被EGF體內活化的Cdc42的G-LISA分析。圖13C描繪了利用G-LISA測定的轉染分析。
圖14描繪了對凍幹的效應物-GBD板的延長保存期研究。
圖15描繪了POSH-GBD板在藥物發現應用中的使用。
實施方案描述 本發明提供了一種Rho GTP酶活化測定方法，該方法簡單、對特定GTP酶蛋白質具有特異性、可重複、靈敏、並且適合於與傳統的沉降測定方法相比具有多種優勢的高通量篩選應用。
如本文所使用的，術語「大約」是指被修飾的值的大約±5％的範圍。例如，短語「大約10」表示9.5-10.5的範圍。
如本文所使用的，術語「片段」在指蛋白質時，是指小於整體的肽或多肽。在一些實施方案中，片段包含至少5個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、大約5-大約100個、大約5-大約50個、大約5-大約25個、大約100-大約200個、5-100個、5-50個、5-25個、100-200個、不超過200個、不超過100個、不超過75個、不超過50個、或者不超過25個胺基酸殘基。「片段」還可稱為蛋白質的「部分」。
如本文所使用的，術語「樣品」是指包含Rho GTP酶蛋白質(活化的和/或非活化的)和/或Rho GTP酶結合肽的組合物。樣品的實例包括，但不僅限於，血液、細胞、細胞裂解物等。在一些實施方案中，細胞裂解物被澄清或未被澄清。在一些實施方案中，樣品包含外源的GTP、GDP或GTPγS。
如本文所使用的，術語「澄清的」(clarified)是指樣品被清潔(clear)、縮減(reduced)或過濾(filtered)以除去在裂解細胞時產生的不溶解性物質。任何方法均可用于澄清細胞裂解物，包括但不僅限於，離心、過濾等。
如本文所使用的，短語「Rho GTP酶蛋白質」(也稱作「Rho亞家族蛋白質」)包括活性蛋白質和非活性蛋白質二者。當GTP與Rho GTP酶蛋白質相結合時，它們處於活性狀態，能夠結合效應物並傳播信號級聯，引起特定的細胞響應。當GDP與Rho GTP酶蛋白質相結合時，Rho蛋白質是非活性的。本發明的方法可以用於檢測活化的GTP酶蛋白質。Rho GTP酶蛋白質包括，但不僅限於，RhoA(SEQ ID NO1)，RhoB(SEQ ID NO2)，RhoC(SEQ ID NO3)，RhoD(SEQ ID NO4)，Rnd3(SEQ ID NO5)，Rnd1(SEQ IDNO6)，Rnd2(SEQ ID NO7)，Rif(SEQ ID NO8)，RhoG(SEQ ID NO9)，RhoH(SEQ ID NO10)，Rac1(SEQ ID NO11)，Rac1b(SEQ ID NO84)，Rac2(SEQID NO12)，Rac3(SEQ ID NO13)，Cdc42(SEQ ID NO14)，TC10(SEQ IDNO15)，TCL(SEQ ID NO16)，Wrch-1(SEQ ID NO17)，Wrch-2(SEQ IDNO18)，RhoBTB1(SEQ ID NO19)，和RhoBTB2(SEQ ID NO20)，或者其任何亞群。
「Rho GTP酶結合肽」或「活化Rho GTP酶結合肽」(也稱作「Rho亞家族結合肽」)是能夠結合活化Rho GTP酶蛋白質的蛋白質或其片段。「RhoGTP酶結合肽」並不指GTP或其類似物。「Rho GTP酶結合肽」在這裡還稱作「效應物」(effector)。本領域技術人員可通過常規實驗來鑑定保留其結合活性Rho GTP酶蛋白質之能力的Rho GTP酶結合肽片段。在一些實施方案中，在本文提供的方法中使用的Rho GTP酶結合肽結合Rho GTP酶蛋白質，且其與Rho GTP酶蛋白質的GTP結合態的親和力是與Rho GTP酶蛋白質的GDP結合態的親和力的至少2倍。
在一些實施方案中，Rho GTP酶結合肽可以包括小G蛋白效應物之胺基酸序列的全部或部分或片段，其中小G蛋白效應物例如ROCK1、ROCK2、Citron、DGKθ、移動結合蛋白(Kinectin)、Dia1、Dia2、Dia3、PLC-ε，蛋白激酶N、Rhophillin、Rho靶蛋白(Rhotekin)、FHOD、p67Phox、PLC-β、POR-1、POSH、Sra-1、突觸小泡磷酸酶(Synaptojanin)-2、Ack1、Ack2、CEP1、CEP2、CEP3、CEP4、CEP5、CIP4、外被體(Coatamer)α、外被體γ、MRCKα、MRCKβ、Pak4、Spec1、Spec2、WASP、N-WASP、IRSp53、IQGAP-1、IQGAP-2、MEKK1、MEKK4、MLK2、MLK3、p70 S6激酶、Pak1、Pak2、Pak3、Pak4、Pak5、Pak6、PI3K(p85亞單位)、PIP5K、PLD-1，或其任何亞群或組合。在一些實施方案中，Rho GTP酶結合肽是多聚體化的，從而存在多於一個單位的配體。例如，Rho GTP酶結合肽可以是二聚體或三聚體化的(3個拷貝)。Rho GTP酶結合肽還可以具有該蛋白質與Rho GTP酶蛋白質結合的序列的4、5、6、7、8、9、或10個拷貝。
如果將某蛋白質與其他Ras超家族蛋白質進行比對時，其落入Rho分支(例如，該蛋白質與其他Rho蛋白質具有至少40％的同源性)，並且其含有Rho插入域，則認為該蛋白質是「Rho GTP酶蛋白質」。在一些實施方案中，如果一種小G蛋白質與其他Rho蛋白質，例如但不僅限於，RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、和/或RhoBTB2具有至少40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、40-99、50-99、60-99、70-99、80-99、85-99、90-99、或95-99％的同源性，則認為該小G蛋白質是Rho家族蛋白質。此外，當使用某種方法如保守域發現工具(conserveddomain finder)表明某種蛋白質包含Rho插入蛋白時，則認為該蛋白質具有Rho插入蛋白。將鑑定為具有Rho插入域的蛋白質看作Rho GTP酶蛋白質。任何方法或軟體均可用於確定某種蛋白質是否包含Rho插入蛋白。作為一個非限制性實例，可以使用例如「rpsblast」採用默認設置，將蛋白質對保守域資料庫進行比較，rpsblast可在例如美國國家生物技術信息中心的網站上找到，其在全球資訊網上的地址為ncbi「點」nlm「點」nih「點」gov/Structure/cdd/wrpsb「點」cgi。如這裡所使用的，對於網際網路地址，術語「點」是指「.」。本文提供了Rho GTP酶蛋白質的實例，包括但不僅限於，RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、RhoBTB2等。
鑑定蛋白質家族成員或同源物的其他方法和實例包括，但不僅限於下述。有多種蛋白質家族資料庫可用於分析或鑑定同源蛋白質、域和基序。資料庫的實例包括，但不僅限於，簡單模塊構架搜索工具(Simple ModularArchitecture Resource Tool，SMART)、比對和HMM蛋白質家族資料庫(Pfam)、人類蛋白質參考資料庫(Human Protein Reference Database，HPRD)、在線人類孟德爾遺傳資料庫(Online Mendelian Inheritance in Man OMIM)、癌症基因組解剖計劃(Cancer Genome Anatomy Project，CGAP)和Entrez Protein搜索資料庫。SMART資料庫可以在smart「點」embl-heidelberg「點」de/訪問。Pfam資料庫可以通過網際網路的全球資訊網在例如sanger「點」ac「點」uk/Software/Pfam/search.shtml進行訪問。OMIM是部分為美國國家生物技術信息中心(NCBI)開發的與疾病相關的人類遺傳突變資料庫。OMIM可通過環球網在例如ncbi「點」nlm「點」nih「點」gov/Omim/進行訪問。CGAP是一個旨在建立破譯癌細胞分子解剖學所需的信息和技術工具的跨學科計劃。CGAP可以通過網際網路的全球資訊網在例如ncbi「點」nlm「點」nih「點」gov/ncicgap/進行訪問。Entrez蛋白質搜索資料庫可以通過網際網路的全球資訊網在ncbi「點」nlm「點」nih「點」gov/entrez/query「點」fcgi？db＝Protein進行訪問。這些資料庫中的一些可能包含完整的或部分的核苷酸或胺基酸序列。近年來，隱藏馬爾可夫模型(HMM)已成為一種用於檢測這些家族成員的關鍵技術。Pfam、TIGRFAMs和SMART資料庫使用由HMMER軟體包提供的子集(profile)-HMM。TIGRFAMs是人工註解(curated)蛋白質家族的集合，由下述各項組成HMMs、多序列比對、注釋、GeneOntology(GO)指配、文獻參考和指向相關TIGRFAMs、Pfam和InterPro模型的指示。TIGRFAMs包含超家族、亞家族和等價體(equivalog)水平的全長蛋白質和短區域。TIGRFAMs可以通過網際網路的全球資訊網在tigr「點」org/TIGRFAMs進行搜索和下載。
小G蛋白效應物的部分胺基酸序列可以是域，例如Cdc42/Rac相互作用性結合(CRIB)域、Rho結合域(RhoBD)、Rho相互作用域(RID)、Rho效應物或蛋白激酶C相關的激酶同源性區1(HR-1)、三十四肽(tetratricopeptide)重複單位(TPR)、或血小板白細胞C激酶底物(Pleckstrin)同源(PH)域。
在一些實施方案中，本發明方法中使用的Rho GTP酶結合肽可包含針對Rho GTP酶蛋白質的效應物或其域。實例包括，但不僅限於，RhoBD、RID和HR-1域。能夠結合活化RhoA GTP酶蛋白質的RhoBD的一種共有胺基酸序列是SEQ ID NO21。能夠結合活化Rho GTP酶蛋白質的HR-1域的一種共有胺基酸序列是SEQ ID NO22。能夠結合活化Rho GTP酶蛋白質的RID域的一種共有胺基酸序列是SEQ ID NO23。作為RhoA GTP酶蛋白質效應物的含有RhoBD的肽的實例包括，但不僅限於，Citron(SEQ IDNO24)，ROCK 1(SEQ ID NO25)和ROCK 2(SEQ ID NO26)。作為RhoA/B/C GTP酶蛋白質的效應物的含有HR-1域的肽的實例包括，但不僅限於，蛋白激酶N1(SEQ ID NO27)，蛋白激酶N2(SEQ ID NO28)，ROCK 1(SEQ ID NO25)，ROCK 2(SEQ ID NO26)，Rhophilin(SEQ ID NO29)，Rho靶蛋白(SEQ ID NO30)，和Rho靶蛋白2(Rhotekin 2)(SEQ ID NO83)。作為RhoA GTP酶蛋白質的效應物的含RID域的肽的實例包括，但不僅限於，ROCK 1(SEQ ID NO25)和ROCK 2(SEQ ID NO26)。其他作為RhoA GTP酶蛋白質效應物的肽的實例包括，但不僅限於，DGKθ(SEQ ID NO31)，移動結合蛋白(SEQ ID NO32)，Dia1(SEQ ID NO33)，Dia2(SEQ ID NO34)，MBS(SEQ ID NO82)和PLC-ε(SEQ ID NO35)。
作為RhoB GTP酶蛋白質效應物的肽的實例包括，但不僅限於，Db1(SEQ ID NO93)和p76RBE(SEQ ID NO94)。
在一些實施方案中，本發明方法中使用的Rho GTP酶結合肽可以包括Rac小G蛋白的效應物。充當Rac小G蛋白效應物的域的實例包括，但不僅限於，TPR域和PH域。能夠結合活化Rac小G蛋白的TPR域的一種共有胺基酸序列是SEQ ID NO36。能夠結合活化Rac小G蛋白的PH域的一種共有胺基酸序列是SEQ ID NO37。作為Rac小G蛋白的效應物的含TPR域的肽的實例包括，但不僅限於，p67Phox(SEQ ID NO38)。作為Rac小G蛋白的效應物的含PH域的肽的實例包括，但不僅限於，PLC-β(SEQ IDNO39)。其他作為Rac小G蛋白效應物的肽的實例包括，但不僅限於，FHOD(SEQ ID NO40)、POR-1(SEQ ID NO41)、POSH(SEQ ID NO42)、Sra-1(SEQID NO43)、PP5磷酸酶(SEQ ID NO85)、肉桂醯(Cinnamolyl)-CoA還原酶(SEQ ID NO86)、UNC-115(SEQ ID NO87)、Wave(SEQ ID NO88)、叢蛋白(Plexin)B1(SEQ ID NO89)、p35(SEQ ID NO90)、Tre17(SEQ ID NO91)、CID(SEQ ID NO92)，和突觸小泡磷酸酶-2(SEQ ID NO44)。
在一些實施方案中，本發明方法中使用的肽可以包含作為Cdc42小G蛋白效應物的域。可充當Cdc42小G蛋白效應物的域的實例包括，但不僅限於，CRIB域。能夠結合活化Cdc42小G蛋白的一種CRIB域共有胺基酸序列是SEQ ID NO45。作為Cdc42小G蛋白的效應物的含CRIB域的肽的實例包括，但不僅限於，Ack1(SEQ ID NO46)，Ack2(SEQ ID NO47)，Pak4(SEQ ID NO48)，WASP(SEQ ID NO49)和N-WASP(SEQ ID NO50)。其他作為Cdc42小G蛋白效應物的肽的實例包括，但不僅限於，CEP1(SEQ IDNO51)，CEP2(SEQ ID NO52)，CEP3(SEQ ID NO53)，CEP4(SEQ IDNO54)，CEP5(SEQ ID NO55)，CIP4(SEQ ID NO56)，外被體α蛋白(SEQ IDNO57)，外被體γ蛋白(SEQ ID NO58)，Dia3(SEQ ID NO59)，MRCKα(SEQID NO60)，MRCKβ(SEQ ID NO61)，Spec1(SEQ ID NO62)和Spec2(SEQID NO63)。
在一些實施方案中，本發明方法中使用的GTP酶結合肽可以包含同時作為Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效應物的域。可充當Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效應物的域的實例包括，但不僅限於，CRIB域。能夠結合活化Rac小G蛋白或活化Cdc42小G蛋白的CRIB域的一種共有胺基酸序列是SEQ ID NO45。作為Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效應物的包含CRIB域的肽的實例包括，但不僅限於，MLK2(SEQ ID NO64)、MLK3(SEQ ID NO65)、Pak1(SEQ ID NO66)、Pak2(SEQ ID NO67)、Pak3(SEQ IDNO68)、Pak5(SEQ ID NO69)、Pak6(SEQ ID NO70)、Tre17(SEQ ID NO91)、和Par6(SEQ ID NO71)。其他作為Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白效應物的肽的實例包括，但不僅限於，IRSp53(SEQ ID NO72)、IQGAP-1(SEQ IDNO73)、IQGAP-2(SEQ ID NO74)、MEKK1(SEQ ID NO75)、MEKK4(SEQID NO76)、p70S6激酶(SEQ ID NO77)和PI3k，p85亞單位(SEQ ID NO78)。
在一些實施方案中，本發明方法所使用的GTP酶結合肽可以包含同時作為Rac小G蛋白的效應物和RhoA小G蛋白的效應物的域。作為Rac小G蛋白的效應物和RhoA小G蛋白效應物的肽的實例包括，但不僅限於，PIP5K(SEQ ID NO79)。
在一些實施方案中，本發明方法所使用的GTP酶結合肽可以包含這樣的域，所述域是針對活性形式的Rac小G蛋白、RhoA小G蛋白和Cdc42小G蛋白的結合蛋白。這類肽的實例包括，但不僅限於，PLD-1(SEQ IDNO80)、Vav PH、DH、CRD域(SEQ ID NO 81)。
在一些實施方案中，本發明方法所使用的GTP酶結合肽可以包含這樣的域，所述域是針對活性形式的Rnd2小G蛋白或TC10小G蛋白的結合蛋白。這類肽的實例包括，但不僅限於，針對TC10的PIST(SEQ ID NO95)、針對Rnd2的Rapostlin(SEQ ID NO96)和針對Rnd2的Pragmin(SEQ IDNO97)。
