用於增強免疫功能的乳桿菌的製作方法
2023-10-22 02:04:37
專利名稱：用於增強免疫功能的乳桿菌的製作方法
技術領域：
本發明是關於免疫功能增強劑，其可以增加人體幹擾素的產生並增強人體免疫功能。
幹擾素(IFN)由多種細胞產生，如白細胞、成纖維細胞和T淋巴細胞，它在受病毒感染時產生並保護其它細胞不受病毒感染。因此，幹擾素具有抑制病毒繁殖的作用。
幾種幹擾素中，據報導IFN-α的產量在患癌症、糖尿病、結核病等的病人中降低，產IFN-α的能力與對感染的敏感性成負性相關。
另外，還報導了IFN-γ的產量在癌症病人中降低，而在患橋本氏病和自身免疫病等的病人中產量增高。
還已知IFN-γ的產生對人體免疫功能的貢獻不同於IFN-α的產生所反映的貢獻。
因此，產生IFN-α和IFN-γ的能力被作為評價人體免疫功能的有用參數。
增強這些免疫功能被認為可改善免疫功能缺陷病人的一般狀況和生活質量。
為了增強免疫功能，已建議服用IFN或使用強免疫增效劑如OK 432。
已知自然殺傷細胞(NK)活性與癌症病人狀況相關，眾所周知服用IFN可增強NK細胞的活性。
但是，重複使用IFN或免疫增效劑如OK 432發現會引起副作用。如內環境紊亂、發熱和不適。
因此，不是服用IFN，而是發展了免疫功能增強劑，其可以提高人體內幹擾素的產生並增強免疫功能。實際上，已建議雙螺旋RNA、吡喃共聚物、陰離子高聚物和多種多糖(見日本專利公開No.Hei.3-9882)作為免疫功能增強劑。
但是，因為這些熟知的免疫功能增強劑不是人體中自然存在的，所以這些增強劑有毒性，當用來治療感染或腫瘤時，在人體中可產生副作用。
本發明的一個目的是提供一種免疫功能增強劑，它可增加幹擾素的產生並增強人體免疫功能。使用免疫功能增強劑可治療或預防感染和腫瘤。
在這一點上，本發明人已發現了一種包括短乳桿菌凝結亞種(Lactobacillus brevis subsp.coagulans)CCTCC M94025菌粉的免疫功能增強劑。
短乳桿菌凝結亞種菌粉可用例如以下步驟產生首先，作為乳桿菌(Lactobacillus)來源的起始菌種在25-35℃、100rpm速度攪拌下在下述培養基A、B或C中培養18-40小時。
然後，濃縮或離心培養液，再冷凍乾燥為短乳桿菌凝結亞種菌粉。
培養基A①酵母膏 0.5%②葡萄糖 1.5%③磷酸二氫鉀 0.5%④磷酸氫鈉 2.0%⑤氯化鈉 0.425%⑥氫氧化鈉 0.0375%⑦脫脂黃豆提取物 8.75%⑧碳酸鈣沉澱 0.1%培養基B蛋白腖(polypeptone) 0.5-1.0%酵母膏 0.5-1.0%葡萄糖 0.5-1.0%pH 6.5-7.0培養基C酵母膏 0.55%葡萄糖 1.10%蛋白腖 1.25%
磷酸二氫鈉 0.025%磷酸氫鈉 0.025%硫酸鎂 0.01%硫酸錳 0.0005%pH 6.5-7.0製備培養基A時，組分①-⑦加熱下溶解在水中。然後，溶液中加入組分⑧後，調節溶液pH為6.8-7.0，再在121℃高壓蒸氣滅菌15分鐘。另外，脫脂黃豆提取物用下述步驟製備脫脂後，將黃豆浸在稀鹽酸(約0.25N)中，加入胃蛋白酶，然後混合物在不時攪拌下在37℃保持40-48小時消化。消化後，加入氫氧化鈉中和此溶液。然後離心此溶液，取出上清液作為脫脂黃豆提取物。
起始菌種最好從食物如乳桿菌(Tsukemono)發酵的蔬菜中得到。每種培養基A、B和C 50l產生100-500g細菌粉末，其中每g含20-500億個細菌(2×109-5×1010/g)。
菌粉最好以粉末、片劑、膠囊或粒化粉末的形式口服給藥。
製備片劑時，菌粉可與L-穀氨酸鈉(10%)或與作為分散介質的脫脂奶粉(10%)和L-穀氨酸鈉的混合物、及作為賦形劑的幹馬鈴薯澱粉混合。
下面詳細描述本發明的優選實施方案。
起始菌種得自乳桿菌發酵的日本芸苔屬Suigukina變種(Bras-sica J a ponica Var.Suigukina)。起始菌種在25°-35℃下、在100rpm攪拌下，在培養基A中培養細菌30小時。然後約10000rpm離心培養液，並冷凍乾燥成為細菌粉末，稱其為短乳桿菌PK。
