一種用於檢測冠狀動脈閉塞狹窄的生物標記物及其製備方法和含有該標記物的試劑盒與流程
2023-10-19 03:32:07
本發明涉及用於診斷疾病的生物標記物及診斷試劑盒和標記物的製備方法。具體地說是一種可用於檢測冠狀動脈閉塞狹窄的生物標記物及含有該標記物的試劑盒以及該生物標記的製備方法。
背景技術：
冠狀動脈狹窄屬於冠狀動脈病變，是導致冠心病的重要成因。準確評估冠狀動脈狹窄程度對於早期發現和幹預治療冠心病具有極為重要的意義。目前，冠狀動脈造影技術(CAG)是臨床檢查冠狀動脈病變的金標準，但其檢查具有創傷性、費用高、時間長的缺點。近年來，隨著CT技術的發展，多排CT冠狀動脈成像檢查越來越多地應用於臨床。多排CT冠狀動脈成像技術可顯示斑塊成分、判斷斑塊的穩定性和冠狀動脈官腔的狹窄程度，其作為一種無創檢查方法，對於篩查、早期發現和幹預治療冠心病具有極為重要的意義。但該方法受患者個體體徵影響較大。如256-MSCT受患者呼吸影響較大，且患者心率過快或心率變異較大，均可引起官腔周圍血管顯示粗糙、模糊、從而導致對血管狹窄程度評估不準確。(吳紅麗等256層螺旋CT對冠狀動脈狹窄的評價)。另外，運動偽影、冠狀動脈鈣化等難以克服的因素，也常常影響了該評估方法的準確度。
因此，尋找易於操作應用、準確度高且不易受幹擾的評估冠狀動脈閉塞狹窄的方法成為科研人員亟待解決的問題。
技術實現要素：
本發明的目的之一是要提供一種準確度高、不受幹擾、且檢測速度快、使用方便的可檢測冠狀動脈閉塞狹窄的生物標記物。
本發明的目的之二是提供一種製備上述生物標記物的方法。
本發明的目的之三是提供一種新的用於評估冠狀動脈閉塞狹窄的生物試劑盒。
本發明的目的是這樣實現的：
本發明所提供的用於檢測冠狀動脈閉塞狹窄的生物標記物，其名稱為circ-Sirt1，它包括如SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因。
本發明人通過對冠狀動脈閉塞狹窄患者的血漿研究，發現了此類患者血漿中的SIRT1基因表達量異常，且其表達量與冠狀動脈閉塞狹窄的程度呈負相關性，由此完成了本發明。
本發明所提供的SIRT1基因的製備方法包括以下步驟：
通過設計擴增環狀RNA的特異性引物擴增出SIRT1生物標記的環狀RNA，通過PCR產物克隆DNA測序的方法獲得如SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因(即circ-Sirt1)及其準確的環化位點；
其具體製備方法如下：
1)提取人血漿中總RNA；
2)在上述提取的總RNA中加入反應液，通過消化、滅活去除總RNA中殘留的DNA；
3)將除去殘留DNA後的RNA，採用隨機引物逆轉錄成cDNA；
4)引物設計及PCR擴增克隆測序；
設計PCR擴增引物：引物序列circ-Sirt1-F：CTGATGAACCGCTTGCTAT；circ-Sirt1-R：CATGTGAGGCTCTATCCTCC；選取GAPDH為內參基因，作為螢光定量PCR結果的矯正基因，上下遊引物序列GAPDH-F：ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC；GAPDH-R：TGAGTCCTTCCACGATACCAA；用上述引物進行PCR擴增反應，反應完後取PCR產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物切膠回收，膠回收試劑盒純化，後使用T4連接酶將PCR產物連接入pMD18-T載體中，再將連接產物轉化進大腸桿菌Top10感受態細胞中，過夜培養，挑取陽性克隆進行DNA測序，測序結果顯示SIRT1基因的2-7外顯子首尾連接環化，cDNA的核酸序列如SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因(即circ-Sirt1)。
上述製備方法步驟1)更為具體的方法是：按照以下步驟提取總RNA：
(a)採用EDTA-K2抗凝管採集外周靜脈血樣本。採集的血液樣本2小時內，4℃2000g離心20min，收集上清液再次4℃10000g離心20min，收集上清分裝-80℃保存。
(b)300μl血漿加入900μlTrizol LS，室溫下混勻充分裂解5min。
(c)加入0.2ml氯仿:異戊醇(24:2)，振蕩15s，室溫靜置2min。
(d)4℃12000g離心15min，取上清。
(e)加入0.6ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，-20℃靜置2h。
(f)4℃12000g離心15min，取上清。
(g)加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉澱。4℃12000g離心5min，棄上清。