在一些實施方案中，Rho GTP酶結合肽或效應物被修飾，從而使全部或部分的內部半胱氨酸殘基突變成非半胱氨酸殘基。在一些實施方案中，Rho GTP酶結合肽或效應物被修飾，從而使其含有C末端半胱氨酸殘基。在一些實施方案中，Rho GTP酶結合肽包含不同效應物或者能結合Rho GTP酶蛋白質的蛋白質之片段的組合。
本領域中理解，要將兩種肽或蛋白質看作具有共同的或保守的肽域，或者將它們看作保守蛋白質家族的成員，其中一種肽或蛋白質的胺基酸序列並不需要與另一種肽或蛋白質100％相同。例如，對於短肽域(即少於50個胺基酸)而言，已發現有數種蛋白質具有稱作Cdc42/Rac相互作用性結合(CRIB)域的肽域。CRIB域是一種14-16個胺基酸的序列，具有8個保守殘基，先前已證明其參與信號分子與活化GTP結合形式的Rac和Cdc42的結合。共有CRIB域是I-S-X-P-X(4)-F-X-H-X(2)-H-V-G，其中括號內的數字代表可變(X)胺基酸殘基的總數。
對於較大的肽域，例如具有50個或更多個胺基酸的肽，當兩種或更多種蛋白質、肽或域是同源的、高度保守的或緊密相關時，給定的一種蛋白質、肽或域的胺基酸序列與另一種肽、蛋白質或給定的蛋白質內的域的胺基酸序列可以具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
一般地，在長度大於50個殘基、差異小於50-60％的多個序列或子序列中，有多種算法重現其比對的主要特徵。因此，長度大於50個胺基酸的緊密相關序列和蛋白質同源物將共有至少40％的胺基酸同一性，並且在一些實施方案中將共有至少40％-50％的胺基酸同一性，在一些實施方案中將共有至少50％-60％的胺基酸同一性，在一些實施方案中將共有至少60％-70％的胺基酸同一性，在一些實施方案中將共有至少70％-80％的胺基酸同一性，在一些實施方案中將共有至少80％-90％的胺基酸同一性，在另外一些實施方案中將共有至少90％-100％的胺基酸同一性。同源性可以用各種公眾可得的軟體工具進行計算，例如那些由NCBI(Bethesda，MD)開發的軟體工具，它們可通過網際網路(ftp「點」ncbi「點」nlm「點」nih「點」gov/pub/)獲得。工具的實例包括，但不僅限於，可通過網際網路的全球資訊網在「ncbi」點」nlm」點」nih」點」gov訪問的BLAST系統，和可通過網際網路的全球資訊網分別在「點」ebi「點」ac「點」uk/emboss/align/和ebi「點」ac「點」uk/clustalw/獲得EMBOSS成對比對算法(BLOSUM62矩陣設置)和ClustalW比對。
在一些實施方案中，本發明提供了用於檢測活化Rho GTP酶蛋白質的方法，包括使固體支持物與含活化Rho GTP酶蛋白質的樣品相接觸。固體支持物與活化Rho GTP酶結合肽連接。樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質與活化Rho GTP酶結合肽結合。檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質。在檢測期間，活化Rho GTP酶蛋白質保持與固體支持物聯結。作為非限制性實例，固體支持物是微量滴定板的孔，所述孔與Rho GTP酶結合肽連接，使含有活化Rho GTP酶蛋白質的樣品與所述微量滴定板接觸。在本實例中，Rho GTP酶結合肽和活化Rho GTP酶蛋白質彼此直接或者間接地通過複合物相互作用，而樣品中其餘的蛋白質和其他化合物被洗去或除去，留下活化Rho GTP酶蛋白質和固體支持物用於檢測步驟。因此，在本實例中，認為Rho GTP酶蛋白質保持與固體支持物聯結。相對地，在使用珠子的標準沉降測定中，其中Rh o GTP酶結合肽與珠子連接並與含有活化Rho GTP酶蛋白質的樣品接觸，在將活化蛋白質加載到凝膠或其他類型的分離介質(例如柱)上之前將活化蛋白質從珠子上被洗脫下來並與珠子分離，或者在檢測之前將活化蛋白質與固體支持物分離。然後對Rho GTP酶蛋白質進行檢測，但是它已經與固體支持物(例如珠子)分離，因此在標準沉降測定中，活化Rho GTP酶蛋白質在檢測步驟期間與固體支持物不保持聯結。
如這裡所使用的，當稱兩個蛋白質或組分「彼此結合」時，這可以表示它們直接彼此接觸或者彼此形成複合物但不直接接觸。
固體支持物可以是Rho GTP酶結合肽能夠結合的任何表面。實例包括，但不僅限於，微量滴定板、珠子、盤(discs)、微陣列、載玻片等。在一些實施方案中，固體支持物包括微量滴定板或微陣列，但不包括珠子或盤。在一些實施方案中，用試劑活化或包被固體支持物，其中所述試劑會將蛋白質共價附接於固體支持物，例如通過例如形成二硫鍵。這種試劑的實例包括，但不僅限於，馬來醯亞胺(malemide)。也可通過這樣的方式包被或修飾固體支持物，使得蛋白質可以通過非共價相互作用而與固體支持物結合或鍵合。例如，固體支持物可以包含穀胱甘肽，穀胱甘肽會與含有GST部分的蛋白質結合，或者固體支持物可以包含陽離子，陽離子使得含有組氨酸標籤的蛋白質與固體支持物結合。也可使用其他的修飾，包括但不僅限於，抗生物素蛋白-生物素、HA-血凝素等。
在一些實施方案中，本發明方法中使用的Rho GTP酶結合肽共價附接於馬來醯亞胺活化的板。馬來醯亞胺活化的板可以商購，並且設計成通過可用的-SH部分固定生物分子，其中-SH部分通常來自半胱氨酸殘基。馬來醯亞胺活化板的實例包括，但不僅限於，聚苯乙烯微量培養板，例如Costar的巰基結合板和條(Corning，Inc.Corning，NY)，Reacti-BindTM馬來醯亞胺活化板(Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL)和馬來醯亞胺活化微孔板-巰基-TRAPTM(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)。
在一些實施方案中，可以將本發明方法所用的效應物肽附接在帶有預活化的共價表面分子的固體支持物(例如微量滴定板或微陣列)上。這些板可以商購，表面對其偶聯配偶物(coupling partners)高度特異，因此用於以位點定向(site-directed)的方式固定生物分子。這些板的實例包括，但不僅限於，N-氧琥珀醯亞胺(DNA-BINDTM)活化板、醯肼(Carbo-BINDTM)活化板、Univer-BINDTM板(Corning，Inc.Corning NY)、Reacti-Bind中性抗生物素蛋白包被板、Reacti-Bind鏈黴親和素包被板、Reacti-Bind抗GFP包被板、Reacti-Bind抗GST包被板(Pierce Biotechnology，Rockland，IL)、Biotin-TrapTM、GST-TrapTM、Amine-TrapTM、Sugar-TrapTM、Streptavidin-TrapTM板(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)等。
在一些實施方案中，本發明方法所用的效應物肽可以和固體支持物(例如微量滴定板)連接(例如附接)，該固體支持物含有中度到高度結合性表面(medium to high binding surface)，其通過疏水或離子相互作用而被動地吸收生物分子。這些板的實例包括，但不僅限於，由Corning公司(Corning NY)、Pierce生物技術公司(Rockland IL)等製造的一系列EIA/RIA板。
在一些實施方案中，本發明方法所用的效應物肽可以連接於含有胺化或羧化表面的微量滴定板。通過這些表面使用雙功能交聯劑實現共價偶聯，所述雙功能交聯劑使表面上的胺基或羧基偶聯於肽上的官能團例如胺基、巰醇基或羧基。這些微量培養板包括，但不僅限於，由Corning公司(CorningNY)製造的聚苯乙烯或聚丙烯板系列。
在一些實施方案中，本發明方法所用的效應物肽可以是配置為容納給定反應體積的板。實例包括，但不僅限於，96孔板、384孔板、1536孔板等。在一些實施方案中，本發明方法所用的效應物肽可以以微陣列模式提供。
在一些實施方案中，對本發明方法所用的固定的效應物肽加以配製，使其可以在孔內或者在微陣列模式中凍幹，而且維持其在再水化時結合活化Rho GTP酶蛋白質的能力。
在一些實施方案中，被固定的肽是Rho GTP酶蛋白質，其產生效應物或效應物-HRP偶聯物的靶標。在此情況下，將所述模式設計為篩選抑制或提高這兩種蛋白質之間相互作用的配體。在此模式下，該測定方法可用於發現在藥物發現中有用的配體。
在一些實施方案中，測定(方法)包括將活性Rho結合肽或其片段固定(連接)於微量滴定板的孔。在一些實施方案中，該方法包括凍幹孔內的結合蛋白質從而產生高度穩定和穩健(robust)的蛋白質基質(matrix)；將固定的結合性蛋白與來自澄清或未澄清的細胞裂解物或組織樣品或重組來源的活化Rho GTP酶蛋白質共溫育；和用Rho GTP酶特異抗體對結合活化RhoGTP酶蛋白質的效應物的量進行定量。
本方法與先前用於確定Rho GTP酶蛋白質和其它小G蛋白活化狀態的基於效應物的方法相比具有很多優點。首先，本測定方法可產生附接於微量滴定孔或微陣列上的活化Rho GTP酶結合肽的穩定凍幹製劑，從而整個活化測定可以在單孔模式下進行，無需不斷地操作樣品，從而實現穩健性大大提高的測定。其次，在一些實施方案中，本方法不需要對含有Rho GTP酶蛋白質的細胞裂解物進行預澄清，從而可以更加容易地處理多個樣品，最大程度地減少GAP活性所造成的Rho活化的低估。第三，本測定方法比現有測定方法更加靈敏，可以使用更少量的細胞裂解物或總蛋白，這在可用的原始材料極少和需要高通量測定的情況下可能是相當重要的。
在一些實施方案中，本發明提供了對樣品(例如生物(組織、血液等)或細胞培養物)進行高通量篩選以定量其活化G蛋白狀態的方法。本發明還提供了抑制或增強或促進小G蛋白與其效應物蛋白之間的相互作用的化合物或生物分子的高通量篩選方法。所述方法的實例包括，但不僅限於，抑制或增強RhoA-Rho激酶相互作用、RhoA-Dia相互作用、RhoC-Rho激酶相互作用、Rac1-Pak相互作用、Cdc42-Pak相互作用的化合物。
在一些實施方案中，本發明涉及基於固體支持物(例如微量滴定板或微陣列)ELISA的活化Rho GTP酶蛋白質檢測方法。該方法包括使對活性Rho GTP酶特異的結合肽附接於固體支持物(例如微量滴定板或微陣列基質(matrix))的孔上，將該固定的活性Rho GTP酶結合肽與含有一種或多種活化Rho GTP酶蛋白質的樣品(例如細胞裂解物)共溫育，及使用對特定Rho GTP酶蛋白質的抗體(例如非特異或特異的)定量活化Rho GTP酶蛋白質。
在一些實施方案中，本發明方法所使用的抗體是Rho GTP酶蛋白質的單克隆、重組或多克隆抗體。這些抗體可以對一個家族成員或多個家族成員特異。這些抗體的實例包括，但不僅限於，小鼠單克隆抗RhoA抗體(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz CA)、小鼠單克隆抗泛-Rho(pan-Rho)抗體(BD Transduction Laborataries，San Diego CA)、雞多克隆抗RhoA抗體(Genway，Inc.San Diego CA)、小鼠單克隆抗Rho A，B，C抗體(CytoskeletonInc.)、小鼠抗RhoA抗體(Cytoskeleton Inc.)等。
在一些實施方案中，本發明方法所使用的抗體可以是與酶或可檢測生物分子偶聯的單克隆、重組或多克隆第一抗體。這些可檢測的偶聯抗體避免了使用第二抗體，從而提高了反應的特異性。偶聯抗體的實例包括，但不僅限於，HRP偶聯的第一抗體、AP偶聯的第一抗體、預先與鏈黴抗生物素蛋白-HRP偶聯物混合的生物素偶聯的第一抗體。
在一些實施方案中，本發明方法使用的抗體可以是針對Rho GTP酶蛋白質的特定效應物的單克隆、重組或多克隆抗體。
「對特定Rho GTP酶蛋白質特異的抗體」是指僅對一種Rho GTP酶蛋白質具有特異性，而不會與另外的Rho GTP酶蛋白質反應或檢測另外的RhoGTP酶蛋白質的抗體。在一些實施方案中，抗體可以是雙特異性的，從而它能夠結合或檢測兩種Rho不同的Rho GTP酶蛋白質。在一些實施方案中，抗體識別一種或多種Rho GTP酶蛋白質。在一些實施方案中，使用能夠檢測和結合超過兩種Rho GTP酶蛋白質的非特異性抗體。抗體可以對特定的Rho GTP酶蛋白質具有特異性，但是在一些實施方案中，抗體也可以僅識別活化形式的Rho GTP酶蛋白質，非活性形式的Rho GTP酶蛋白質，或者在一些實施方案中，抗體能夠同時識別活性或非活性形式。
在一些實施方案中，本發明提供了一種基於固體支持物(例如微量滴定板或微陣列)ELISA的活化重組Rho GTP酶蛋白質檢測方法。該方法可包括將Rho GTP酶特異性的結合肽(例如效應物肽)連接到微量滴定板孔或微陣列基質(matrix)的孔上；將固體的效應物肽與一種或多種活化的重組RhoGTP酶蛋白質共溫育；並使用對特定Rho GTP酶蛋白質特異性的抗體對活化Rho GTP酶蛋白質進行定量。
在一些實施方案中，Rho GTP酶蛋白質是Rho GTP酶的重組突變體形式和/或組成型活性突變體。本領域技術人員可以創造Rho GTP酶蛋白質的組成型活性突變體。在一些實施方案中，可以將效應物蛋白質或肽和固定的Rho GTP酶蛋白質共溫育，並使用效應物特異性抗體對Rho GTP酶效應物相互作用進行定量。
在一些實施方案中，本方法包括對活性Rho GTP酶蛋白質的量進行定量。
如這裡所使用的，「效應物特異抗體」是指僅結合一種效應物，而不能檢測或結合其它效應物的抗體。
在一些實施方案中，將細胞裂解物或樣品配製成含有緩衝組分的溶液，其pH為5-10，大約7.5，或者大約6-大約8，大約6-大約9，大約7-大約8，或大約7的pH。在一些實施方案中，含有效應物肽或Rho蛋白質的樣品可以包含去垢劑組分。去垢劑組分可以是，例如，非離子去垢劑，例如但不僅限於，Triton X-100。去垢劑的最終濃度可以是例如大約0.1、大約0.2、大約0.3、大約0.4、大約0.5、大約0.6、大約0.7、大約0.8、大約0.9、大約1.0、大約1.5、大約1-大約2、大約1-大約3、大約0.5-大約1.5、大約.75-大約1.25、大約1-大約5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、1-2、1-3、0.5-1.5、0.75-1.25、或1-5％。在一些實施方案中，細胞裂解物或樣品含有氯化鎂。在一些實施方案中，氯化鎂的最終濃度可以是例如大約5-大約80、大約10-大約50、大約15-大約25、大約20、5-80、10-50、15-25或20mM。
樣品或裂解緩衝劑還可以包含鹽組分。鹽組分的實例包括，但不僅限於，氯化鈉、氯化鉀等。鹽組分的最終濃度可以是例如大約10-大約700、大約100-大約500、10-700或者100-500、100、200、300、400、500、大約100、大約200、大約300、大約400、大約500mM。
在一些實施方案中，樣品或細胞裂解物中總蛋白的量是大約1-大約300、大約20-大約50、大約1-大約200、大約1-大約100、大約1-大約75、大約1-大約50、大約1-大約25、大約1-大約10、大約20、大約50、小於100、小於75、小於50、小於25、小於10、小於300、或者小於200μg。
在一些實施方案中，樣品包含大約103-大約106、103-大約105、103-大約104、104-大約105、小於106、小於105、或者小於104個細胞，或者用此處所示相同數目的細胞製備而得的細胞裂解物。
檢測Rho GTP酶結合肽與Rho GTP酶蛋白質(例如活化的或非活化的)之間的相互作用(例如結合)，可以使用任何可用於檢測該相互作用的方法或儀器來進行。例如，該檢測可以利用螢光、發光、吸光度的差異及其組合等。
