一種毛囊幹細胞的分離培養方法

2023-10-24 05:16:42 3

專利名稱：一種毛囊幹細胞的分離培養方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種毛囊幹細胞的分離培養方法。
背景技術：
幹細胞生物學研究的開展與進步，大大促進了人們對於發育過程中許多基礎生物學問題的理解，同時也帶給人們一種全新的疾病治療思路——幹細胞移植。對於大面積皮膚燒(燙)傷和皮膚病治療來說，幹細胞移植具有長遠的應用前景。表皮幹細胞移植最早在 1991年就已經用於臨床，然而，其形成的皮膚不具有皮脂腺和毛囊，所以在功能上來說是不全的。皮膚是哺乳動物自身與外部環境的屏障，具有抵禦微生物感染、保持水分、調節體溫、感覺、吸收、分泌與排洩等生理功能。毛囊是皮膚的附屬物，其結構包括外根鞘、內根鞘、 真皮乳頭、皮脂腺和毛乾等，目前認為毛囊幹細胞存在於外根鞘的特定部位隆突部。毛囊幹細胞是皮膚中已知細胞類型中多潛能性較強的幹細胞，小鼠體內實驗證明，它能形成完整的表皮、皮脂腺和毛囊。毛囊幹細胞是成體幹細胞的一種。相對胚胎幹細胞和目前新興起的誘導多能性幹細胞來說，由於哺乳動物幾乎所有體表都覆蓋有毛囊，毛囊幹細胞更容易從自身獲得，不受倫理因素的制約，避免了異體幹細胞移植帶來的免疫排斥，因此具有很大的臨床應用前景與價值。毛囊幹細胞移植首先要解決的問題就是如何獲得足量毛囊幹細胞。傳統的毛囊幹細胞分離方法主要是基於流式細胞儀的分選方法，例如2003年Trempus CS等最早用α 6 整合素抗體和⑶；34抗體分選出了小鼠毛囊幹細胞，2006年Ohyama M等用多種抗體的組合分選出人毛囊幹細胞。但是這種基於流式細胞儀分選的方法有很大的缺點，即需要大量皮膚用於製備單細胞懸液，這對於大面積皮膚損傷(燒傷或燙傷等)的患者來說是不可能的。 此外，分選過程中，單個細胞在體外時間長，處於懸浮狀態，細胞容易發生凋亡，細胞經過流式細胞儀時容易受到機械損傷，這些都導致分選到的毛囊幹細胞不易成活，克隆形成效率極低。如何利用儘可能少的皮膚組織高效獲得足量的毛囊幹細胞用於幹細胞移植，是當前亟待解決的難題。

發明內容
因此，本發明的目的是提供一種毛囊幹細胞的分離培養方法。本發明的目的是採用以下技術方案來實現的。本發明提供的毛囊幹細胞的分離培養方法，是利用器官培養的方法，採用 William』 s E完全培養基對毛囊進行培養並分離純化出毛囊幹細胞。優選地，所述方法中所採用的William』 s E完全培養基為在William』 s E基本培養基中添加以下成分10納克/毫升的表皮生長因子，5微克/毫升的胰島素，1微克/毫升的氫化可的松，5. 8毫摩爾/升的L-谷醯胺，0. 115微克/毫升的維生素A，1微克/毫升的維生素D2，1微克/毫升的轉鐵蛋白，100納克/毫升的亞油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200單位/毫升的青黴素鈉，200單位/毫升的硫酸鏈黴素；更優選地，所述William』 s E完全培養基中還包括體積百分含量為15%的胎牛血清。優選地，所述培養毛囊的條件如下37°C、5% CO2和100%溼度。優選地，所述方法還包括採用消化液純化通過器官培養法獲得的毛囊幹細胞的步驟；優選地，所述消化液為含有質量百分含量為0. 的胰酶和0. 