(h)短暫晾乾，加入10μl DEPC處理過的H2O溶解。
(i)2μl RNA溶液使用Nano Drop2000記錄A260/A280吸光值，A260/A230吸光值，剩餘樣品-80℃保存待進行逆轉錄反應。
上述製備方法步驟2)中，反應總體積為20μl，組分和反應體系如下；
上述製備方法步驟3)中，20μl逆轉錄反應體系和條件如下：
上述製備方法步驟4)中，20μlPCR擴增circ-Sirt1的反應體系為：
反應條件：95℃2min，95℃15s，61℃1min，40個循環。PCR產物4℃保存。
上述製備方法步驟4)中，用T4連接酶將膠回收純化的PCR產物連接到pMD18-T載體上，連接體系如下：
反應條件：16℃連接4h。
本發明所提供的用於評估冠狀動脈閉塞狹窄的生物試劑盒，包括有：
血漿總RNA提取試劑組、RNA逆轉錄試劑組、實時螢光定量PCR試劑組、實時螢光定量PCR引物組、
(a)用於檢測SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因的探針；該探針具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因雜交的DNA或反義DNA。
(b)用於檢測SEQ ID NO：1所示的核酸序列基因的擴增引物；該擴增引物上遊序列SEQ ID NO：2所示和下遊序列SEQ ID NO：3所示。
(c)內參基因擴增引物，該擴增引物上遊序列SEQ ID NO：4所示和下遊序列SEQ ID NO：5所示。
本發明螢光定量PCR試劑盒適用於目前市場上所有類型螢光定量基因擴增儀，靈敏度高，特異性好，具有良好的應用前景。
本發明的創新性體現在：
1)本發明提供了一種可用於評估患者冠狀動脈狹窄程度的生物標記物及檢測試劑盒，並由此也為臨床提供了一種檢測冠狀動脈狹窄的新方法。
2)本發明所提供的circ-Sirt1生物標記物及檢測試劑盒在用於檢測、評估患者冠狀動脈狹窄程度時具有靈敏度高、特異性強的突出效果。
3)本發明所設計出的circ-Sirt1基因擴增引物能夠靈敏地、特異性地檢測冠狀動脈狹窄患者血漿中circ-Sirt1表達量，其可準確地評估患者冠狀動脈狹窄程度。它為臨床冠心病的早期診斷、治療提供了有效依據。
4)本發明所提供的circ-Sirt1基因還可作為冠狀動脈狹窄患者潛在治療靶點
5)本發明所提供的生物標記物、試劑盒及其檢測方法，不受人體體徵影響，其準確度更為理想。
附圖說明
圖1為本發明所製備出circ-Sirt1生物標記物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中Marker為DM2000，擴增的circ-Sirt1序列長度240bp。
圖2為circ-Sirt1環化位點和PCR產物測序結果圖。
圖3為使用circ-Sirt1引物對受試者血液樣本中circ-Sirt1的表達量篩查結果圖，其中Nor為健康對照組，AS為實驗病例組；
圖4為circ-Sirt1簡易結構示意圖。
具體實施方式
下述實施例僅用於具體闡述實驗方法，不應理解為對本發明的限制。本領域的技術人員在本發明的基礎上進行的非實質性修改和替換均屬於本發明所保護的範圍。
試劑：實驗中所用的試劑均為市售產品。其中提取血漿或血清樣本的試劑盒為Life Technologies公司Trizol LS Reagent試劑盒；逆轉錄試劑盒為Life Technologies公司qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統；螢光定量反應試劑盒為Life Technologies公司SYBR Green qPCRSuperMix-UDG；pMD18-T載體為TAKARA公司；其他試劑均為國產分析純。
實施例1circ-Sirt1基因的製備
1)提取人血漿中總RNA：使用基於Life Technologies公司Trizol LS Reagent試劑抽提。
(a)採用EDTA-K2抗凝管採集外周靜脈血樣本。採集的血液樣本2小時內，4℃2000g離心20min，收集上清液再次4℃10000g離心20min，收集上清分裝-80℃保存。
(b)300μl血漿加入900μlTrizol LS，室溫下混勻充分裂解5min。
(c)加入0.2ml氯仿:異戊醇(24:2)，振蕩15s，室溫靜置2min。
(d)4℃12000g離心15min，取上清。
(e)加入0.6ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，-20℃靜置2h。
(f)4℃12000g離心15min，取上清。