在本發明的一些實施方案中，在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質之前，添加抗原提呈緩衝劑(APB)(也稱作「抗原提呈增強劑」)。抗原提呈緩衝劑包括一種或多種能夠降低固體支持物上活化Rho GTP酶蛋白質的損失的化合物或處理。在一些實施方案中，抗原提呈緩衝劑包括熱變性；乾燥變性；尿素處理；交聯劑如SMCC和戊二醛；乙醇或甲醇；或三氯乙酸；或其任意組合或亞組。在一些實施方案中，固體支持物上活化的Rho GTP酶蛋白質的損失減少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。在一些實施方案中，三氯乙酸的最終濃度為大約0.5-大約15％v/v。在一些實施方案中，TCA的最終濃度為大約0.5％-大約10％，大約0.5％-大約7.5％，大約0.5％-大約5％，大約0.5％-大約4％，大約0.5％-大約3％，大約0.5％-大約2％，大約0.5％-大約1％，大約0.5％，或者大約1％，小於10％，小於5％，小於4％，小於3％，或者小於2％v/v。
在一些實施方案中，在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質之前，添加結合緩衝劑(也稱作「蛋白蛋白相互作用增強劑」)。在一些實施方案中，結合緩衝劑使Rho GTP酶結合肽與Rho GTP酶蛋白質的結合親和力比沒有結合緩衝劑時提高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，提高到2倍，3倍，或者超過3倍。在一些實施方案中，結合緩衝劑包括水溶性聚蔗糖、葡聚糖或聚乙二醇，或者其任意組合或亞組。在一些實施方案中，聚乙二醇是PEG 4000或PEG 8000，最終濃度為大約2％-大約40％v/v。在一些實施方案中，PEG的最終濃度為大約2％-大約40％，大約2％-大約30％，大約2％-大約25％，大約2％-大約20％，大約2％-大約10％，大約2％-大約5％，大約2％，大約10％，大約20％，大約30％，大約40％。
在一些實施方案中，本方法進一步包括對樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質的量進行定量。對蛋白的量進行定量的方式對於本方法而言並不特定，任何定量方法均可使用。合適的方法包括，但不僅限於，螢光、發光或吸光度的差異。
在一些實施方案中，本方法進一步包括使樣品與測試劑接觸，並確定測試劑是否調節活化Rho GTP酶蛋白質與活化Rho GTP酶結合肽的結合。在一些實施方案中，測試劑將提高所述結合，在其他的實施方案中，測試劑將降低所述結合。測試劑可以是任何化合物或組合物，例如蛋白質、肽、有機小分子、碳水化合物等。如果測試劑抑制結合，則認為測試劑是抑制劑。可以將存在和不存在測試劑時Rho GTP酶蛋白質與Rho GTP酶結合肽的結合進行比較，以確定測試劑是否調節該結合。可以使用任何方法對該結合加以檢測或定量，包括這裡描述的那些方法。
在一些實施方案中，本發明提供一種檢測活化Rho GTP酶蛋白質的方法，包括使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質的樣品接觸，其中經過修飾的Rho GTP酶結合肽與固體支持物連接，並且其中經過修飾的RhoGTP酶結合肽與活化Rho GTP酶蛋白質的Kd低於(即結合親和力大於)未經修飾的Rho GTP酶結合肽與Rho GTP酶蛋白質的Kd；和檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質。在一些實施方案中，經過修飾的Rho GTP酶結合肽是寡聚化的Rho GTP酶結合肽或突變的Rho GTP酶結合肽。經過修飾的肽可以是任何如本文所描述的、且為本領域技術人員已知的肽，包括但不僅限於經修飾的Rho靶蛋白、經修飾的ROCK1、經修飾的PAK1、經修飾的POSH、或經修飾的WASP。
在一些實施方案中，本發明提供了檢測活化Rho GTP酶蛋白質的方法，包括使微量滴定板或微陣列與含有活化Rho GTP酶蛋白質的樣品接觸，其中活化Rho GTP酶特異性的抗體與微量滴定板或微陣列連接；和檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質。
在一些實施方案中，本發明提供了鑑定活化Rho GTP酶結合肽的方法，包括在可選地存在抗原提呈緩衝劑的條件下，使測試劑與活化Rho GTP酶蛋白質接觸；和檢測Rho GTP酶蛋白質與測試劑的結合，其中檢測到結合表明測試劑是活化Rho GTP酶結合肽。
在一些實施方案中，本發明提供的方法進一步包括使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質的樣品接觸，其中固體支持物與測試劑連接；和檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質。
在一些實施方案中，本發明提供了確定抗原提呈緩衝劑是否有利於檢測活化Rho GTP酶蛋白質與活化Rho GTP酶結合肽的結合的方法，包括使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質的樣品接觸，其中Rho GTP酶結合肽連接於固體支持物；和以不同的時間間隔檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質，其中不同時間間隔的檢測結果降低表明抗原提呈緩衝劑是有利的。
在一些實施方案中，本發明提供了確定測試緩衝劑是否是抗原提呈緩衝劑的方法，包括使固體支持物與測試緩衝劑和活化Rho GTP酶蛋白質接觸，其中活化Rho GTP酶結合肽連接於固體支持物；和以不同時間間隔檢測活化Rho GTP酶蛋白質與活化Rho GTP酶結合肽的結合，其中如果存在測試緩衝劑時沒有觀察到檢測結果與不存在測試緩衝劑相比降低，則測試緩衝劑是有助於檢測活化Rho GTP酶結合肽與活化Rho GTP酶蛋白質之結合的抗原提呈緩衝劑。如果不存在測試緩衝劑時，檢測結果降低，而測試緩衝劑的存在防止檢測結果的降低，則測試緩衝劑是APB。
在一些實施方案中，本發明提供了組合物，所述組合物包括固體支持物；抗原提呈緩衝劑；活化的Rho GTP酶蛋白質；和活化Rho GTP酶結合肽或經過修飾的Rho GTP酶結合肽。
在一些實施方案中，本發明提供了試劑盒，所述試劑盒包括固體支持物和活化Rho GTP酶結合肽，其中活化Rho GTP酶結合肽可選地連接於固體支持物；和可選的抗原提呈緩衝劑。在一些實施方案中，該試劑盒包括共價連接於固體支持物的Rho GTP酶結合肽。在一些實施方案中，試劑盒進一步包括陽性對照，其中陽性對照包括能夠結合Rho GTP酶結合肽的活化Rho GTP酶蛋白質。在一些實施方案中，該試劑盒包括抗原提呈緩衝劑，其含有三氯乙酸(TCA)。在一些實施方案中，該試劑盒包括結合緩衝劑，例如葡聚糖、水溶性聚蔗糖、PEG、或其組合。
在一些實施方案中，該試劑盒包括Rho GTP酶結合肽，其是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH或WASP。在一些實施方案中，該試劑盒進一步包括關於實施活化Rho GTP酶蛋白質檢測的指導。
在一些實施方案中，該試劑盒包括用於檢測Rho GTP酶結合肽與活化Rho GTP酶蛋白質之間結合的因子(agent)，其中該因子為發光性、螢光性或放射性。在一些實施方案中，該試劑盒包括的固體支持物是微量滴定板、微陣列、或載玻片，其中固體支持物可選地用馬來醯亞胺活化或者以其它方式活化或者如本文所述地包被，以便於Rho GTP酶結合肽結合固體支持物。
為了使這裡公開的發明被更加有效地理解，下文提供了實施例。應當理解，這些實施例只是出於舉例說明的目的，不可解釋為對本發明有任何方式的限制。在所有這些實施例中，除非特別說明，否則分子克隆反應和其他的標準重組DNA技術是根據下文描述的方法使用可商購的試劑進行的Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor出版公司(1989)。
實施例 實施例1用於G-LISA測定的效應物-GBD肽的製備 一些序列基序是Rho GTP酶效應物的多個亞群之間共有的，例如，Cdc42/Rac相互作用性結合(CRIB)基序存在於許多，雖然不是所有的Rac和Cdc42結合性蛋白中(Burbelo et al.，1995，J.Biol.Chem.，27029071-29074)，並且已經發現它對於效應物結合而言是必要但非充分的(Rudolph et al.，1998，J.Biol.Chem.，27318067-18076)。另一種常見的Rho效應物基序是在PRK1和PRK2中發現的Rho效應物同源性(REM)以及在效應物如rhophilin和Rho靶蛋白中發現的HR1重複基序(Flynn et al.，1998，J.Biol.Chem.，2732698-2705)。然而，有大量效應物不含有任何目前已經鑑定的GTP酶結合基序。這些包括POSH、PI3K和DAG效應物(Bishop et al.，2000，Biochem.J.，348241-255)。這類蛋白質純粹是基於其可區分結合GTP(活化)和GDP(非活化)形式的Rho GTP酶的功能上的能力才歸類為Rho效應物的(Tapon，1998，EMBO J.，171395-1404；和Kobayashi et al.，1998，J.Biol.Chem.，273291-295)。因此，本領域技術人員公認，目前Rho效應物是通過其選擇性識別結合GTP(活化)形式的Rho GTP酶，而不識別非活化的GDP形式的GTP酶的功能上的能力來定義的(Vetter et al.，2001，Science，2941299-1304；Blumenstein et al.，2004，J.Biol.Chem.，27953419-53426；Martin et al.，1995，EMBO J.，141970-1978；Leung et al.，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.，1025685-5690；Bishop et al.，2000，Biochem.J.，348241-255；和Fujisawa etal.，1998，J.Biol.Chem.，27318943-18949)。
這裡提供的實施例採用了6種被表徵最多的Rho效應物，或者更具體地說，Rho效應物-GTP酶結合域(GBD)肽。表1詳細描述了效應物以及效應物對活化Rho家族蛋白的特異性。
表1活化Rho家族蛋白質的效應物識別 材料和方法 效應物cDNA克隆 這裡作為實例提供的所有效應物蛋白質和效應物GTP酶結合域(GBD)，先前均已描述了全長哺乳動物cDNA(見表2)。使用表2所示的引物和cDNA來源，通過PCR克隆了效應物-GBD肽。表2中的核苷酸編碼相應於Genbank的提交編碼方案。GTP酶結合域(GBDs)是根據鑑定效應物活化Rho結合域的已公開數據選擇的(見表1)。
表2效應物克隆信息 *下劃線表示半胱氨酸密碼子 本文中表2以及任何其他地方提供的GenBank登錄號的序列均全部引用併入本文。
修飾效應物-GBD DNA序列以便定向共價結合於馬來醯亞胺活化板 在效應物-GBD肽共價連接於馬來醯亞胺活化板的場合(見本實施例下文及表3)，對效應物-GBD肽DNA進行修飾，使之在羧基末端含有單個半胱氨酸殘基。將半胱氨酸密碼子工程化到ROCK1、PAK1和WASP的引物設計中(見表2，3』引物中的半胱氨酸密碼子用下劃線表示)。在POSH的場合，利用了鄰近羧基末端的半胱氨酸密碼子(351位)。
Rho靶蛋白的效應物-GBD含有3個內部半胱氨酸殘基(表2和圖1)。為使Rho靶蛋白-GBD可以定向結合於馬來醯亞胺板，化學合成Rho靶蛋白-GBD(Entelechon GmbH，St.Veit-Weg 2，93051 Regensburg，Germany)，除去3個內部半胱氨酸，並分別用穀氨酸(aa# 43)、亮氨酸(aa# 49)和絲氨酸(aa# 65)代替。將一個半胱氨酸密碼子置於修飾的Rho靶蛋白-GBD的羧基末端，緊鄰在終止密碼子的上遊。合成Rho靶蛋白-GBD序列的設計用Leto 1.0基因優化軟體執行，該軟體是基於一種專有權所有的遺傳算法(Entelechon GmbH，St.Veit-Weg 2，93051 Regensburg，Germany)。序列設計可以使密碼子用法、同源GC含量、mRNA二級結構、密碼子和基序重複以及限制性位點得到優化。合成的Rho靶蛋白-GBD DNA由Entelechon GmbH在pUC18克隆載體中提供。根據製造商說明書(Promega Corp.，Madison，WI)用限制性酶BamH1和EcoR1切割該DNA，將含有修飾Rho靶蛋白-GBD的273 bp DNA片段直接克隆到表達載體pGEX-4T的BamH1和EcoR1位點中，形成在氨基末端與穀胱甘肽S轉移酶標籤融合、且在羧基末端含有獨有的(unique)半胱氨酸殘基的Rho靶蛋白-GBD域。全部分子生物學操作均根據MolecularCloning，A Laboratory Manual，1998，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress.，Ed.Sambrook等中概述的一般原則進行。
表達質粒載體骨架和純化標籤 這裡描述的實施例採用表達載體pRSET-A(Invitrogen Corp.，GrandIsland，NY)，其含有一個N-末端組氨酸標籤(His-tag)，和pGEX-4T(GEHealthcare(Pharmacia Inc.)，Piscataway，NJ)，其含有一個N-末端GST-標籤。位於帶GST-標籤的構建體與感興趣的效應物-GBD肽之間的凝血酶蛋白酶位點允許通過凝血酶切割除去GST標籤。表3記載了實施例中使用的各種效應物-GBD的克隆所用的載體。表3還記載了用於效應物-GBD肽純化的標籤以及將肽連接於微量滴定板的方法。微量滴定板包被的細節在實施例2中提供。
表3效應物純化標籤和板結合標籤 效應物蛋白質表達 在加有合適抗生素(典型的是50μg/ml的氨苄青黴素)的培養基(典型的是LB培養基)中培養含有表達構建體(例如表2中描述的質粒)的細菌培養物(例如BL21(DE3)或BL21)。培養物在37℃、200rpm震蕩條件下生長，直到OD600達到大約0.6。為了誘導蛋白質產生，添加IPTG至0.2mM，室溫下繼續震蕩(典型地12小時)。在誘導之前，收集少量細菌樣品(典型地1ml)並保存在-20℃。在誘導之後，收集少量所述細菌的樣品(典型地1ml)並保存在-20℃。通過以6,000g離心沉澱細菌收穫剩餘的培養物。細菌沉澱可以保存在-20℃直至加以處理。使用上面提到的1ml細菌樣品通過比較誘導與未誘導的細菌沉澱中的重組蛋白質的水平來確定重組蛋白質的誘導效率，典型地，該分析通過在SDS-PAGE系統中進行蛋白的考馬斯染色來實施。
效應物蛋白質純化 將細菌沉澱重懸在裂解緩衝劑(典型地每升培養物20ml)中。用於帶His標籤的蛋白質的裂解緩衝劑典型地為50mM Tris pH 7.5、50mM NaCl、0.5mM MgCl2和5mM咪唑。用於帶GST標籤的蛋白質的裂解緩衝劑典型地為50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl和2mM EDTA。使重懸的細胞通過4層粗棉布除去細胞碎片，再通過高壓微射流設備(Model M-110L，Microfluidics)裂解細胞。裂解物通過60,000g離心步驟加以澄清。
帶組氨酸標籤的蛋白通過固定化金屬親和色譜(IMAC)(Bornhorst et al.，2000，Methods in Enzymology，326245-254)加以純化。簡而言之，將裂解物與金屬螯合的珠子(典型地是鎳或鈷珠子，每升細菌培養物1ml珠子)共溫育。將珠子/裂解物混合物在4℃溫育30-60分鐘。用含有10mM-30mM濃度的咪唑的清洗緩衝劑(50mM Tris pH 7.5，0.5mM NaCl)清洗珠子。在3-5珠子體積的洗脫緩衝劑(500mM咪唑，200mM NaCl，50mM Tris pH 7.5，1mM MgCl2)中洗脫重組效應物蛋白質，並保存在-70℃。
通過穀胱甘肽親和色譜純化帶GST標籤的蛋白質(Smith，2000，Methodsin Enzymology，326254-270)。簡而言之，將裂解物與穀胱甘肽珠子(典型地，每升細菌培養物1ml珠子)在4℃溫育1小時。然後用等體積的裂解緩衝劑清洗珠子3次，再用3-5珠子體積的洗脫緩衝劑(裂解緩衝劑加10mM還原穀胱甘肽)洗脫重組帶GST標籤的效應物蛋白質，並保存在-70℃。
