一種包覆紅景天苷殼聚糖季銨鹽高分子脂質體的製備方法

2023-10-19 23:27:22 2

一種包覆紅景天苷殼聚糖季銨鹽高分子脂質體的製備方法
【專利摘要】一種包覆紅景天苷殼聚糖季銨鹽高分子脂質體的製備方法，其步驟是：N,N-二甲基十六烷基環氧丙基氯化銨的合成；O－羧甲基殼聚糖即O-CMC的合成；羧甲基殼聚糖季銨鹽即DCMCs的合成；包覆紅景天苷高分子脂質體的製備。本發明所製得的小分子脂質體的脂質雙層膜結構，而且製備方法簡單，水溶液中不易發生融合，穩定性好，藥物包封率高，具有良好的緩控釋功能，同時含有氨基和羧基等官能團，容易進行多功能化組裝。
【專利說明】一種包覆紅景天苷殼聚糖季銨鹽高分子脂質體的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於藥物載體的製備方法領域，具體涉及一種包覆紅景天苷殼聚糖季銨鹽雙親性高分子脂質體的製備方法。
【背景技術】
[0002]紅景天是最近幾十年才被重視的東方民間草藥，它是繼人參、刺五加之後所發展的又一種重要保健藥源植物"前蘇聯研究人員發現紅景天能夠增強人體對各種物理、化學、生物等不利因素引起的抵抗力，具有適原性的作用。紅景天中主要的生物活性物質是紅景天苷和酪醇，大量的研究結果表明紅景天營具有抗氧化、抗疲勞和抗輻射功能。紅景天苷類的保健品已廣泛被太空人、飛行員、登山運動員、司機等特殊行業的從業人員服用。2002年衛生部確定的三類物品名單中，紅景天苷被列為可用作保健食品的物的名單之一。可見，紅景天苷作為中藥保健食品的研究是極具開發潛能的。但目前市售的紅景大營系列功能食品仍有許多問題，在體內的血藥濃度忽高忽低、沒有緩釋功效、口服次數頻繁、生物利用度低。[0003]脂質體是由磷脂雙層膜構成的中空小球。構成脂質體的主要成分是磷脂和其它類脂化合物。早在1961年英國學者Bangham和Standish就發現當磷脂分子分散在水中時會自然形成有序排列的類似生物膜結構的多層囊泡。囊泡的每一脂質層均以有序排列的磷脂雙分子構成，囊泡中央和各層之間被水相隔開。後來，人們將這種具有雙層膜形態的類似生物膜結構的中空小球通稱為脂質體。近年來，隨著生物醫藥技術的發展，人們已有能力設計並通過一定的過程製備各種不同的脂質體藥物轉運系統，脂質體遞藥技術也從最初的普通脂質體，發展為長效脂質體、靶向脂質體和智能脂質體。所涉及的藥物也從常規化學合成藥延伸到蛋白質類藥物、基因類藥物、疫苗和中藥。
[0004]由於殼聚糖具有生物相容性、生物可降解性、無毒、無免疫原性.等眾多優良特性，因此許多研究人員就如何讓其更好的應用進行了很多的研究，這其中取得最顯著成就的就是殼聚糖及其衍生物在藥物傳遞系統的應用。Fabrice Brunei利用反相乳液蒸發法製備了殼聚糖納米粒，考察了不同的條件(溫度、殼聚糖分子量、表面活性劑濃度等)對形成的殼聚糖納米粒的影響，為其進一步的潛在應用提供了理論指導。Hu等利用殼聚糖和酪蛋白磷酸肽，藉助於LC-MS/MS，DLS, TEM等分析測試手段，成功合成了具有生物活性的殼聚糖-多肽納米複合物；Wang等利用離子凝膠技術合成了殼聚糖-聚天冬氨酸納米粒，採用牛血清蛋白作為模型藥物，模擬了胃腸環境進行體外釋放研究，發現其具有良好的緩釋效果。這些研究對於蛋白質多肽類藥物的傳遞提供了理論和現實的指導意義，在一定程度上解決了蛋白質類藥物的吸收和利用率的問題；霍美蓉等利用殼聚糖為原料，通過在其6-OH上引入羧甲基，2-NH2上引入疏水烷基鏈，製得N-辛基-0，N-羧甲基殼聚糖(0CC)兩親性衍生物，發現它在水溶液中能自發形成內核疏水、外殼親水的具有殼-核結構的兩親性膠束，對難溶性抗腫瘤藥物紫杉醇具有優越的增溶能力，使紫杉醇在水中的溶解度提高近500倍；Liu等合成了不同烷基鏈長度的烷基化羧甲基殼聚糖，研究了它們在水中的自組裝行為以及對抗癌藥物阿黴素的良好載藥能力。