008%的EDTA的磷酸緩衝液；優選地，所述純化步驟如下在室溫下(20 30°C，優選為25°C左右)，用消化液消化從毛囊長出的細胞(包括毛囊幹細胞以及成纖維細胞等雜細胞，消化液覆蓋細胞即可，大約消化3-5分鐘，如果需要獲得極高純度的毛囊幹細胞，可以適當延長消化時間)後，成纖維細胞等雜細胞脫落，用磷酸緩衝液洗掉成纖維細胞，再加入消化液，於37°C下繼續消化3-5 分鐘，用磷酸緩衝液收集消化下來的毛囊幹細胞，1000轉/分鐘離心5分鐘後，傳代或凍存。優選地，所述方法還包括傳代和增殖純化的毛囊幹細胞的步驟；優選地，所述傳代和增殖的條件如下William’s E完全培養基，37°C、5% C02、100%溼度，2_3天更換一次培養液。優選地，所述方法還包括鑑定所製備的毛囊幹細胞的步驟；更優選地，所述鑑定方法選自細胞形態結構鑑定、mRNA水平鑑定和蛋白質水平鑑定。優選地，所述方法中的毛囊來自哺乳動物皮膚；更優選地，所述毛囊來自哺乳動物觸鬚，優選為大鼠觸鬚。本發明還提供了上述方法所製備出的毛囊幹細胞。綜上所述，本發明通過顯微剝離技術在體視鏡下剝離出大鼠觸鬚毛囊，利用器官培養的方法，將觸鬚毛囊用William』 s E完全培養基進行培養，毛囊貼壁後，毛囊幹細胞從隆突部長出並形成克隆，此細胞的克隆形成效率高，易純化，純度幾乎達到100%，能長期傳代並保持特性不變。由於開始培養時毛囊幹細胞在其原來的微環境中生長，沒有受到損傷， 克服了傳統的流式細胞儀分選方法對毛囊幹細胞造成嚴重機械損傷而導致克隆形成效率極低的缺點，並且培養基中添加了有利於毛囊幹細胞穩定增殖的因子，只需要很小的皮膚組織，甚至用一根觸鬚毛囊就獲得了可以長期使用的足量的毛囊幹細胞。完全培養基中血清濃度經過優化，體積百分含量為15%時毛囊幹細胞生長最好。在一個優選實施方案中，本發明提供的主要技術路線包括(1)顯微剝離出毛囊；(2)用合適培養基進行器官培養；(3)對形成的克隆進行純化；(4)毛囊幹細胞的傳代；(5)毛囊幹細胞的鑑定本發明所具有的主要特點及所能達到的有益效果為需要的皮膚材料少，只用幾根毛囊甚至一根即可；開始時細胞在其原來的微環境中生長，對細胞損傷小，克隆形成效率高；能夠穩定傳代，可以獲得足量毛囊幹細胞。由此可見，本發明避免了傳統的先分離後培養策略給細胞帶來的損害，採用先培養後純化的策略，所以只用少量毛囊就能獲得大量毛囊幹細胞。具體地說，本發明利用器官培養方法，從各種不同類型的培養基中篩選出了最合適的培養基和生長因子，僅用很小一塊皮膚組織，顯微剝離出毛囊，對整個毛囊直接進行培養，待毛囊幹細胞形成克隆後，對其純化並傳代。由於幹細胞離體後是在其原來的毛囊微環境中生長，生長狀態好，成活率高， 易於形成克隆，經過純化，可以達到極高的純度，並且能夠長期傳代而保持特性不變。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1是本發明所提供的技術路線圖。圖2是毛囊照片；其中A為剝離前(帶真皮鞘)，B為剝離後。圖3是從毛囊隆突部長出的克隆；其中A是40倍放大，可以看到整個克隆；B說明只有隆突部長出了克隆；C是A的部分放大，放大倍數100倍。圖4是毛囊幹細胞的純化；在室溫下，用消化液消化，待成纖維細胞脫落後，洗掉成纖維細胞，轉到37°C培養箱中繼續消化，大約3分鐘後毛囊幹細胞開始脫落，其中A是消化前毛囊幹細胞和成纖維細胞的共培養；B是室溫消化後成纖維細胞全部脫落，只剩下毛囊幹細胞克隆。