帶GST標籤的效應物-GBD肽的凝血酶切割 規程遵循Meth.Enz.1995，256178中概述的程序。簡而言之，將結合在穀胱甘肽珠子上的帶GST標籤的蛋白在加有1％Triton X-100的PBS中清洗3次，在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl和2.5mM CaCl2中清洗3次。最後將珠子重懸在等體積的鈣緩衝劑中。向珠子添加牛α凝血酶(Sigma)，每mg蛋白30個單位。在4℃迴旋條件下進行2-5小時的切割。通過離心除去珠子，保留經過切割的蛋白質，並保存在-70℃。
沉降測定 將經修飾的GST Rho靶蛋白-GBD肽結合於穀胱甘肽珠子，將20μg結合於珠子的效應物添加到500μl(250μg)澄清的負載GTPγS或GDP的(GTPγ S or GDP loaded)血小板提取物中(裂解物製備見實施例2)。將混合物在4℃迴旋溫育1小時。然後將珠子在清洗緩衝劑(50mM Tris pH 7.5，100mMNaCl，和30mM MgCl2)中清洗2次，重懸在1珠子體積的SDS樣品緩衝劑(75mM Tris pH 6.8、2％SDS、10％甘油、5％β-巰基乙醇和2mg/ml溴酚藍)中，並進行SDS-PAGE(4-20％梯度)。將蛋白質轉移到PVDF膜(批號IPVH304F0，Millipore，Bedford，MA)，之後用0.25μg/ml抗RhoA(批號ARH01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，0.25μg/ml抗Rac1(批號ARC01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，1μg/ml抗Cdc42(批號ACD01，CytoskeletonInc.，Denver，CO)進行Western印跡。用特異識別RhoA蛋白質的第一抗體和山羊抗小鼠第二抗體(Jackson Labs.，批號115-035-068)檢測活化RhoA蛋白質條帶。測定至少執行8次。
結果 效應物-GBD克隆 確證了表2所述的全部效應物-GBD cDNA序列均與公開的Genbank序列匹配。此外，也確證了ROCK1、PAK1和WASP構建體中工程化的羧基末端半胱氨酸密碼子的存在。
圖1B詳細描述了合成Rho靶蛋白-Cys-GBD域的序列。合成的與野生型Rho靶蛋白-RBD序列的比較證實，合成構建體中全部3個內部半胱氨酸殘基均被除去，並替代為穀氨酸(aa# 43)、亮氨酸(aa# 49)和絲氨酸(aa# 65)。序列分析也確證了為定向結合馬來醯亞胺板的目的而引入的羧基末端半胱氨酸的存在(圖1B)。利用表2中引物所記載的限制位點克隆cDNAs。野生型和修飾Rho靶蛋白-Cys-GBD的DNA和胺基酸序列。野生型和Cys突變體效應物-GBD之間的胺基酸殘基改變用粗體和下劃線表示。
效應物表達和純化 典型的效應物-GBD肽純度為70-80％，這是通過對SDS-PAGE凝膠上依分子量分離並經考馬斯染色的肽進行密度掃描測定而確定的(圖1A)。簡而言之，將PAK1-GST(30μg)、ROCK1-His(10μg)、WASP-His(20μg)、POSH-His(20μg)、Rho靶蛋白-Cys-無標籤(用凝血酶切去GST標籤)(10μg)、Rho靶蛋白野生型GBD-GST(20μg)和Dia1-GST(15μg)的經過純化的GBD域加載到SDS-PAGE上，用考馬斯藍對蛋白質凝膠染色。
效應物-GBD生物活性的確證 針對全部效應物-GBD肽，通過GST沉降(Figure 1C顯示修飾Rho靶蛋白-Cys，數據未顯示)或G-LISA測定(數據未顯示，見實施例2)來確定效應物-GBD肽的選擇性結合活化Rho蛋白質的能力。簡而言之，將50μg純化的Rho靶蛋白-Cys GBD突變體珠子與500μg負載GDP或GTPγS的血小板提取物共溫育，對珠子沉澱的RhoA-GTP進行SDS-PAGE，並用抗RhoA抗體對其進行Western印跡分析。
討論 目前Rho家族有21個成員，如Wennerberg et al，2005，J.Cell Sci.，118843-6和Schnelzer et al.，2000，Oncogene，193013-3020定義的。它們是RhoA，RhoB，RhoC，RhoD，Rnd3，Rnd1，Rnd2，Rif，RhoG，RhoH，Rac1，Rac1b，Rac2，Rac3，Cdc42，TC10，TCL，Wrch-1，Wrch-2，RhoBTB1和RhoBTB2。
本實施例使用的效應物-GBD肽的組合能夠選擇性結合21個Rho家族成員當中的13個，或者說全部Rho家族成員中62％的活化形式(見表1)。這包括表徵最全面的Rho蛋白質，即RhoA，Rac1和Cdc42，如PubMed引用數所表明的(1996-2006年PubMed引用數RhoA(2467)，Rac1(1931)，Cdc42(2455)，RhoB(283)，RhoC(117)，RhoD(187)，Rnd3(23)，Rnd1(31)，Rnd2(15)，Rif(作為Rif小G蛋白檢索)(5)，RhoG(83)，RhoH(26)，Rac2(219)，Rac3(85)，TC10(70)，TCL(作為TCL小G蛋白檢索)(6)，Wrch-1(6)，Wrch-2(4)，RhoBTB1(4)，RhoBTB2(6)，Rac1b(22))。因為任何給定的效應物通常都會結合超過一種Rho GTP酶，所以針對特定內源Rho GTP酶的檢測和定量的測定特異性依賴於效應物-GBD和Rho GTP酶特異性抗體的組合。使用效應物和抗體組合獲得Rho GTP酶特異性，使本測定方法與其他僅利用效應物「特異性」的活性Rho GTP酶檢測系統(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)相比具有優勢。
在剩餘的所有實施例中均將述及此處提出的效應物，然而本領域技術人員理解，這裡公開的方法、測定法等同樣適用於任何Rho效應物-GBD。當認為Vetter et al.，2001，Science，2941299-1304，「Effectors for GTP-bindingproteins are operationally defined as molecules interacting more tightly with theGTP-bound than with the GDP-bound form」中限定的Rho效應物的定義被本領域技術人員公認為Rho GTP酶效應物的實際定義時尤其如此。還應當理解，本發明的實施方案完全依賴於Rho GTP酶效應物的實際操作上的定義。
實施例2共價連接的效應物-GBD板在G-LISA測定中的效用 本領域中描述了許多用於將特定肽連接於微量滴定板或微陣列的化學(Dent et al.，1998，Bioconjugation，Macmillan Reference Ltd，Chapter8505-556)。在最廣泛的意義上，連接可以分成共價和非共價模式。這兩種連接類型在這裡均有展示(見非共價連接，實施例7)。這裡描述的實施例詳細描述了通過馬來醯亞胺活化的板進行共價連接的方法。
肽通過活化的表面基團與微量滴定板的共價連接在原子共享電子而生成化學鍵時發生。雖然形成這些鍵的反應在理論上總是可逆的，但是實際上發生逆反應的概率很低，以致可以認為產物是永久性的(Dent et al.，Bioconjugation，Macmillan Reference Ltd，1998，p.218-342)。肽連接的實質上的不可逆性，具有形成非常穩定的、不會發生生物分子的損失、置換或表面遷移的效應物-GBD基質(matrix)的潛在優勢(Larsson et al.，1987，J.Immunol.Meth，98129135；Dent et al.，1998，BioconjugationProtein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences，Chapter 8，Other Categories of proteinCoupling，p.505-556)。出於這個原因，我們決定深入探討共價連接模式(但也參見實施例7的非共價連接)。
有多種類型共價連接板化學可以用來將肽與板連接，包括但不僅限於，共價偶聯伯胺基團的N-琥珀醯亞胺酯(NOS)表面(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)和與脂肪族碳-氫鍵反應的Univer-BINDTM板(Corning，Inc.，NY)。本實施例中描述的板化學是馬來醯亞胺板，它們可商購，並設計成通過可用的-SH部分(其通常來自偶聯肽內的半胱氨酸殘基)來固定生物分子。馬來醯亞胺活化的微量培養板的實例包括，但不僅限於，聚苯乙烯微量培養板如Costar’s巰基結合板和條(Costar’s Sulfhyryl Binding Plates and Strips，Corning，Inc.Corning，NY)，Reacti-BindTM馬來醯亞胺活化板(PierceBiotechnology，Inc.Rockford，IL)，和馬來醯亞胺活化微孔板--巰基-TRAPTM(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)。通過半胱氨酸殘基的連接為工程化產生含有單個半胱氨酸從而可以在板上定向的肽提供了機會(見實施例1)。預計均一的效應物定向可產生重複性更高、整體變異係數更低的板(Dent et al.，1998，BioconjugationProtein Coupling Techniques forthe Biomedical Sciences，Chapter 8，Other Categories of protein Coupling，p.505-556)。
材料和方法 效應物GBD肽共價附接於馬來醯亞胺板 將效應物-GBD肽(ROCK1，POSH或WASP，見表2)在包被緩衝劑(PBSpH 7.2加1mM EDTA)中稀釋到最終濃度為0.05mg/ml，並將5μg肽添加到馬來醯亞胺板(Corning Inc.，批號2510)的孔中。將板在21℃溫育2小時，在PBS pH 7.2中清洗2次。將板在室溫下用牛奶(典型地為0.1-5％，取決於效應物-GBD)封閉1小時。用PBS(pH 7.2)清洗2次後，向每個孔添加凍幹緩衝劑(5％蔗糖和1％葡聚糖)，將板凍幹並乾燥貯存在4℃。
組成型活性重組Rho蛋白質 Rho A第63位胺基酸或者Rac1和Cdc42第61位胺基酸由穀氨醯胺突變成亮氨酸，將產生不能水解GTP而成為組成型活性的肽(Xu et al.，1994，J.Biol.Chem.，26923569-23574；and Nobes et al.，1994，Curr.Op.Gen.Dev.，477-81)。所述突變體蛋白可作為帶組氨酸標籤的肽商購(Cytoskeleton Inc.批號R6301(組成型活性的RhoA)、R6101(組成型活性的Rac1)和C6101(組成型活性的Cdc42)。典型地，將組成型活性蛋白質在細胞裂解緩衝劑(50mMTris pH 7.5，300mM NaCl，2％IGEPAL，0.01％SDS，和10mM MgCl2)中稀釋到0.2ng/μl，一次G-LISA測定中使用1-5ng蛋白質。
體外製備負載核苷酸的細胞裂解物 可以使細胞裂解物負載GTP、GTPγS或GDP，並廣泛用作標準沉降測定的對照(Knaus et al.，1992，J.Biol.Chem.，26723575-23582)。人工負載的裂解物也可為給定G-LISA測定的開發提供穩健的底物。將細胞裂解緩衝劑(50mM Tris pH 7.5，300mM NaCl，2％IGEPAL，0.01％SDS，和10mM MgCl2)中4mg/ml的人血小板提取物通過4℃ 8,000g離心3分鐘進行澄清。添加EDTA至終濃度15mM。向不同等份的澄清裂解物中添加GTPγS、GTP或GDP至終濃度1mM。將每種裂解物在室溫下溫育15分鐘，以容許向Rho蛋白質交換(加載)核苷酸。添加60mM MgCl2終止加載反應。將裂解物在細胞裂解緩衝劑中稀釋至0.5mg/ml，並用於G-LISA測定。典型地，每次G-LISA測定使用7-15μg負載的血小板細胞裂解物。在本實施例中，將負載有GTP的血小板稱作不穩定(labile)GTP提取物。
G-LISA測定 將活性Rho蛋白質(典型地，7-15μg總細胞裂解物或1-5ng組成型活性重組蛋白質)直接添加到結合有效應物的G-LISA板(Rac1和Cdc42G-LISAs)，或者用等體積的結合緩衝劑(20％PEG 8000，Sigma，St.Louis，MO)稀釋後添加到結合有效應物的板(RhoA G-LISA)。將反應物於4℃在微量滴定板搖床上溫育30分鐘，之後用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％ Tween-20)清洗孔1次，並立即用200μl抗原提呈緩衝劑(1％三氯乙酸(TCA))室溫處理孔2-5分鐘。然後，將孔用PBST清洗3次，每次200μl，再添加第一抗體，典型地為1μg/ml(RhoA特異)、0.25μg/ml(Rac1特異)、1μg/ml(Cdc42特異)，並在室溫溫育45分鐘(4℃溫育得到相似的結果)。將孔用PBST清洗3次，每次200μl，再與合適的第二抗體在室溫下溫育45分鐘(4℃溫育得到相似的結果)。對於RhoA和Rac1反應，使用2μg/ml山羊抗小鼠第二抗體，對於RhoA，B，C反應，使用0.5μg/ml驢抗雞第二抗體，對於Cdc42反應，使用0.5μg/ml山羊抗綿羊第二抗體。將孔用PBST每次200μl清洗3次後，利用吸光度或發光檢測法來檢測活化的Rho蛋白質，如下文所述。
用吸光度或發光測定法測量G-LISA測定 添加50μl OPD底物(Sigma批號P9187)，在37℃保持15分鐘，隨後添加50μl終止緩衝劑(1M硫酸)，之後用分光光度計(SpectraMax 250，Molecular Devices)測量OD490的吸光度。添加50μl lumigen試劑(LumigenInc.，批號PSA-100)，典型地設置為100-150增益和10-100ms積分，用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)測量發光。
抗體 在本實施例中用於G-LISA測定的第一抗體和第二抗體，以及當在其他實施例中被提及用於G-LISA測定時的第一抗體和第二抗體，是下列抗體抗-RhoA(批號BK124中的克隆384或Part#GL01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，抗-RhoA，B，C(批號BK120中的克隆419或Part#GL04)，抗-Rac1(批號BK122h中的Part# GL06，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，抗-Cdc42(批號ACD02，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，山羊抗小鼠和驢抗綿羊抗體(批號115-035-068和313-005-045，Jackson ImmunoResearch labs.Inc.，West Grove，PA)。
結果 效應物-GBD馬來醯亞胺板對於檢測特異性Rho GTP酶的效用 對於給定的Rho GTP酶的細胞水平，已公開的估計值典型地為每個細胞1 x 10-4ng的範圍(2003，J.Immunol.，1705652-5657；和Quinn et al.，1993，J.Biol.Chem.，26820983-20987)。而且，根據公開的數據可以假定，一種特定Rho GTP酶中典型地有大約2-10％會響應於任何特定的刺激而活化(Ren etal.，1999，EMBO J.，18578-585；Bernard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；和Werner et al.，2002，J.Cell Biol.，158357-368)。進一步，根據公開的數據，一個標準沉降測定典型地需要1 x 106-1 x 107個細胞或300-800μg總細胞蛋白(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272；和Werner et al.，2002，J.Cell Biol.，158357-368)，這個量的裂解物相當於大約100-1000ng的特定Rho蛋白質(活化和非活化構象合起來)。因此，假定有2-10％的特定Rho GTP酶響應於特定刺激而活化，則在標準沉降測定中關注相應於2-100ng範圍的活化RhoGTP酶的信號。