(g)加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉澱。4℃12000g離心5min，棄上清。
(h)短暫晾乾，加入10μl DEPC處理過的H2O溶解。
(i)2μl RNA溶液使用Nano Drop2000記錄A260/A280吸光值，A260/A230吸光值，剩餘樣品-80℃保存待進行逆轉錄反應。
2)總RNA中基因組DNA的去除：使用ThermoFisher公司DNA酶消化。
反應總體積為20μl，組分和反應條件如下；
3)總RNA逆轉錄：使用Life Technologies公司M-MLV第一鏈合成試劑。
20μl逆轉錄體系和反應條件為：
4)引物設計及PCR擴增克隆測序：使用Life Technologies公司SYBR Green qPCRSuperMix-UDG螢光定量PCR反應試劑，在ABI公司7300型PCR儀上進行擴增。
設計PCR擴增引物。引物序列如SEQ ID NO：2所示(即circ-Sirt1-F：CTGATGAACCGCTTGCTAT)或如SEQ ID NO：3所示(circ-Sirt1-R：CATGTGAGGCTCTATCCTCC)；選取GAPDH為內參基因，作為螢光定量PCR結果的矯正基因，上下遊引物序列GAPDH-F：ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC(SEQ ID NO：4)；GAPDH-R：TGAGTCCTTCCACGATACCAA(SEQ ID NO：5)；用上述引物進行PCR擴增反應，20μl PCR擴增體系為：2×SYBRGreenqPCRSuperMix-UDG 10μl，cDNA 1μl，上下遊引物各0.5μl，補dH2O至20μl。反應條件：95℃2min；95℃15s，61℃1min，40個循環。取5μl PCR產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，電泳結果見圖1；將PCR產物進行割膠回收純化，後使用T4連接酶將PCR產物連接入pMD18-T載體中，10μl連接體系：純化的PCR產物7，10×T4Buffer 1μl，pMD18-T載體1μl，T4連接酶1μl，16℃連接4h。連接產物轉化進大腸桿菌Top10感受態細胞中，過夜培養，挑取陽性克隆進行DNA測序，測序結果見圖2。測序結果顯示SIRT1基因的2-7外顯子首尾連接環化(circ-Sirt1基因結構如圖4所示)，cDNA的核酸序列如SEQ ID NO：1所示的環狀RNA(circ-Sirt1)基因。
實施例2採用本發明所述生物標記物對患者冠狀動脈的狹窄程度進行檢測、評估
血液樣本：20例冠狀動脈粥樣硬化患者血漿受試樣本來自河北醫科大學第二附屬醫院心內科住院病例。20例健康者血漿樣本來自河北醫科大學第二附屬醫院體檢中心。
1)納入標準
經冠狀動脈造影獲得影像學證據的初次或再次發生冠狀動脈硬化閉塞狹窄的患者。
2)排除標準
健康者：年齡相仿的健康者，無冠心病史，無手術史，血脂、血糖、血壓正常，無家族遺傳病，無肝腎功能不全；
3)採集的標本分組
(a)實驗組n＝5：冠狀動脈狹窄程度分級達到Ⅱ級，管腔面積縮小26％～50％；；
(b)實驗組n＝10：冠狀動脈狹窄程度分級達到Ⅲ級，管腔面積縮小51％～75％；
(c)實驗組n＝5：冠狀動脈狹窄程度分級達到Ⅳ級，管腔面積縮小76％～100％；
(d)空白對照組n＝20：健康者；
4)血液標本和臨床資料的採集
(a)採用EDTA-K2抗凝管採集外周靜脈血樣本。採集的血液樣本2小時內，4℃2000g離心20min，收集上清液再次4℃10000g離心20min，收集上清分裝-80℃保存。
(b)收集樣本來源者的性別、年齡、現病史、既往病史、吸菸飲酒史、合併症(高血脂、高血壓、糖尿病等)、臨床分期、冠狀動脈造影各項影像學指標(狹窄段、狹窄程度和長度、遠端供血情況等)；
5)提取血漿中總RNA：使用生工生物工程公司TotalRNAExtractor試劑進行提取。
(a)300μl血漿加入900μlTrizol LS，室溫下混勻充分裂解5min。
(b)加入0.2ml氯仿:異戊醇(24:2)，振蕩15s，室溫靜置2min。
(c)4℃12000g離心15min，取上清。
(d)加入0.6ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，-20℃靜置2h。
(e)4℃12000g離心15min，取上清。
(f)加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉澱。4℃12000g離心5min，棄上清。
(g)短暫晾乾，加入10μl DEPC處理過的H2O溶解。