【發明內容】

[0005]本發明是針對現有技術的不足採用自製的O-羧甲基殼聚糖十六烷基季銨鹽替代磷脂(如卵磷脂)，通過脂質體製備技術製備表面帶正電並同時含有氨基和羧基等官能團的包覆藥物紅景天苷的新型陽離子高分子脂質體:0-羧甲基殼聚糖十六烷基季銨鹽/膽固醇(DCMCs/chol)脂質體。該高分子脂質體不僅具備小分子脂質體的脂質雙層膜結構，而且製備方法簡單，水溶液中不易發生融合，穩定性好，藥物包封率高，具有良好的緩控釋功能，同時含有氨基和羧基等官能團，容易進行多功能化組裝。結果表明:用薄膜分散法製備的陽離子高分子脂質體(CPL)，其水溶液中平均粒徑分別為172.5±2.1nm5CPL形狀為不規則的球形，具有明顯的脂質雙層膜結構和較好的熱穩定性；CPL顆粒的Zeta電位可達+42.17mV。CPL即可包載水溶性物質，如水溶性磁流體和藥物紅景天苷，又可包載油溶性物質，如油溶性磁顆粒。CPL對紅景天苷的包封率可達90.1%以上；具有長效緩控釋功能。
[0006]本發明所述的一種包覆紅景天苷殼聚糖季銨鹽雙親性高分子脂質體的製備方法工藝步驟如下:
(1)N，N- 二甲基十六烷基環氧丙基氯化銨的合成
取2-20mlN，N- 二甲基十六烷基叔胺於圓底燒瓶中，於磁力攪拌器上攪拌，控制溫度為40-70°C，逐滴加入5-15ml環氧氯丙烷，密閉反應l_3h後，旋轉蒸發除去殘留的環氧氯丙烷，初產物用100-200ml丙酮重結晶，50-100ml乙醚洗滌2_5次，得到暗黃色蠟狀固體；
(2)0一羧甲基殼聚糖即O-CMC的合成
將2-15g羧甲基殼聚糖即CS溶解到質量分數為2%的醋酸溶液中，攪拌10-60min後，用50-100ml濃度為0.3mol/L NaOH溶液洗滌，沉澱，減壓過濾後將沉澱收集起來，用去離子水洗滌至中性得到溶脹的羧甲基殼聚糖；將溶脹的羧甲基殼聚糖加入到20-70ml質量分數為42%Na0H水溶液中，在冰浴上攪拌反應，使羧甲基殼聚糖充分溶脹，再將一氯乙酸逐滴加入到上述體系中，一氯乙酸與CS的質量比為:2.3:3，用鹽酸將體系的pH調節到7.0，將O —羧甲基殼聚糖的鹽溶液過濾，乙醇洗滌然後用去離子水透析，凍幹得O —羧甲基殼聚糖；
(3)羧甲基殼聚糖季銨鹽即DCMCs的合成
將0.2-2g0 一羧甲基殼聚糖溶解在40-400ml異丙醇水溶液中，兩者的體積比為1:3，置於250ml圓底燒瓶中於磁力攪拌器上攪拌，加熱到40-60°C，將步驟(1)中製得的暗黃色蠟狀固體慢慢加入到O —羧甲基殼聚糖溶液中，40-60°C密閉反應12-36h，所得液體產物用丙酮沉澱，過濾得到白色沉澱物，所得沉澱物用去離子水溶解，用截留分子量為8000-14000的透析帶去離子水透析，凍幹得到白色產物；
(4)包覆紅景天苷高分子脂質體的製備