考慮到上面的計算，使用5ng重組組成型活性Rho GTP酶進行G-LISA初始試驗。該蛋白量被認為接近於沉降測定的較低檢測水平(lower levels ofdetection)，並且，由於希望最終使用的細胞裂解物遠少於300-800μg，所以應設計初始試驗以獲得相當嚴格的檢測水平。使用組成型活性形式的RhoGTP酶是初始試驗的合理選擇，因為它們是明確且易於解釋的系統。
典型地，Rho效應物與活化Rho蛋白質的多於一種同型(isotype)結合(見實施例1，表1)。例如，ROCK1(和ROCK1-GBD)識別RhoA、RhoB和RhoC以及RhoE/Rnd3的活化形式(Fujisawa，1996，J.Biol.Chem.，27123022；和Riento et al.，2003，Mol.Cell.Biol.，234219)。因此，特定G-LISA測定的特異性取決於效應物和抗體二者的選擇。所以，在一個ROCK1-GBD板的實例中(圖2A)，RhoA特異性是通過組合使用ROCK-GBD板與RhoA特異抗體(克隆384)來提供的。
參考圖2A，按照「材料和方法」中的詳述，對僅裂解緩衝劑(空白)，5ng RhoA(63L)、Cdc42(61L)或Rac1(61L)進行RhoA G-LISA測定，並按照「材料和方法」中描述的發光測定法(luminometry)檢測RhoA信號。圖2A顯示，組合使用ROCK1-GBD馬來醯亞胺板(ROCK板)和RhoA特異抗體(克隆384)，以5ng組成型活性RhoA產生的信號是背景(僅緩衝劑)的6倍高。對於該板，組成型活性Cdc42和Rac1未產生高於背景的信號。因此可以得出結論，該ROCK1-GBD板能夠結合活性RhoA，且該RhoA抗體能夠特異地檢測到高於背景的該水平的蛋白質。抗體384對RhoA特異，如圖7A所證實的。經測試，Rho靶蛋白-Cys效應物-GBD選擇性結合RhoA。這種經修飾地效應物-GBD對於組成型活性RhoA所產生信號是背景的6倍高(數據未顯示)。
參考圖2B，按照「材料和方法」中的詳述(實施例2)，對僅裂解緩衝劑(空白)，5ng Rac1(61L)或RhoA(63L)進行Rac1G-LISA測定，並按照「材料和方法」中的描述，通過490nm吸光度來檢測Rac1信號(實施例2)。類似地，圖2B顯示，組合使用Rac1特異性抗體(GL06，批號BK122h)和結合POSH的馬來醯亞胺板(POSH板)，以5ng組成型活性Rac1給出的信號是背景的9倍高。正如預期的那樣，組成型活性RhoA給出的信號幾乎不高於背景。
參考圖2C，按照材料和方法中的詳述對僅裂解緩衝劑(空白)，5ngCdc42(61L)或Rac1(61L)進行Cdc42G-LISA測定(實施例2)，並按照如材料和方法中的描述通過490nm吸光度來檢測Cdc42信號(實施例2)。圖2C顯示，與Cdc42特異抗體(批號ACD02，Cytoskeleon Inc.，Denver，CO)組合使用的WASP結合馬來醯亞胺板(POSH板)對5ng組成型活化Cdc42發出的信號是背景的5倍。正如預期，組成型活化Rac1給出的信號不高於背景。
總之，圖2中的數據證明，連接馬來醯亞胺的效應物-GBD保持識別其靶標活性Rho GTP酶的能力。而且，與合適的抗體組合後，能夠檢測低納克水平的特定活性Rho GTP酶。
效應物-GBD馬來醯亞胺板對於區分活化和非活化Rho GTP酶的效用 G-LISA不但應該檢測特定的活化Rho GTP酶，它們還必須能夠區分特定Rho蛋白質的活化(GTP結合)和非活化(GDP結合)狀態。使用人工負載的血小板提取物，對效應物-GBD馬來醯亞胺板進行了測試(詳見「材料和方法」)。本實施例中的人工負載提取物的內源GTP酶已經在體外被加載了GTPγS(一種可緩慢水解的GTP類似物)或GDP。因為GTPγS是基本上不可水解的，所以來自活化樣品的信號非常穩定。這與正常的細胞裂解物相反，在正常細胞裂解物中，Rho GTP酶容易發生由GTP酶活化蛋白(GAP)增強的GTP水解並因此失活(Moon et al，2003，Trends Cell Biol.，1313-22)。本領域技術人員公認，在需要穩健的Rho活化(典型地>10％活化)同時有限地涉及Rho水解的場合，含有人工負載的固定活化狀態的內源Rho蛋白質的裂解物是有用的(Liseti et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
參考圖3A，將僅裂解緩衝劑、25μl GDP或GTPγS標記的血小板提取物(0.5mg/ml)(或15μg)與相同體積的結合緩衝劑混合，並進行標準RhoAG-LISA測定。按照「材料和方法」所述通過發光測定法檢測RhoA信號。使用ROCK-GBD馬來醯亞胺板。結果顯示，ROCK板的結合性質使得清晰區分活性RhoA(GTPγS)和非活性(GDP)RhoA成為可能，在此測定中活性RhoA的信號是非活性RhoA的7倍高。
參考圖3B，按照「材料和方法」中的詳細敘述，對50μl的僅裂解緩衝劑，GDP或GTPγS標記的血小板提取物(0.5mg/ml)(或15μg)進行Rac1G-LISA測定。按照「材料和方法」所述通過490nm吸光度檢測Rac1信號。使用POSH-GBD馬來醯亞胺板。結果顯示，POSH板的結合性質使得清晰地區分活性Rac1(GTPγS)和非活性(GDP)Rac1成為可能，在此測定中活性Rac1的信號是非活性Rac1的30倍高。
總之，圖3中的數據表明，馬來醯亞胺連接的效應物-GBD保持了區分特定Rho GTP酶的活性形式與非活性形式的能力。而且，活性Rho GTP酶信號可以利用基於發光測定法(圖2A)或吸光度(圖2B)的方法加以檢測。
實施例3用於G-LISA的抗原提呈緩衝劑的開發 最初嘗試在RhoA:ROCK和Rac1:POSH G-LISA測定中檢測活性RhoGTP酶沒有成功，因為無法獲得在這兩種測試的任一種中顯著高於背景的信號(圖5A(未處理)和5B(無APB))。最初的一種策略是按照與原本的沉降測定法基本上類似的規程來開發基於ELISA的測定法，其中原本的沉降測定法是Benard等描述的用於Rac1:PAK沉降測定(1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)的沉降測定法，以及Ren等和Kranenburg等描述的用於RhoA:Rho靶蛋白沉降測定的沉降測定法(分別為1999，EMBO J.，18578；和1999，Mol.Biol.Cell，101851-1857)。相同的程序還被用於利用ROCK、Citron、Dia和WASP的沉降測定(Kimura et al.，2000，J.Biol.Chem.，27517233-17236，和Edlund et al.，2002，Mol.Biol.Cell，13902-914)。簡而言之，用效應物包被馬來醯亞胺板，將溶於標準沉降裂解緩衝劑(對於RhoA測定是50mM Tris，pH 7.2，1％Triton X-100，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，500mM NaCl，10mM MgCl2；對於Rac1和Cdc42是50mM Tris，pH 7.5，10mMMgCl2，200mM NaCl，1％Nonidet P-40，5％甘油)中的活性Rho GTP酶導入孔內，並在4℃震蕩(400rpm)溫育1小時，然後用標準沉降清洗緩衝劑(對於RhoA測定是50mM Tris，pH 7.2，1％Triton X-100，150mM NaCl，10mMMgCl2；對於Rac1是25mM Tris，pH 7.6，1mM DTT，30mM MgCl2，40mMNaCl，1％Nonidet P-40)清洗孔，分別用Rho GTP酶特異性第一抗體(對於RhoA是批號ARH01，Cytoskeleton Inc.，對於Rac1是批號ARC01，Cytoskeleton Inc.)和抗小鼠或抗兔第二抗體(Jackson Labs)對反應物進行顯色。在TBST中清洗3次後，利用吸光度或發光檢測對反應物進行顯色。添加50μl OPD底物(Sigma批號P9187)在37℃保持15分鐘，隨後添加50μl終止緩衝劑(1M硫酸)，再用分光光度計(SpectraMax 250，Molecular Devices)測量OD490吸光度。添加50μl lumigen試劑(Lumigen Inc.，批號PSA-100)後用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)測量發光，典型的設置是100-150增益和10-100ms積分。應當注意，使用了基於ELISA的抗體濃度優化的標準棋盤滴定(Crowther，2001，Meth.Mol.Biol.，14983-113)。此外，這些G-LISA測定中使用的抗體已被證明在沉降測定中工作非常良好(它們是CytoskeletonPull-Down Assay Kits，批號BK034(Cdc42)，BK035(Rac1)和BK036(RhoA)中的組分)。還對各種阻斷劑、反應緩衝劑、溫育溫度和抗體稀釋緩衝劑進行了廣泛的試驗。G-LISA不能在已應用於所有沉降測定的標準條件下工作，表明這兩種測定模式之間存在一種或多種根本性的差異。
不受限於任何特定的理論，G-LISA方法在標準沉降條件下失敗的一個可能的原因，可能是使用了極低濃度的與板結合的效應物——這將在下一個實施例中(在G-LISA中使用結合緩衝劑)加以討論。還有可能是，在沉降測定的Western印跡分析中能夠識別信號的抗體在G-LISA模式中不能識別Rho GTP酶——這種可能性在實施例5中(用於G-LISA測定的優化抗體的開發)加以討論。還有一種可能，同時也是本實施例在這裡討論的主題，是G-LISA效應物GTP酶複合體在G-LISA測定的溫育過程中被損失。
沉降測定用結合了效應物的珠子或盤來捕獲活性Rho GTP酶，經過清洗步驟後，必須將活性Rho GTP酶從珠子上洗脫下來，以便通過Western印跡檢測加以分析(Benard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；Renet al.，1999，EMBO J.，18578；Kranenburg at al.，1999，Mol.Biol.Cell，101851-1857；和Sun et al.，2006，Microcirculation，13237-247)。Rho GTP酶沉降測定與G-LISA測定之間的一個主要差異是，G-LISA測定依賴於在整個測定中與結合效應物的固體支持基質(例如但不限於微量滴定板)聯結的Rho GTP酶。本文公開的實施例中的實驗的一個目的是a)確定在整個G-LISA中是否有GTP酶從固體基質的任何解離，和b)如果有需要，確定防止Rho GTP酶損失的方法，從而為Rho GTP酶活化獲取定量的結果。
材料和方法 G-LISARho GTP酶效應物結合的Western分析 使用組成型活性RhoA GTP酶蛋白質(R63)和能夠水解GTP的GTP負載血小板提取物來檢查效應物GTP酶的隨時間的解離。G-LISA測定如下進行將R63蛋白質(每個測定10ng)或GTP負載血小板提取物(25μg)與結合於馬來醯亞胺板的ROCK-GBD效應物共溫育，溫育在4℃、400rpm震蕩下進行30分鐘。用200μl TBST清洗反應物2次以除去未結合的Rho GTP酶。此時，用SDS緩衝劑(5％SDS，63mM Tris pH 6.8，5％巰基乙醇，10％甘油)從數個孔洗脫樣品，合併用於後面的western分析。將剩餘的反應物在第一抗RhoA抗體(克隆384)中室溫400rpm震蕩下溫育45分鐘。在TBST中清洗3次後，如上所述地用SDS緩衝劑洗脫數個孔內的樣品並保存用於後面的分析。剩餘的反應物在第二抗雞抗體中室溫400rpm震蕩溫育45分鐘。在TBST中清洗3次後，如上所述地從數個孔將樣品洗脫在SDS緩衝劑中並保存用於後面的分析。使用抗RhoA的小鼠單克隆抗體進行Western分析。
Rho抗原提呈緩衝劑試驗 用等體積的結合緩衝劑(20％ PEG 8000，Sigma，St.Louis，MO)稀釋負載有GTPγS或GDP核苷酸的血小板細胞裂解物(每個測定10μg總細胞裂解物)，然後加到ROCK效應物結合板中。將反應物於4℃在微量滴定板搖床溫育30分鐘，之後用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％ Tween-20)清洗孔1次，並立即用如下的化學/物理處理之一進行處理在200μl PBS存在下微波3分鐘；乾燥微波3分鐘；在200μl 8M尿素存在下微波3分鐘；200μl甲醇2分鐘；200μl乙醇2分鐘；200μl 0.5％ SDS 2分鐘，室溫下200μl 10％三氯乙酸(TCA)2分鐘。然後將孔用PBST清洗3次，每次200μl，再添加RhoA第一抗體(B384)至1μg/ml，室溫溫育45分鐘。將孔用PBST清洗3次，每次200μl，再與抗小鼠第二抗體(Jackson Labs)室溫溫育45分鐘。將孔每次用200μl PBST清洗3次後，用發光檢測法檢測活化Rho蛋白質。發光是在添加50μl lumigen試劑(Lumigen Inc.，批號PSA-100)後，用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)進行測量的。
TCA在Rac1G-LISA中益處的測試 將溶於細胞裂解緩衝劑中的組成型活性重組Rac1(5ng)，或者僅細胞裂解緩衝劑，直接添加到POSH效應物結合G-LISA板上。將反應物於4℃在微量滴定板搖床上溫育30分鐘，之後用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％Tween-20)清洗孔1次，並立即在室溫下用200μl抗原提呈緩衝劑(1％三氯乙酸(TCA))處理2-5分鐘。然後將孔用PBST清洗3次，每次200μl，並添加第一Rac1抗體至1μg/ml，在室溫下溫育45分鐘。將孔用PBST清洗3次，每次200μl，然後在室溫下與抗小鼠第二抗體溫育45分鐘。將孔用200μl PBST清洗3次後，用吸光度檢測法來檢測活化的Rho蛋白質。吸光度的測量如下添加50μl OPD底物(Sigma批號P9187)，在37℃保持15分鐘，然後添加50μl終止緩衝劑(1M硫酸)，用分光光度計(SpectraMax 250，Molecular Devices)測量OD490。
結果 為了檢查在允許GTP水解的系統中GTP酶與效應物的解離，在ROCK包被的馬來醯亞胺板中對25μl GTP標記的血小板提取物(2mg/ml)進行了標準RhoA G-LISA。在G-LISA測定的不同階段用SDS緩衝劑洗脫結合的活化RhoA。在G-LISA測定的不同階段(在ROCK板中溫育30分鐘後(泳道1)，第一抗體溫育45分鐘後(泳道2)，第二抗體溫育90分鐘後(泳道3))用SDS緩衝劑洗脫結合的RhoA。然後對洗脫的Rho進行SDS-PAGE，並用抗RhoA抗體進行Western印跡。為了檢查在不允許GTP水解的系統中GTP酶與效應物的解離，對10ng RhoA(63L)進行標準RhoA G-LISA。在G-LISA測定的不同階段(在ROCK板中溫育30分鐘後(泳道4)，第一抗體溫育45分鐘後(泳道5)，第二抗體溫育90分鐘後(泳道6))用SDS緩衝劑洗脫結合的RhoA(63L)。然後對洗脫的Rho進行SDS-PAGE，並用抗RhoA抗體進行Western印跡。上圖和下圖相同，只是顯影底片的曝光長度不同。較短的曝光允許更加定量地觀察63L信號，而較長的曝光更宜於觀察內源RhoA樣品中的信號損失。由於63L上存在His標籤，63L重組組成型活性RhoA蛋白質比內源RhoA上行更高。