(h)2μl RNA溶液使用Nano Drop2000記錄A260/A280吸光值，A260/A230吸光值，剩餘樣品-80℃保存待進行逆轉錄反應。
6)總RNA中基因組DNA的去除：使用寶生物公司DNA酶消化。
反應總體積為20μl，組分和反應條件如下；
7)總RNA逆轉錄：使用Promega公司Reverse Transcriptase Kit(M-MLV)進行cDNA第一鏈合成。
20μl逆轉錄體系和反應條件為：
8)circ-Sirt1表達量：按照Life Technologies公司實時螢光定量PCR試劑盒配置反應體系，在Rotor Gene 3000Real-Time PCR儀上檢測。
20μl反應體系如下：
其中上下遊引物分別為：
上遊引物：5』-CTGATGAACCGCTTGCTAT-3』
下遊引物：5』-CATGTGAGGCTCTATCCTCC-3』
擴增條件：擴增條件：95℃2min；95℃15s，63℃30s，72℃34s，5個循環；95℃15s，61℃1min，40個循環。
根據螢光定量PCR相對定量公式：計算出circ-Sirt1在健康人血漿(Nor)和動脈粥樣硬化患者(AS)血漿中表達水平。
結果如圖3所示，circ-Sirt1表達水平在0.7～1.3為健康人血漿；circ-Sirt1表達水平在0.7～1.3為冠狀動脈狹窄Ⅱ級患者；circ-Sirt1表達水平在0.03～0.09為冠狀動脈狹窄Ⅲ級患者；circ-Sirt1表達水平小於0.03為冠狀動脈狹窄Ⅳ級患者。
上述檢測結果與患者冠狀動脈造影結果相比較其結論一致。
SEQUENCE LISTING
河北醫科大學
一種用於檢測冠狀動脈閉塞狹窄的生物標記物及其製備方法和含有該標記物
的試劑盒
5
PatentIn version 3.3
1
927
DNA
circ-Sirt1
1
acaacctcct gttggctgat gagatcatca ctaatggttt tcattcctgt gaaagtgatg 60
aggaggatag agcctcacat gcaagctcta gtgactggac tccaaggcca cggataggtc 120
catatacttt tgttcagcaa catcttatga ttggcacaga tcctcgaaca attcttaaag 180
atttattgcc ggaaacaata cctccacctg agttggatga tatgacactg tggcagattg 240
ttattaatat cctttcagaa ccaccaaaaa ggaaaaaaag aaaagatatt aatacaattg 300
aagatgctgt gaaattactg caagagtgca aaaaaattat agttctaact ggagctgggg 360
tgtctgtttc atgtggaata cctgacttca ggtcaaggga tggtatttat gctcgccttg 420
ctgtagactt cccagatctt ccagatcctc aagcgatgtt tgatattgaa tatttcagaa 480
aagatccaag accattcttc aagtttgcaa aggaaatata tcctggacaa ttccagccat 540
ctctctgtca caaattcata gccttgtcag ataaggaagg aaaactactt cgcaactata 600
cccagaacat agacacgctg gaacaggttg cgggaatcca aaggataatt cagtgtcatg 660
gttcctttgc aacagcatct tgcctgattt gtaaatacaa agttgactgt gaagctgtac 720
gaggagatat ttttaatcag gtagttcctc gatgtcctag gtgcccagct gatgaaccgc 780
ttgctatcat gaaaccagag attgtgtttt ttggtgaaaa tttaccagaa cagtttcata 840
gagccatgaa gtatgacaaa gatgaagttg acctcctcat tgttattggg tcttccctca 900
aagtaagacc agtagcacta attccaa 927
2
19
DNA
circ-Sirt1-F
2
ctgatgaacc gcttgctat 19
3
20
DNA
circ-Sirt1-R
3
catgtgaggc tctatcctcc 20
4
21
DNA
GAPDH-F
4
atcttccagg agcgagatcc c 21
5
21
DNA
GAPDH-R
5
tgagtccttc cacgatacca a 21