用這種方法得到的細菌粉末具有下列乳桿菌特徵的特性(1)-(6)，基於它具有示於下表1的酵解特徵，此細菌粉末還被鑑定為短乳桿菌凝結亞種。
(1)它為革蘭氏陽性桿菌。
(2)它分解培養基中的碳酸鈣。
(3)它用培養基中的葡萄糖產生乳酸。
(4)還原硝酸鹽的能力為陰性。
(5)液化明膠的能力為陰性。
(6)消化酪蛋白的能力為陰性。
然後，將幹馬鈴薯粉加到上述方法得到的菌粉中，並調節菌粉使其每g含108-109個細菌。再加入無水乳糖作為賦形劑。由此製備250mg的片劑。
每天年齡在25-65歲的4名健康男性和6名健康女性口服6個片劑，計4周。給藥前及給藥後2周和4周採外周血液於含肝素試管中。測定IFN-α和IFN-γ的產量、自然殺傷細胞(NK)活性和2-5A(2′，5′寡腺苷酸)合成活性，測定結果示於表2和表3。
IFN-α和-γ利用FL-細胞(來自人羊膜)和Sindobis病毒用50%CPE(細胞致病作用)的生物檢測方法進行測定。
用於測定IFN-α的方法的一個例子描述如下肝素化外周血液用全血方法處理以產生IFN。然後離心管中收集2ml全血。加入HVJ(Sendai病毒)，其最終濃度為500HA/ml。37℃培養20小時，然後3，000rpm離心。收集上清液以測量IFN-α的產量。
下面描述用於測定IFN-γ的方法的一個例子肝素化外周血液在Eagle′s MEM中稀釋4倍，加入PHA-P(購自Sigma)使終濃度為25μg/ml。37℃培養48小時後，3，000rpm離心，收集上清液作為IFN-γ樣品。
在測定NK細胞活性時，用Ficoll-Paque方法從外周血中分離出外周單核細胞，這樣得到了效應細胞。用Cr51標記的K562細胞作為靶細胞與效應細胞以E/T(效/靶)比為20∶1進行混合。用常規方法測定細胞毒性。
無刺激血漿中2-5A合成酶活性太低，檢測不出，用HVJ(Sendai病毒)刺激血漿20小時後測其2-5A合成酶活性，以評價IFN-α的產生能力。用放射免疫測定試劑盒(Eiken Chemical Co.Tokyo生產)測定2′，5′-寡腺苷酸(2-5A)合成酶活性。
從表2和表3所示結果可清楚看出，上述方法製備的菌粉提高了IFN-α的產量、NK細胞活性和2-5A合成酶活性。
另外，菌粉在給藥後，血液測試表明在任何個體中與標準值沒有大的差異。
權利要求
1.組合物，其含有短乳桿菌凝結亞種(Lactobacillus brevis subsp.coagulans)CCTCC M94025菌粉。
2.權利要求1的組合物，其中所述短乳桿菌凝結亞種菌粉每克含有2×109-5×1010個細菌。
3.權利要求1或2的組合物，其形成粉劑、片劑、膠囊或粒化粉劑。
4.權利要求1或2的組合物，其中短乳桿菌凝結亞種得自乳桿菌發酵的日本芸苔屬Suigukina變種。
5.權利要求3的組合物，其中短乳桿菌凝結亞種得自乳桿菌發酵的日本芸苔屬Suigukina變種。
6.增強病人免疫力的方法，其包括給需要這種治療的病人服用增強免疫力有效量的權利要求1的組合物。
7.增加人體內IFN-α的產量的方法，其包括給人服用增加IFN-α產量有效量的權利要求1的組合物。
8.提高人體自然殺傷細胞活性的方法，其包括給人服用提高自然殺傷細胞活性有效量的權利要求1的組合物。
9.提高人體內2-5A合成酶活性的方法，其包括給人服用提高2-5A合成酶活性有效量的權利要求1的組合物。
全文摘要
含有短乳桿菌凝結亞種的組合物用於增強病人的免疫功能，特別是關於增加幹擾素的產生、2-5A合成酶活性和自然殺傷細胞活性。
文檔編號A61K35/66GK1112959SQ9410630
公開日1995年12月6日 申請日期1994年5月30日 優先權日1994年5月30日
發明者岸田綱太郎 申請人:財團法人京都巴斯德研究所, 信和藥品株式會社, 日本藥品工業株式會社