圖4的結果顯示，來自水解缺陷突變體RhoA蛋白質(L63)的活性RhoA信號在第一抗體溫育後減少10％(圖4，比較泳道4和5)，在第二抗體溫育結束時減少40％(圖4，比較泳道4和6)。負載GTP的RhoA樣品的信號在第一抗體溫育後降低60％(圖4，比較泳道1和2)，在第二抗體溫育後降低>90％(圖4，比較泳道1和3)。GTP樣品中信號損失的增強很可能是由於測定期間的GTP酶水解(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359)。在這點上，負載有GTP的血小板提取物的信號隨時間的損失也顯著高於負載有非可水解GTPgS的血小板樣品(數據未顯示)。綜合考慮，該數據強烈支持這一點，即該測定中的RhoA信號損失是簡單解離和由GTP水解所致的RhoA失活引起的解離二者所造成的。在這點上，嘗試了通過在4℃進行抗體溫育和使所有緩衝劑保持在4℃來減慢解離，但未能改善測定的信噪比(數據未顯示)。
總之，需要開發防止或使反應中GTP酶的損失最小化的測定條件。
我們對數種抗原複合物穩定性物理(熱變性)和/或化學處理進行了評估。在初始研究中，我們選擇了交聯劑如戊二醛，蛋白沉澱試劑如甲醇、乙醇和三氯乙酸(TCA)，離液劑如尿素，和變性劑如十二烷基磺酸鈉(SDS)。
參考圖5A，對僅裂解緩衝劑(未處理)、15μg GDP-或GTPγS-標記血小板提取物進行了RhoA G-LISA測定。在溫育提取物後，用MW+PBS，MW/乾燥，MW/8M尿素，甲醇，乙醇，0.5％ SDS，10％TCA對板進行處理或不處理，然後進行抗體溫育和發光檢測。MW＝5分鐘微波處理。白色條形顯示GDP信號，灰色條形顯示GTPγS信號。參考圖5B，對僅裂解緩衝劑(空白)或5ng Rac1(61L)按照「材料和方法」中所述進行Rac1 G-LISA測定，只是測定使用或者不使用抗原提呈緩衝劑處理(分別為「1％TCA」或「無APB」)，按照「材料和方法」中所述通過490nm吸光度檢測Rac1信號。
我們發現，數種化學和/或物理處理，例如在8M尿素存在下組合使用微波(熱變性)，顯著地改善了G-LISA測定中活性RhoA蛋白質的檢測(MW+尿素8M，圖5A)。在PBS中微波產生的GTPγS結合信號大大增加。然而，高cv值是這種方法的一個問題(MW+PBS，圖5A)。無緩衝劑存在下微波，GTPγS和GDP樣品間的區分較差(MW+乾燥，圖5A)。在所測試的其它處理方法中，戊二醛(數據未顯示)和乙醇對於活性RhoA給出高於背景的持續正信號(圖5A)。用甲醇或0.5％SDS處理對活性RhoA則沒有給出任何高於背景的顯著信號。用200μl 10％TCA在室溫下將板處理2分鐘，給出的GDPRhoA信號是GTPγS RhoA信號的大約8倍高(10％ TCA，圖5A)。
通過進一步的研究，我們發現，在所測試的包括乙酸(數據未顯示)在內的數種酸性條件中，用1％ TCA在室溫下將效應物GTP酶複合物(清洗之後)處理2分鐘是用於RhoA:ROCK和Rac1:POSH G-LISA測定的抗原提呈緩衝劑處理的合適選擇。圖5B中顯示了抗原提呈緩衝劑在Rac1:POSH G-LISA中的益處。在抗原提呈緩衝劑中溫育2分鐘，產生7倍於背景的組成型活性Rac1(5ng)的信號。省略抗原提呈緩衝劑則導致測定法不能檢測到高於背景(僅細胞裂解緩衝劑)的活性Rac1。
討論 在測試的所有G-LISA模式中均發現在抗體溫育期間有信號損失發生，然而損失的程度隨被分析的效應物GTP酶對而有所不同。例如，當不存在TCA時，RhoA:ROCK，Rac1:POSH，Rac1:PAK1(圖9)損失>80％的信號，而Rho-Dia1僅損失大約50％，Cdc42:WASP的信號僅損失20％(數據未顯示)。Rho效應物-GBD肽可顯著減慢Rho蛋白質GTP水解的本徵速率，但並不阻止該過程(Leonard et al.，1997，Biochem.，361173-1180；和Bernard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)。因此，GTP酶解離發生的程度取決於，除了其他因素之外，特定效應物對其活性GTP酶靶標的親和力，以及效應物防止其GTP酶靶標的GTP水解的能力。
預計可提高Rho GTP酶信號損失的另一個因素是GTP酶的高本徵水解速率。在這點上，Ras GTP酶的GTP水解本徵速率大大低於Rho GTP酶(Nealet al.，1989，J.Biol.Chem.，26110963；和Self et al.，1995，Meth.Enz.，25667-76)。因此，對於基於Ras的G-LISA測定而言，水解造成的信號損失問題可能不會這麼大。例如，公開的Rac1:PAK和Ras:Raf1的親和力均大約為20nM。因此，可以預知，儘管效應物親和力相似，Ras測定對於抗原提呈緩衝劑的依賴性，將大大低於明顯受益於該步驟的Rac1:PAK測定(圖9)。
我們測試了數種化學和物理處理降低Rho GTP酶損失的能力。儘管其中的許多處理，例如8M尿素結合熱處理，提供了更高的信號，但是發現，用1％(60mM)TCA在室溫下對複合物處理2分鐘，似乎是複合物穩定化的合適方法。
我們用多種效應物GTP酶組合，包括RhoA:Rho靶蛋白、RhoA:Dia1、RhoA:ROCK、Rac1:PAK和Rac1:POSH，對TCA處理進行了測試。在測試的全部實例中，TCA處理均提高了信號。一些G-LISA，例如RhoA:ROCK和Rac1:POSH(圖5A和5B)，顯示對TCA抗原提呈緩衝劑有很大益處，而其他的G-LISA，例如RhoA:Dia1，在用TCA處理時則給出更高的RhoA信號(數據未顯示)。還發現抗原提呈緩衝劑對於採用PAK-GST和Rho靶蛋白-GST非共價板的G-LISA測定同樣具有益處(見圖9，和數據未顯示)。這表明，Rho GTP酶損失不大可能受到特定板化學的影響，因此可能是G-LISA測定模式的一個普遍特徵。
這裡的發現預示，通過抗原提呈緩衝劑或類似物處理降低Rho GTP酶從G-LISA固體支持物上的損失，在開發任何特定的Rho G-LISA測定的過程中均為一項重要參數。就該方面而言，解離具有時間依賴性，這一事實也可以在任何效應物Rho G-LISA測定的通用開發方案中加以利用。例如，90分鐘溫育後的解離(對於組成型活化RhoA是40％，對於野生型RhoA是90％)顯著大於45分鐘溫育後的解離(分別為10％和60％)這一事實，可能提示人們採用這樣的方案利用偶聯HRP的第一抗體等來最大程度地縮短測定時間。採用這種方案，有可能減少或者不再需要抗原提呈緩衝劑的存在。因此，本領域技術人員可有效地利用這裡公開的信息設計任何Rho G-LISA測定。
實施例4在G-LISA中使用結合緩衝劑 正如在前面實施例中提到的，簡單地將沉降測定改造適用於ELISA型系統時，G-LISA測定不能工作。在此我們推斷，低水平的效應物(<1μg)和蛋白裂解物(6-15μg總裂解物)可能低於效應物GTP酶結合所需的臨界濃度。因此，引入能夠提高蛋白蛋白相互作用的化合物或試劑有可能將結合平衡推向有利於效應物GTP酶複合物的形成。因此，測試了蛋白蛋白相互作用增強劑，例如聚乙二醇(polyethyethylene glycol)等，在G-LISA反應中的作用(Kozer et al.，2004，J.Mol.Biol.，336763-740；和Ingham，1990，Meth.Enz.，182301-306)。
材料和方法 活化細胞裂解物的製備 在補充有10％胎牛血清的DMEM中培養Swiss 3T3細胞直到50％匯合。然後對它們血清飢餓24小時，再根據實施例8中的詳細說明，用100μg/ml鈣蛋白酶抑制劑處理30分鐘以活化RhoA。根據實施例8中的詳細說明用EGF處理HeLa細胞2分鐘以活化Rac1。
結果 在本實施例中，評估了向RhoA和Rac1 G-LISA中添加漸增劑量的PEG8000的效果。在RhoA的情形，發現漸增劑量的PEG(最終濃度0-10％)可使獲自鈣蛋白酶抑制劑處理的Swiss 3T3細胞的活性RhoA信號提高超過一個數量級(圖6B，0％PEG比10％PEG)。
參考圖6A，將25μl血清飢餓的或鈣蛋白酶抑制劑處理(RhoA活化)的Swiss 3T3細胞裂解物(0.5mg/ml)在存在(+)或不存在(-)結合緩衝劑(10％PEG 8000，最終濃度)的條件下在室溫水浴中溫育0，10或30分鐘。然後在ROCK馬來醯亞胺板中對樣品進行標準RhoA G-LISA測定，通過讀取490nm的吸光度進行定量。SS是血清飢餓樣品(白色條形)，鈣蛋白酶抑制劑標記的RhoA誘導樣品(灰色條形)。參考圖6B，將25μl血清飢餓的或鈣蛋白酶抑制劑處理(RhoA活化)的Swiss 3T3細胞裂解物(0.5mg/ml)用等體積的0％、5％、10％、15％或20％PEG 8000稀釋，並立即在ROCK馬來醯亞胺板中對樣品進行標準RhoA G-LISA測定，樣品通過閱讀490nm的吸光度加以定量。SS是血清飢餓樣品(白色條形)，鈣蛋白酶抑制劑標記的RhoA誘導樣品(灰色條形)。參考圖6C，將25μl血清飢餓的或EGF處理(Rac1活化)的Hela細胞裂解物(1mg/ml)用等體積的0％，5％，10％，15％或20％PEG8000稀釋，並立即在POSH馬來醯亞胺板中對樣品進行標準Rac1G-LISA測定。樣品通過讀取490nm的吸光度加以定量。SS是血清飢餓樣品(白色條形)，EGF標記的Rac1誘導樣品(灰色條形)。在所有情況下，AU＝吸光度單位，全部讀數均減去了僅緩衝劑的背景。
Rho蛋白質在裂解物中非常不穩定，這是因為存在有大量快速水解Rho蛋白質的GTP酶活化蛋白(GAPs)(Moon et al.，2003，Trends Cell Biol.，1313-22)。因此本領域技術人員可能認為，向含有活性Rho蛋白的裂解物中添加蛋白蛋白相互作用增強劑，更有可能會通過增強Rho:GAP相互作用而增強GTP的快速水解，而不是增強Rho效應物相互作用(Ren et al.，1999，EMBO J.，18578)。令人吃驚的是，這裡發現，添加PEG等在室溫下10分鐘後對RhoA信號的影響並不顯著(圖6A，+/-10分鐘)，室溫30分鐘後僅造成RhoA信號微小的損失(圖6A，+/-30分鐘)。圖6A中活化RhoA信號隨時間逐漸降低是由於GTP水解導致RhoA失活的結果(Benard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)。因此，在RhoA G-LISA中，引入PEG「結合緩衝劑」的步驟有利於產生高度穩健的來自活化RhoA的信號。PEG結合緩衝劑對RhoA G-LISA測定(使用His-ROCK1板)的益處已經在數種不同的細胞系中得到證實，例如3T3細胞、HeLa細胞、Jurkat細胞和MDCK細胞(數據未顯示)。
在Rac1的情況下，發現G-LISA測定中逐漸增加的PEG量(最終濃度從0到10％)與活性Rac1信號的降低相關(圖6C)。因此，在該情況下，PEG似乎對G-LISA信號有負作用。有人假設這是由於Rac GAP蛋白濃度增加導致活性Rac1上GTP的水解增強造成的。在這點上，已有報導說Rac1的GTP水解本徵速度和與GAPs的親和力均比RhoA高(Liget et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
討論 引入PEG結合緩衝劑或類似物對給定G-LISA測定的改善或抑制程度，可能取決於多個交雜的參數。這包括結合緩衝劑對特定Rho蛋白的GAP活化GTP水解的作用，特定效應物-GBD對特定活性Rho蛋白的結合常數，和每個孔結合效應物的量。
實施例5用於G-LISA測定的優化抗體的開發 如前面的實施例中提到的，最初在G-LISA測定中實現活化與非活化Rho GTP酶蛋白質之間的差異信號的嘗試沒有產生陽性結果。先前，通過對從G-LISA板的匯集孔洗脫出的蛋白質進行Western印跡分析確定，效應物-GBD板能夠捕獲組成型活性Rho GTP酶(見圖4)。這促進了用於產生G-LISA優化的單克隆抗體的篩選策略的提出。下面的實施例描述了一種RhoA特異性抗體(克隆384)和一種Rho A，B，C特異性抗體(克隆419)的開發。
材料和方法 RhoA和RhoA，B，C特異抗體的開發如下合成Rho肽(CDEHTRRELAKMKQEPVKPEEGRD；SEQ ID NO110)(Bachem Inc.，Kingof Prussia，PA)，並根據製造商的使用說明，利用Imject試劑盒(Pierce，Rockford，IL 61105；批號0077610)與KLH偶聯。根據製造商的使用說明，使用Ellman’s試劑測量游離半胱氨酸(Sigma，St.Louis，MO，批號D8130)，來確定KLH-肽偶聯的效率。用50μg KLH偶聯肽免疫6周齡小鼠(BALB/c)。隨後間隔約10-15天進行注射。用標準ELISA測定和Western印跡測定對血液進行重組RhoA(批號RH01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)測試之後，選擇候選小鼠，並靜脈內給予鹽水溶液進行最後的加強免疫。3天後處死小鼠。將脾細胞與骨髓瘤細胞融合，通過ELISA測定抗RhoA和RhoC肽，Western印跡測定抗RhoA、RhoB、RhoC肽和血小板提取物，以及在G-LISA測定中選擇雜交瘤細胞。在G-LISA篩選中使用負載GDP或GTPγS的血小板裂解產物(實施例2中描述的方法)。負載GTPγS的Rho信號高於負載GDP的Rho表明抗體在G-LISA測定中可能有用。通過在下列文獻中概述的標準程序產生克隆和純化抗體Harlow and Lane，1988，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。
第二抗體，山羊抗小鼠，從Jackson Immunoresearch Labs.，West Grove，PA(批號115-035-068)獲得。
結果 在三種不同的測定中篩選雜交瘤標準ELISA測定，標準Western印跡測定，和Rho G-LISA測定。結果如下文和圖7A和7B所示。參考圖7A，通過Western印跡對每種抗體(克隆248，362，384，419，465，505，591，603，621，660，733，942，957，977，979，1019，1157，1164，1281，和1324)的標準化稀釋物(1:500)進行分析。使用重組Rho A、B和C樣品(每個50ng)和20μg血小板提取物作為樣品，分析抗體特異性和相對靈敏度(Western分級)。以1:10,000的稀釋度使用山羊抗小鼠第二抗體。用化學發光檢測(Pierce westDura)對印跡進行顯影。將來自血小板提取物的最強信號評為等級#1，最低的評為等級10th，N＝在所用條件下沒有信號。用重組RhoA或RhoC包被標準吸光度ELISA板，並按照標準的基於吸光度的測定法針對兩種抗原測試上述抗體，如下列文獻中的描述AntibodiesA Laboratory Manual，Ed.Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Press，1988，第六章，174-194。將對RhoA具有最強ELISA信號的抗體評級為最高。對於G-LISA測定，在標準RhoA G-LISA測定中用抗體檢測來自ROCK馬來醯亞胺板上12.5μg負載GDP或GTPγS的血小板提取物的信號。所有抗體僅以1:500稀釋度進行測試，抗小鼠第二抗體以1μg/ml的終濃度使用。將給出最高的GTPγS對GDP比值的抗體評級為最高。參考圖7B，顯示了按照圖7A的描述產生的原始數據。
克隆362和621給出了最強的ELISA信號，而克隆1157給出的最弱。抗體特異性也可通過這種篩選加以確定，例如克隆362和621在RhoA和RhoC ELISA中均強烈反應，而克隆384和465是RhoA特異的。
Western印跡篩選使用RhoA、RhoB和RhoC重組蛋白和血小板提取物作為抗體組(panel)的潛在靶標。根據從血小板提取物產生的RhoA或RhoA，B，C信號，對圖7A中的克隆加以評級。例如，克隆979給出的信號最強(密度測定)，而克隆248，362，384，465，660，733，942，977，1019，1281和1324在血小板提取物中沒有給出可檢測到的信號。所有的克隆(除克隆1157外)在Western印跡分析中均與一種或多種重組Rho蛋白給出了信號，用該數據來確定Rho特異性(圖7A)。
G-LISA測定比較來自負載GDP(非活性Rho)樣品和負載GTPγS(活性Rho)樣品的Rho信號。根據GTPγS對GDP信號的比值對克隆進行評級，認為比值越高，抗體的希望越大，因此獲得的級別相應較高。因此，如圖7A所詳示的，克隆384在G-LISA測定中評級為第一，其GTPγS與GDP比值為50，而克隆1164等級為第二十，比值為0.7。