按兩者的質量比1-3:1稱取DCMCs和膽固醇加入到茄形瓶中，溶於5-15ml的三氯甲烷中，然後在35°C下 於旋轉蒸發儀上以旋轉速度50-200r/min進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣加以保護；當茄形瓶中形成一層透明均勻的脂質膜後，繼續旋蒸10-40min之後將茄形瓶取下放到真空烘箱中真空乾燥12_24h ;充分乾燥後，向茄形瓶中加入10-30ml濃度為0.5 mg/ml紅景天苷水溶液，將脂質膜水化，然後用超聲波清洗器以100_400w的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質體溶液。[0007]本發明的有益效果是:實驗室合成的殼聚糖季銨鹽(DCMC)代替磷脂，用薄膜分散法製備的殼聚糖季銨鹽雙親性高分子脂質體(CPL)，其水溶液中平均粒徑分別為172.5±2.1nm ；CPL形狀為不規則的球形，具有明顯的脂質雙層膜結構和較好的熱穩定性；CPL顆粒的Zeta電位可達+42.17mV。CPL即可包載水溶性物質，如水溶性磁流體和藥物紅景天苷，又可包載油溶性物質，如油溶性磁顆粒。CPL對紅景天苷的包封率可達90.1%以上；具有長效緩控釋功能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1 為 CS、CMCs、DCMCs 紅外圖譜；
圖2為DCMC高分子脂質體和包有0A-Fe304 DCMC高分子脂質體TEM圖；
圖3為包覆紅景天苷的DCMCs高分子脂質體體外釋放曲線。
【具體實施方式】[0009]實施例1: (I)移取8.6mlN, N- 二甲基十六烷基叔胺於250ml圓底燒瓶中，於磁力攪拌器上攪拌，控制溫度為60°C，慢慢一滴一滴的加入7.5ml的環氧氯丙烷，密閉反應2h後，旋轉蒸發除去殘留的環氧氯丙烷，初產物用100mL丙酮重結晶，70ml乙醚洗滌3次，得到暗黃色蠟狀固體。(2)5g羧甲基殼聚糖溶解到100mL質量分數為2%的醋酸溶液中，攪拌30min後，用75ml濃度為0.3mol/L的NaOH溶液洗滌，沉澱，減壓過濾後將沉澱收集起來，用去離子水洗滌至中性得到溶脹的羧甲基殼聚糖。將溶脹的羧甲基殼聚糖加入50ml 42%的NaOH水溶液中，在冰浴上攪拌反應2h，使羧甲基殼聚糖充分溶脹，再將一氯乙酸(一氯乙酸/CS=2.3:3 w/w)—滴滴加入到體系中，整個過程持續lh，室溫下攪拌反應24h後，用鹽酸將體系的PH調節到7.0，將CMC的鹽溶液過濾，乙醇洗然後用去離子水透析3天，凍幹得0-CMC。(3) 1.0gO-CMC溶解在40ml異丙醇水溶液中(v/v=l: 3)，置於250ml圓底燒瓶中於磁力攪拌器上攪拌30min，加熱到50°C，將(I)中製得的暗黃色蠟狀固體慢慢加入到CMC溶液中，50°C密閉反應24h,所得液體產物用100mL的丙酮沉澱,過濾得到白色沉澱物,所得沉澱物用去離子水溶解，用截留分子量為8000-14000的透析帶去離子水透析5天，凍幹得到白色產物。(4)精確稱取60mg的DCMC和20mg膽固醇，質量比(w/w)為3:1，加入到50mL茄形瓶中，溶於IOml三氯甲烷中，然後在35°C下於旋轉蒸發儀上以50r/min旋轉速度進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣流加以保護。當茄形瓶中形成一層透明均勻的脂質膜後，繼續旋蒸30min，之後將茄形瓶取下，再放到真空烘箱中真空乾燥12h。充分乾燥後，向爺形瓶中加入20ml,0.5 mg/mL的紅景天苷水溶液,將脂質膜水化,然後用超聲波清洗器以IOOw功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質體溶液。