討論 在本開發過程中發現，在Western印跡或ELISA測定中的強反應性，並不預示抗體將在G-LISA測定中良好地工作(圖7A和7B)。例如，在20個雜交瘤的G-LISA篩選中表現最好的兩種抗體(分別為克隆384和419)，在ELISA測定中僅在20個中排第6和第8。尤其值得注意的是，被預測在沉降測定中工作良好的抗體，也就是在western篩選中評級較高那些的抗體，在G-LISA測定中一般沒有良好工作。事實上，來自G-LISA篩選的表現最好的抗體(克隆384)，在使用血小板提取物的Western印跡篩選中沒有給出可檢測到的信號(圖7A)。類似地，在ELISA測定中評級最高的抗體(克隆362和621)在G-LISA測定中表現非常差，在20個中僅排第16和第18(圖7A)。
實施例6在G-LISA測定中使用未澄清的裂解物 為了使G-LISA測定在高通量應用中更便於用戶使用，人們希望省去澄清步驟，因為這個步驟非常麻煩且不適於HTS模式。在沉降測定的場合，澄清步驟是必要的，因為在清洗步驟中不能清除細胞碎片(珠子會和碎片一起離心沉澱)。同樣在沉降測定中，為了進行SDS-PAGE而添加SDS凝膠上樣緩衝劑，會產生高度粘稠的樣品(由於DNA釋放)，使得樣品不易處理且western定量困難。基於微量滴定板的測定，例如G-LISA，將不會受到這些缺點的困擾，將能夠通過簡單的清洗步驟除去細胞碎片。
參考圖8，將25μl血清飢餓的或鈣蛋白酶抑制劑處理(RhoA活化)的細胞裂解物(0.5mg/ml)直接使用(「未澄清樣品」)，或者4℃、8,000rpm離心澄清5分鐘(「澄清樣品」)。將裂解物立即在ROCK馬來醯亞胺板上進行標準RhoA G-LISA測定。按照「材料和方法」中所述，通過讀取發光度對樣品進行定量。ALU＝任意光單位。所有的讀數均減去了僅緩衝劑的背景。
結果 按照「材料和方法」(實施例8)中的概述製備了鈣蛋白酶抑制劑處理的和血清飢餓的Swiss 3T3細胞裂解物。取每種裂解物的一半進行澄清，另一半保持未澄清。將全部4種樣品同時在一個RhoA G-LISA測定中進行分析(按照實施例2中的概述)。圖8的結果清晰地顯示，未澄清裂解物產生的活化信號與澄清裂解物相似。
討論 澄清步驟的需要是沉降測定規程的一個不可或缺的部分(Ren.et al.，1999，EMBO J.，18578-585；Benard.et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；Leung et al.，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，10215207-15212；Kimura et al.，2000，J.Biol.Chem.，27517233-17236；Kranenburg et al.，1999，Mol.Biol.Cell，61851-1857；Vouret-Craviari et al.，2002，J.Cell Sci.，1152475-2484；和Subauste et al.，2000，J.Biol.Chem.，2759725-9733)。進行無澄清的沉降測定的嘗試結果導致非特異性細胞碎片——例如細胞核和相關蛋白——的積累。由於在此測定中細胞碎片和/或相關蛋白不能與效應物GTP酶複合物分離，樣品很可能混有非活性GTP酶。進一步地，嘗試省略沉降測定中的澄清步驟將導致在SDS-PAGE和western測定之前添加SDS上樣緩衝劑時產生高度粘稠的物料。這種高粘度是細胞核裂解和核酸釋放所致。這導致SDS-PAGE上樣不均勻，結果使得western定量結果變異很大。通過例如DNA酶處理或剪切力可以降低黏度，但操作增加使測定更加複雜，並增加樣品間的變異性的可能。更進一步地，在沉降測定中必須引入澄清步驟，導致在GTP酶對GTP水解高度敏感的時刻(也就是，在效應物添加之前)增加了額外的處理步驟。具有高本徵水解速度RhoGTP酶，例如Rac和Cdc42 GTP酶，都特別容易受這個潛在問題的影響(Ligeti et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
因此，G-LISA測定能夠省去澄清步驟，相對於沉降測定而言是非同一般的重要改進。它在GTP酶對由GTP水解導致的失活最敏感的時刻減少了樣品處理時間，從而提高了測定的可重複性。在此點上，本領域技術人員已知沉降測定具有高cv值(我們的結果是40-60％，數據未顯示)。省去澄清還使樣品處理簡單，並且適於高通量測定，例如診斷和藥物發現中將使用的高通量測定。沉降測定不適合於這些應用。
實施例7效應物-GBDs與穀胱甘肽板的非共價附接 如所有這些實施例所公開的，將效應物-GBD肽連接到板上的方法之一是通過共價附接(covalent attachment)。還研究了非共價附接的使用。這裡的實施例描述了與穀胱甘肽板連接的帶穀胱甘肽S轉移酶標籤的效應物-GBD肽的使用。
材料和方法 將效應物-GBD非共價附接於板上 將PAK-GBD-GST肽在包被緩衝劑(PBS；140mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸鈉(二鹼價)，1.76mM磷酸鉀(一鹼價)pH 7.2)中稀釋到終濃度為0.02mg/ml，並將50μl(1.0μg)蛋白質添加到GST-Trap穀胱甘肽包被板(NoAb Biodiscoveries，Ontario，Canada)的各個孔中。將板在室溫溫育1小時。將板在PBS中清洗2次，添加含0.1％BSA的PBS pH 7.2室溫封閉1小時。
參考圖9，按照上文的概述將PAK-GBD-GST肽包被到穀胱甘肽板(NoAb Biodiscoveries)上。使用上述(實施例2)的標準Rac1 G-LISA測定對GDP、GTPγS和組成型活性Rac1L61進行測定。按照「材料和方法」所述(實施例2)通過490nm吸光度檢測Rac1信號。所有讀數均減去了僅緩衝劑的背景。
結果 使用PAK-GBD-GST連接板以G-LISA模式(如實施例2中詳述的)對負載了組成型活性Rac1、GTPγS-或GDP-1的血小板進行了測定。圖11中的結果顯示，非共價G-LISA模式能夠鑑定高於背景的組成型活性Rac1(僅緩衝劑)。組成型活性Rac1信號是背景的8倍，與從共價結合POSH效應物的馬來醯亞胺板的產生的信號(圖2B，實施例2)相似。非共價PAK-GST測定能夠區分負載活性與非活性Rac1蛋白質(圖9，GTPγS(活性)和GDP非活性)的血小板提取物。儘管本測定相當靈敏(8倍活化)，但是沒有POSH連接的馬來醯亞胺板G-LISA(30倍，圖3B，實施例2)那樣穩健。非共價PAK-GST測定在不存在抗原提呈緩衝劑的條件下沒有給出高於背景的信號(圖9，GTPγS無抗原提呈緩衝劑)。
討論 本實施例證明了非共價板模式對於開發G-LISA測定的效用。可以看出，通過下面的G-LISA開發規程，利用連接於穀胱甘肽板的PAK-GST效應物可獲得良好的信號(圖9)。有趣的是，對於該測定而言，使用抗原提呈緩衝劑(APB)有利於獲得活性Rac1信號(圖9，GTPγS+ABP與-APB比較)。
實施例描述了GST穀胱甘肽連接的使用，由PAK-GST穀胱甘肽板產生的GTPγS信號小於由POSH馬來醯亞胺板(圖3B)和PAK馬來醯亞胺板(數據未顯示)產生的GTPγS信號。由於這個原因，並且由於共價板結合蛋白質通常更加穩定，我們進一步考察了共價馬來醯亞胺板模式。然而，本文已經證明，GST穀胱甘肽板在G-LISA中可良好工作，預期也可以使用其他的非共價連接，例如聚組氨酸鎳、聚組氨酸鈷、生物素鏈黴抗生物素蛋白、生物素抗生物素蛋白等。每種板模式的優化均可遵循在這些實施例中概述的方法。
實施例8G-LISA測定的檢測限和驗證 目前，所有公開的對細胞或組織樣品中Rho GTP酶的活化(或失活)水平的估計值均使用由標準Rho GTP酶沉降測定產生的數據(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；和Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272)。由於該測定方法清楚明確，並且在本領域被公認為定量的金標準，所以我們期望通過證明G-LISA產生的活化估計值與在沉降實驗產生的估計值相當來驗證G-LISA。因此，我們希望證實，雖然G-LISA測定與Rho GTP酶沉降測定相比具有速度大大提高、重複性更好、樣品通量增加、樣品操作更簡單以及樣品量更小等優勢，這兩種測定對活化Rho GTP酶的實際定量結果卻是相似的。
材料和方法 通過鈣蛋白酶抑制劑誘導產生活化RhoA細胞裂解物 將HeLa細胞接種在含有10％FBS的DMEM(Gibco.批號10313-021)中。令細胞生長到50-70％匯合度，隨後使之血清飢餓24小時。然後用鈣蛋白酶抑制劑(100ng/μl)處理細胞30分鐘。將細胞收集在裂解緩衝劑中，用裂解緩衝劑使裂解物的蛋白質濃度等量為4mg/ml。然後相應地對裂解物進行稀釋，並進行RhoA GLISA測定。
通過EGF誘導產生Rac1和Cdc42細胞裂解物 將HeLa細胞接種在含有10％FBS的DMEM(Gibco.批號10313-021)中。令細胞生長到50-70％匯合度，隨後使之血清飢餓24小時。然後用10ng/ml表皮生長因子(EGF)(Sigma.批號E9644)處理細胞2分鐘，將細胞收集在裂解緩衝劑中。用裂解緩衝劑使來自血清飢餓板和EGF處理板的裂解物的濃度等量為1mg/ml。然後對裂解物進行RAC1或Cdc42 G-LISA測定。
沉降測定 測定根據Ren等所述進行。將修飾的GST Rho靶蛋白-GBD肽與穀胱甘肽珠子結合，將20μg結合於珠子的效應物添加到500μl(250μg)澄清的負載GTPγS或負載GDP的血小板提取物中(裂解物製備見實施例2)。將混合物在4℃迴旋溫育1小時。然後，將珠子在清洗緩衝劑(50mM Tris pH 7.5，100mM NaCl，30mM MgCl2)中清洗2次，並進行SDS-PAGE(4-20％梯度)和Western印跡程序。用特異識別RhoA蛋白的第一抗體和山羊抗小鼠第二抗體(Jackson Labs.，批號115-035-068)檢測活化的RhoA蛋白質條帶。測定最少執行4次。
參考圖10，將25μl血清飢餓的或鈣蛋白酶抑制劑處理的(RhoA活化的)、濃度為4，2，1，0.5，0.25，0.12，0.06mg/ml的Hela細胞裂解物，與相同體積的結合緩衝劑混合，並進行RhoA G-LISA測定，隨後進行吸光度檢測。同時對500μg相同的裂解物進行GST-Rho靶蛋白-RBD沉降測定，隨後用抗RhoA抗體進行Western印跡。所有的讀數均減去了僅緩衝劑的背景。
參考圖11，將25μl的僅裂解緩衝劑(0)、0.01、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1、2ng RhoA(63L)與相同體積的結合緩衝劑混合，並進行RhoA G-LISA測定，隨後進行吸光度檢測。所有的讀數均減去了僅緩衝劑的背景。
參考圖12，根據「材料和方法」(實施例7)中的概述製備PAK包被的GST板。PAK包被的穀胱甘肽珠子來自Cytoskeleton公司(批號PAK02)。針對來自血清飢餓的3T3細胞(SS)或EGF處理的3T3細胞(用於活化Rac1)的不同量的總細胞裂解物(實際量標識在柱狀圖和Western印跡下面)，如實施例2所述利用標準Rac1 G-LISA測定法進行測定，或如Benard等(J.Biol.Chem.，1999，27413198-13204)所述利用標準PAK-GST珠子沉降測定法進行測定。如前文所述通過490nm吸光度對G-LISA測定定量。Rac1沉降通過Western印跡化學發光信號的密度測定加以定量。化學發光檢測試劑是Supersignal West Dura Extended Duration Substarte(Pierce)。用於沉降的抗Rac1抗體由Cytoskeleton公司在其Rac1沉降測定用商業試劑盒(BK035)中出售。附圖顯示，Rac1:PAK G-LISA的檢測限是Rac1:PAK沉降測定的大約18-30分之一低。
參考圖13A，對50μl僅裂解緩衝劑、血清飢餓的或EGF處理的Hela細胞裂解物(0.5mg/ml)進行Rac1 G-LISA測定，隨後進行吸光度檢測。參考圖13B，如前文所述地對50μl血清飢餓的或EGF處理的Hela細胞裂解物(0.5mg/ml)進行Cdc42 G-LISA測定，並如前文所述地通過發光測定法進行定量。平行地用500μg相同裂解物進行Cdc42沉降測定。此測定中使用的抗體與G-LISA中使用的相同(批號ACD01，Cytoskeleton公司)。通過對化學發光顯影的底片的密度測定來定量活化倍數(fold activation)。參考圖13C，利用脂質轉染胺試劑(lipofectamine)，用5μg載體、p115RhoGEF或p190RhoGAP轉染Hela細胞，轉染16小時後，在細胞裂解緩衝劑中裂解細胞。然後對25μl僅裂解緩衝劑、載體、p115RhoGEF、載體、p190RhoGAP轉染的細胞(1mg/ml)進行RhoA G-LISA測定，並通過吸光度檢測加以定量。平行地用500μg相同的裂解物進行Rho沉降測定，通過對化學發光顯影底片的密度測定來定量活化倍數(對p115RhoGEF)或抑制倍數(foldinhibition)(對p190GAP)。
結果 RhoA G-LISA的檢測限 在本實施例中用兩種方法來確定利用基於吸光度的測量法檢測活性RhoA的G-LISA的檢測限。首先，確定細胞裂解物中內源活性(鈣蛋白酶抑制劑誘導的)RhoA的檢測限。其次，確定純重組組成型活性RhoA的檢測限。
用鈣蛋白酶抑制劑處理30分鐘誘導血清飢餓HeLa細胞中的RhoA活化(Schoenwaelder et al.，1999，J.Biol.Chem.，27414359-14367)。用500μg的每種裂解物(1mg/ml裂解物濃度)進行標準沉降測定(圖10中的插圖)。Western印跡結果的密度測定定量顯示，RhoA(圖4插圖中的鈣蛋白酶抑制劑泳道)活化為血清飢餓裂解物(圖4插圖中的SS泳道)的大約2倍。正如預期的，這與公開的數據非常一致(Schoenwaelder et al.，2000，Current Biol.，101523-1526)。
在平行G-LISA測定中，將血清飢餓裂解物和鈣蛋白酶抑制劑裂解物連續稀釋到給定的蛋白質濃度，分別為4、2、1、0.5、0.25和0.125mg/ml，取25μl裂解物在RhoA G-LISA中測試。與血清飢餓樣品相比，濃度為0.25mg/ml-2mg/ml的裂解物(總細胞裂解物分別為6.25μg和50μg)使鈣蛋白酶抑制劑處理樣品活化了大約2倍(圖10，活化倍數示於鈣蛋白酶抑制劑滴定曲線上方)。因此，對於低至0.25mg/ml或6.25μg總細胞裂解物的蛋白濃度，RhoA G-LISA結果與公開的數據以及本實施例顯示的沉降測定數據非常一致。
在0.5-2mg/ml的蛋白濃度(典型的細胞裂解物濃度)，cv為11-8％。甚至在低至6.25μg總細胞裂解物的蛋白量，16％的cv值也是可以接受的。在更低的蛋白濃度(0.125mg/ml或3.1μg總細胞裂解物)，cv值將變得過高而不能給出Rho測定中有意義的結果(>50％)，而在最高的蛋白濃度4mg/ml(100μg裂解物)，cv值為11％，然而活化水平則略微低於2倍(1.7倍)。4mg/ml時活化倍數降低最有可能是由於活性RhoA讀數正在接近吸光度測定的飽和點(2.5吸光度單位)。有趣的是，圖12顯示，Rac1:POSH測定可以從少達3μg的總細胞裂解物中的檢測到活化Rac1，cv值為12％。
為了確定對於重組組成型活性RhoA的G-LISA吸光度檢測的極限，向ROCK-GBD馬來醯亞胺板上的8個孔內各自添加0.01、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0和4.0ng蛋白質。在整個RhoA G-LISA測定過程中取樣，並以OD490讀數對蛋白質濃度作圖。圖11的結果顯示，吸光度G-LISA的線性範圍是0.1ng(cv＝6％)到2ng(cv＝6％)。重組組成型活性RhoA的信號似乎在蛋白量超過4ng時開始飽和。
為了進一步比較G-LISA測定與沉降測定，用相同的細胞裂解物平行地進行兩種測定。按照「材料和方法」部分所述，用表皮生長因子(EGF)刺激HeLa細胞。已有充分證據顯示，EGF瞬時活化Rac1，且活化為未刺激細胞的2倍到5倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。兩種測定均使用PAK-GST效應物，且兩種測定分別根據實施例2和3中描述的標準方法來進行。從圖12可以看出，從使用3μg-12.5μg總裂解物的G-LISA蛋白檢測到了大約2倍的活化，而沉降測定在100μg樣品中檢測到了信號，在50μg總細胞裂解物中則沒有(大約2.5倍活化)。因此說，沉降測定中的檢測極限似乎是G-LISA可得的極限的大約18-30倍高。另外值得注意的是，本申請的發明人的沉降測定技術非常熟練，並曾經用這一技術開發過商業化產品。因此，沉降和G-LISA的一對一比較結果顯示，兩種測定可給出相似的Rho活化定量(大約2倍)，結果清楚地證明G-LISA是更好的測定方法。G-LISA的優勢不僅限於靈敏度更高，儘管這是主要的優勢，G-LISA還更加迅速(10h)，需要的樣品量少得多，且適合於HTS應用。
活性Rho GTP酶的Rac1和Cdc42 G-LISA測定定量與沉降定量的比較 為了進一步考察G-LISA對Rho GTP酶體內活化的效用，我們以多有報導的Rac1和Cdc42活化為例，比較了沉降數據與G-LISA測定數據。
EGF已被證明在數種細胞系中使Rac1活化為血清飢餓水平的2-5倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。圖13A顯示了使用500μg細胞裂解物的沉降測定和使用25μg細胞裂解物的Rac1G-LISA的比較結果。沉降測定的Western印跡的密度測定定量結果顯示Rac1活化了4倍。平行進行的Rac1G-LISA結果與該活化倍數一致，是血清飢餓的細胞裂解物的4倍(圖13A)。
文獻中已充分證明，EGF可以使Cdc42活化為血清飢餓Cdc42的水平的2-3倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。圖13B顯示了使用500μg細胞裂解物的沉降測定和使用25μg細胞裂解物的Cdc42 G-LISA的比較結果。沉降測定的Western印跡的密度測定定量結果顯示Cdc42活化了2倍。平行進行的Cdc42 G-LISA結果與該活化倍數一致，是血清飢餓細胞裂解物2.2倍高(圖13B)。
將外源DNA轉染到細胞培養物中，隨後觀察蛋白表達對Rho GTP酶活化的影響，是細胞和分子生物學中的一種常用手段(Klooster et al.，2006，J.Cell Biol.，1172759-769；和Cheng et al.，2004，J.Biol.Chem.，27912786-12793)。因此，評估了G-LISA檢測下述對象的能力用Rho GTP交換因子p115RhoGEF轉染HeLa細胞時，內源Rho GTP酶的活化；或者用GTP酶活化蛋白p150RhoGAP轉染HeLa細胞時，Rho的失活(Wells et al.，2001，J.Biol.Chem.，27628897-28905；和Arthur et al.，2001，Mol.Biol.Cell，122711-2720)。
圖13C中的結果證實，G-LISA能夠如實地檢測轉染實驗中Rho GTP酶活化的提高(p115RhoGEF)或降低(p150RhoGAP)。而且，活性Rho GTP酶相對於僅有載體的樣品的定量結果在沉降與G-LISA測定之間是一致的。討論 實施例3中公開的結果證實，從給定Rho GTP酶獲得的活化水平在沉降測定和G-LISA測定之間高度相似。在血清飢餓的HeLa細胞中，對這兩種測定法針對RhoA的鈣蛋白酶抑制劑活化(圖10)、Rac1的EGF活化(圖13A)和Cdc42的EGF活化(圖13B)的定量進行了比較。在所有情況下，兩種測定方法間的Rho GTP酶活化都是相似的(典型地為2-4倍活化)，且與公開數據一致(Kazuo et al.，2004，Mol.Biol.Cell，151003-1010)。還比較了用p115RhoGEF(活化子)或p190RhoGAP(去活化子)(圖13C)轉染的細胞系中Rho的活化與失活。結果再次顯示，就活化倍數測量結果而言，沉降測定和G-LISA測定是相似的。在這些測定中對數種不同的細胞系(例如Swiss 3T3，Jurkats，MDCK細胞)進行了分析，在所有情況下，G-LISA定量結果均與公開的沉降測定估計結果一致(數據未顯示)。
圖10-13的數據清楚地顯示，G-LISA測定的效用在於從少量樣品中對RhoA活化進行定量。因此，這種測定方法的線性範圍大約為6.25-50μg細胞裂解物(圖10)。這相當於0.04-1.7ng活性RhoA的估計值(理由可見實施例2，「結果」部分)。發現純重組組成型活性RhoA的線性範圍為0.1-2ng(圖11)，這支持了根據細胞裂解物樣品的估計值。還應當注意，本實施例中描述的測定方法是用於基於吸光度的G-LISA。對此，基於發光測定的G-LISA測定方法比基於吸光度的版本更加靈敏，將測定的靈敏度提高到低於0.04ng(數據未顯示)。
與G-LISA相反，人們一般認為，在標準沉降測定中內源活化Rho GTP酶的定量典型地需要1 x 106至1 x 107個細胞，或300-800μg總細胞蛋白質(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；和Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272)。文獻中進一步承認，當樣品有限時，這樣的裂解物量可能使實驗無法進行(Gottig et al.，2006，Eur.J.Immunol.，36180-189)。對此，直接比較了PAK-GST沉降測定和PAK-GST G-LISA測定(圖12)。結果顯示，G-LISA比沉降測定靈敏大約18-30倍。
需要使用少量裂解物的場合包括原代細胞系的分析。其它場合包括在小生長室(growth chamber)中，例如12孔板(典型地4 x 105個細胞)，24孔板(典型地2 x 105個細胞)或96孔板(典型地3 x 104個細胞)中培養的高通量樣品的處理。G-LISA能夠檢測來自少至6μg的總細胞裂解物，相當於2x 104個細胞的活性RhoA信號，因而這種測定方法即使在只能獲得有限量樣品的場合下，例如原代細胞系、臨床樣品和高通量應用，也適用於Rho GTP酶活化研究。
實施例9用凍幹法穩定效應物-GBD板 效應物-GBD肽的穩定化產生可長期乾燥保存在4℃的板，從而為本測定模式提供了一種優勢。參考圖14，將凍幹的ROCK-RBD包被的微量滴定板在4℃和>10％的溼度下保存標示的時間。使用血清飢餓或鈣蛋白酶抑制劑處理的細胞裂解物，通過標準RhoA G-LISA測試該板的活性。特別地，如實施例2所述地用效應物-GBD包被板。在封閉和清洗步驟之後，向每個孔添加50μl凍幹緩衝劑(5％蔗糖，1％葡聚糖，於PBS pH 7.2中)。將板冷凍到-70℃，並用如下的程序凍幹 穩定冷凍乾燥機架溫(shelf temperature)到-40℃，5分鐘； 開始抽真空到<100 mtorr； -26℃抽真空4小時； -10℃抽真空4小時； 0℃抽真空4小時；和 30℃抽真空4小時。
然後將板從冷凍乾燥機移出並封裝在含有乾燥劑包的容器內。將板保存於4℃及溼度小於10％的條件。按圖14所示的時間間隔，用L63組成型活性RhoA(每孔5ng)在標準Rho:ROCK G-LISA中對板進行分析。對每個板相對於0時間測定的板活性(100％活性)的％活性作圖。結果發現，在這些條件下，板在至少120天內保持非常穩定。讓其變潮溼的板在1-2小時後喪失活性(數據未顯示)。
討論 配製穩定的G-LISA板具有許多優點，包括容易保存和在HTS模式中容易操作。由於此測定還以試劑盒的形式提供，所以將板的內含物凍幹，就可以在沒有乾冰等的情況下進行運輸。
實施例10G-LISA測定在藥物發現中的應用 文獻中已充分證明，Rho家族蛋白及其效應物蛋白參與了多種人類疾病，包括癌症和腎病(Fiordalisi et al.，2006，Canc.Res.，663153-3161；Fritz etal.，2006，Curr.Cancer Drug Targ.，11-14；和Wakino et al.，2005，Drug NewaPerspect.，18639-643)。因此，建立能夠鑑定直接Rho GTP酶調節因子和直接調節Rho GTP酶與效應物的相互作用的化合物的篩選方法是非常有價值的。因此，此處將G-LISA技術的應用擴展到包括這些篩選方法。
參考圖15，對僅裂解緩衝劑(空白)或5ng Rac1(61L)進行標準Rac1:POSH G-LISA。PAK-GST包含在該測定的裂解物溫育階段的反應中。PAK肽可能是POSH結合Rac1 GTP酶的競爭抑制劑，從而降低G-LISA信號。在一些反應中，ROCK-GST包含在陰性對照「抑制劑」中。PAK-和ROCK-GST肽的摩爾值以μM給出。正如預期的那樣，PAK肽是Rac1:POSH反應更高效的競爭物(IC50 0.1μM，相比於8μM)。
結果 圖15所示的實施例顯示了來自與POSH-GBD馬來醯亞胺板結合的5ng組成型活性Rac1(61L)的G-LISA數據。G-LISA如前所述進行，只是在存在或者不存在可能充當Rac1:POSH結合的競爭抑制物的PAK-GBD-GST的條件下進行反應，向反應中添加0μM至10μM的PAK-GBD-GST。圖15顯示，PAK的IC50是大約0.1μM。該測定中也測試了RhoA效應物ROCK-GBD。對這種肽的IC50大約是PAK的80倍(8μM)。這個實施例用於證明G-LISA測定在藥物發現中的應用。
討論 本實施例描述了G-LISA在藥物發現中的應用。該測定模式使用純化的組成型活性Rho GTP酶和純化的效應物-GBD肽，因此，它是一種明確的、將產生具有直接、機械關聯性的結果的系統。應當注意，所述G-LISA測定還適合於鑑定調節內源Rho GTP酶活性的化合物。該測定(或試劑盒)模式可如下實施在合適的適於HTS的容器如96孔板上培養細胞，用化合物庫處理細胞(任選在處理前對細胞進行血清飢餓)，將細胞裂解在25μl裂解緩衝劑中(此時可任選地進行蛋白定量)並轉移到存在或不存在20％PEG 8000的G-LISA板中。將板在4℃溫育30分鐘，然後室溫清洗，用抗原提呈緩衝劑處理2-5分鐘。清洗板，並對孔中的Rho GTP酶進行定量。定量可以使用Rho特異性抗體，或者通過其他方法。HTS方法學也可採用微量滴定板或微陣列常用的機器人系統。
除了本文所描述的以外，本領域技術人員根據前述的說明書可以顯見本發明的各種修改形式。這些修改形式也包含在所附權利要求的範圍內。本申請引證本文引用每篇參考文獻(包括但不僅限於，雜誌文獻、美國和非美國專利、專利申請公開、國際專利申請公開、gene bank登錄號等)的全部內容。本文引證2005年7月5日提交的美國臨時專利申請系列No.60/695,844的全部內容。
序列表
西託斯科萊頓股份有限公司(CYTOSKELETON INC.)
Cheng，Li
Davis，Ashley
Middleton，Kim
Rho蛋白質檢測
CSKL0005-500WO
US 60/695,844
2005-07-05
110
PatentIn version 3.3
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權利要求
1.一種用於檢測活化Rho GTP酶蛋白質的方法，包括
使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質的樣品接觸，其中該固體支持物與活化Rho GTP酶結合肽連接，並且其中樣品中的活化Rho GTP酶與活化Rho GTP酶結合肽結合；和
檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質，其中在檢測期間活化Rho GTP酶蛋白質保持與固體支持物聯結。
2.權利要求1的方法，其中該樣品包括含有內源活化Rho GTP酶蛋白質的細胞裂解物。
3.權利要求2的方法，其中該樣品含有少於50μg的總蛋白質。
4.權利要求2的方法，其中該細胞裂解物是從少於105個細胞製備的。
5.權利要求2的方法，其中該細胞裂解物未被澄清。
6.權利要求1的方法，其中在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質之前，添加抗原提呈緩衝劑，其中該抗原提呈緩衝劑包括一種或多種能夠減少活化Rho GTP酶蛋白質自固體支持物的損失的化合物或處理。
7.權利要求6的方法，其中該抗原提呈緩衝劑包括熱變性、尿素處理、戊二醛或乙醇，或其任意組合。
8.權利要求1的方法，其中在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質之前添加結合緩衝劑。
9.權利要求8的方法，其中該結合緩衝劑包括水溶性聚蔗糖、葡聚糖或聚乙二醇，或其任意組合。
10.權利要求9的方法，其中聚乙二醇是PEG4000或PEG8000，其終濃度為大約2％到大約40％v/v。
11.權利要求1的方法，其中使用對一種或多種活化Rho GTP酶蛋白質特異的抗體檢測活化Rho GTP酶蛋白質。
12.權利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶蛋白質是組成型活性突變體。
13.權利要求1的方法，其中該樣品包含外源GTP、GDP或GTPγS。
14.權利要求1的方法，其中該活化的Rho GTP酶蛋白質是RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Raclb、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1或RhoBTB2。
15.權利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶結合肽結合一種或多種活化Rho GTP酶蛋白質，且其對活化形式的Rho GTP酶蛋白質的親和力是對非活化形式的親和力的至少2倍。
16.權利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶結合肽是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH、WASP或Dia1，或者它們的突變體或多聚體。
17.權利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶結合肽與固體支持物共價或非共價連接。
18.權利要求17的方法，其中該共價連接是二硫鍵連接，且其中該非共價連接是GST連接。
19.權利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶結合肽是凍幹的。
20.權利要求1的方法，其中該固體支持物是微量滴定板或微陣列。
21.權利要求1的方法，進一步包括對與活化Rho GTP酶結合肽結合的活化Rho GTP酶蛋白質的量進行定量。
22.權利要求21的方法，其中使用對一種或多種Rho GTP酶蛋白質特異的抗體對活化Rho GTP酶蛋白質的量進行定量。
23.權利要求1的方法，其中活化Rho GTP酶蛋白質的檢測是利用吸光度、發光或螢光來檢測活化Rho GTP酶蛋白質與活化Rho GTP酶結合肽的之間相互作用而進行的。
24.權利要求1的方法，還包括使樣品與測試劑接觸，並確定測試劑是否調節活化Rho GTP酶蛋白質與活化Rho GTP酶結合肽之間的相互作用。
全文摘要
本發明提供了通過使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質的樣品接觸來檢測活化Rho GTP酶蛋白質的方法。該固體支持物與活化Rho GTP酶結合肽連接。在檢測期間，活化Rho GTP酶蛋白質保持與固體支持物聯結。
文檔編號C12N9/12GK101501495SQ200680032416
公開日2009年8月5日 申請日期2006年7月5日 優先權日2005年7月5日
發明者利 程, 阿什利·戴維斯, 金·米德爾頓 申請人:西託斯科萊頓股份有限公司