[0010]實施例2: (I)移取4.3mlN，N-二甲基十六烷基叔胺於250ml圓底燒瓶中，於磁力攪拌器上攪拌，控制溫度為60°C，慢慢一滴一滴的加入4ml的環氧氯丙烷，密閉反應2h後，旋轉蒸發除去殘留的環氧氯丙烷，初產物用150ml的丙酮重結晶，50ml乙醚洗滌3次，得到暗黃色蠟狀固體。(2)2.5gCS溶解到50ml質量分數為2%的醋酸溶液中，攪拌30min後，用40ml濃度為0.3mol/L的NaOH溶液洗滌，沉澱，減壓過濾後將沉澱收集起來，用去離子水洗滌至中性得到溶脹的CS。將溶脹的CS加入25ml 42%的NaOH水溶液中，在冰浴上攪拌反應2h，使CS充分溶脹，再將一氯乙酸(一氯乙酸/CS=2.3:3 w/w)—滴滴加入到體系中，整個過程持續lh，室溫下攪拌反應24h後，用鹽酸將體系的pH調節到7.0，將CMC的鹽溶液過濾，乙醇洗然後用去離子水透析3天，凍幹得0-CMC。(3) 0.5gO-CMC溶解在80ml異丙醇水溶液中(v/v=l: 3)，置於250ml圓底燒瓶中於磁力攪拌器上攪拌30min，加熱到50°C，將(I)中製得的暗黃色蠟狀固體慢慢加入到CMC溶液中，50°C密閉反應24h，所得液體產物用200ml丙酮沉澱，過濾得到白色沉澱物，所得沉澱物用去離子水溶解，用截留分子量為8000-14000的透析帶去離子水透析5天,凍幹得到白色產物。(4)精確稱取30mg的DCMC和IOmg膽固醇質量比(w/w)為3:1，加入到50mL茄形瓶中，溶於IOml三氯甲烷中，然後在35°C下於旋轉蒸發儀上以50r/min旋轉速度進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣加以保護。當爺形瓶中形成一層透明均勻的脂質膜後，繼續旋蒸30min，之後將茄形瓶取下，再放到真空烘箱中真空乾燥12h。充分乾燥後，向茄形瓶中加入20ml，0.25 mg/mL的紅景天苷水溶液，將脂質膜水化，然後用超聲波清洗器以IOOw功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質體溶液。
[0011]實施例3: (1)取17.2mlN，N-二甲基十六烷基叔胺於250ml圓底燒瓶中，於磁力攪拌器上攪拌，控制溫度為60°C，慢慢一滴一滴的加入15ml的環氧氯丙烷，密閉反應2h後，旋轉蒸發除去殘留的環氧氯丙烷，初產物用200ml丙酮重結晶，100mL乙醚洗滌3次，得到暗黃色蠟狀固體。(2)10gCS溶解到200ml質量分數為2%的醋酸溶液中，攪拌30min後，用150ml濃度為0.3mol/L的NaOH溶液洗滌，沉澱，減壓過濾後將沉澱收集起來，用去離子水洗滌至中性得到溶脹的CS。將溶脹的CS加入100mL 42%的NaOH水溶液中，在冰浴上攪拌反應2h，使CS充分溶脹，再將一氯乙酸(一氯乙酸/CS=2.3:3 w/w) 一滴滴加入到體系中，整個過程持續lh，室溫下攪拌反應24h後，用鹽酸將體系的pH調節到7.0，將CMC的鹽溶液過濾，乙醇洗然後用去離子水透析3天，凍幹得0-CMC。(3) 2.0gO-CMC溶解在120ml異丙醇水溶液中(v/v=l:3)，置於250ml圓底燒瓶中於磁力攪拌器上攪拌30min，加熱到50°C，將(I)中製得的暗黃色蠟狀固體慢慢加入到CMC溶液中，50°C密閉反應24h，所得液體產物用200ml丙酮沉澱，過濾得到白色沉澱物，所得沉澱物用一定量的去離子水溶解，用截留分子量為8000-14000的透析帶去離子水透析5天，凍幹得到白色產物。(4)精確稱取50mg的DCMC和20mg膽固醇質量比(w/w)為5:2，加入到IOOmL茄形瓶中，溶於15ml三氯甲烷中，然後在35°C下於旋轉蒸發儀上以lOOr/min旋轉速度進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣加以保護。當茄形瓶中形成一層透明均勻的脂質膜後，繼續旋蒸30min，之後將茄形瓶取下，再放到真空烘箱中真空乾燥12h。充分乾燥後，向茄形瓶中加入30ml，0.5 mg/mL的紅景天苷水溶液，將脂質膜水化，然後用超聲波清洗器以IOOw功率進行超聲分散，直至形成 半透明乳液，即得到高分子脂質體溶液。
【權利要求】
1.一種包覆紅景天苷殼聚糖季銨鹽高分子脂質體的製備方法，其步驟是: (ON, N- 二甲基十六烷基環氧丙基氯化銨的合成 取2-20mlN，N- 二甲基十六烷基叔胺於圓底燒瓶中，於磁力攪拌器上攪拌，控制溫度為40-70°C，逐滴加入5-15ml環氧氯丙烷，密閉反應l_3h後，旋轉蒸發除去殘留的環氧氯丙烷，初產物用100-200ml丙酮重結晶，50-100ml乙醚洗滌2_5次，得到暗黃色蠟狀固體； (2)0一羧甲基殼聚糖即O-CMC的合成 將2-15g羧甲基殼聚糖即CS溶解到質量分數為2%的醋酸溶液中，攪拌10-60min後，用50-100ml濃度為0.3mol/L NaOH溶液洗滌，沉澱，減壓過濾後將沉澱收集起來，用去離子水洗滌至中性得到溶脹的羧甲基殼聚糖；將溶脹的羧甲基殼聚糖加入到20-70ml質量分數為42%Na0H水溶液中，在冰浴上攪拌反應，使羧甲基殼聚糖充分溶脹，再將一氯乙酸逐滴加入到上述體系中，一氯乙酸與CS的質量比為:2.3:3，用鹽酸將體系的pH調節到7.0，將O —羧甲基殼聚糖的鹽溶液過濾，乙醇洗滌然後用去離子水透析，凍幹得O —羧甲基殼聚糖； (3)羧甲基殼聚糖季銨鹽即DCMCs的合成 將0.2-2g0 一羧甲基殼聚糖溶解在40-400ml異丙醇水溶液中，兩者的體積比為1:3，置於250ml圓底燒瓶中於磁力攪拌器上攪拌，加熱到40-60°C，將步驟(1)中製得的暗黃色蠟狀固體慢慢加入到O —羧甲基殼聚糖溶液中，40-60°C密閉反應12-36h，所得液體產物用丙酮沉澱，過濾得到白色沉澱物，所得沉澱物用去離子水溶解，用截留分子量為8000-14000的透析帶去離子水透析，凍幹得到白色產物； (4)包覆紅景天苷高分子脂質體的製備 按兩者的質量比1-3:1稱取DCMCs和膽固醇加入到茄形瓶中，溶於5-15ml的三氯甲烷中，然後在35°C下於旋轉蒸發儀上以旋轉速度50-200r/min進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣加以保護；當茄形瓶中 形成一層透明均勻的脂質膜後，繼續旋蒸10-40min之後將茄形瓶取下放到真空烘箱中真空乾燥12_24h ;充分乾燥後，向茄形瓶中加入10-30ml濃度為0.5 mg/ml紅景天苷水溶液，將脂質膜水化，然後用超聲波清洗器以100_400w的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質體溶液。
【文檔編號】A61K47/36GK103893121SQ201410079254
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】熊華, 寧方建, 彭海龍, 黎文建 申請人:南昌大學