圖5是毛囊幹細胞的傳代和增殖；其中A是從一根毛囊獲得的第八代毛囊幹細胞生長第五天時的照片，放大倍數100倍；B是第十代毛囊幹細胞的生長曲線，共3次重複， 500個細胞生長15天，可以達到接近IO7數量級；C是第十代毛囊幹細胞的克隆形成效率， 接種1000個細胞，形成了 491個克隆，克隆形成效率為49. 1%。圖6是毛囊幹細胞的結構。用PI染細胞核後發現，此細胞的細胞核在整個細胞體積中佔很大的比例，即核質比很大，符合幹細胞的基本特徵。A是用PI染細胞核，B是明視場，C是兩者合併的照片。圖7是利用Real-time PCR技術，在mRNA水平上對第7代和第12代毛囊幹細胞進行鑑定。其中A為第7代和第12代克隆形態照片；B為在mRNA水平上，檢測了第7代、第 12代毛囊幹細胞和新生大鼠成纖維細胞中K14(基底層角質細胞的標誌分子)、Κ15、α 6-整合素(均為毛囊幹細胞的標誌分子)和Ρ63(基底層角質幹細胞的標誌分子)的表達，表明與新生大鼠成纖維細胞相比，上述基因在第7代和第12代毛囊幹細胞中高表達。圖8是利用免疫螢光技術，在蛋白質水平上對毛囊幹細胞進行鑑定；其中A和B分別為毛囊幹細胞的標誌分子α 6-整合素和基底層角質幹細胞的標誌分子Ρ63，每幅圖從左到右依次為靶蛋白(綠色)、ΡΙ染細胞核(紅色)、兩者合併、明視場、全部合併的照片。圖中，HFSC 為毛囊幹細胞(hair follicle stem cell)，Fb 為成纖維細胞(Fibroblast)。結果表明，與成纖維細胞相比，α 6-整合素和Ρ63在毛囊幹細胞中高表達。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。以下實施例中使用的磷酸緩衝液除非特別指出，均為ρΗ值為7. 3的磷酸緩衝液， 其配方如下(IL) 0. 2g KCl,0. 24g KH2P04，8g NaCl，1. 44g 無水 Na2HPO4。實施例1 用器官培養法從單根大鼠觸鬚分離毛囊幹細胞
本實施例以單根大鼠觸鬚為例詳細說明本發明所提供的分離毛囊幹細胞的方法， 具體的技術路線參見圖1。實驗動物的飼養和使用按照中國科學院動物研究所動物與醫學倫理委員會的規定執行。一.大鼠觸鬚毛囊的顯微剝離取一小塊成年Wistar大鼠(中國科學院動物研究所)觸鬚部皮膚，用75%酒精消毒3-5分鐘；在體視鏡下，用鑷子夾住觸鬚毛囊靠近表皮的峽部，向真皮方向用力撕出毛囊；用29G針頭固定住毛囊，用解剖刀小心劃破真皮鞘，並將毛囊剝離出來，切斷真皮乳頭和真皮鞘間的連接。圖2示出了毛囊照片，其中A為剝離前(帶真皮鞘)，B為剝離後。二.培養毛囊的培養基篩選和優化本發明人嘗試了例如以下多種培養基對分離的毛囊進行培養1)Epidermal Keratinocyte Medium, Calcium-Free, miIiipore 公司，貨號 CNT-02C ；2)Epidermal Keratinocyte Medium, Non-Def, milliporeCNT-57 ；3)Keratinocyte-SFM, Invitrogen 公司，貨號 10744-019 ；4)文獻張藝，楊恬，毛囊Bulge細胞培養與生物學特性的研究，第三軍醫大學學報，2004年26卷16期，文章編號:1000-5404(2004) 16-1499-02中公開的培養基；其中， 用到的基本培養基分別為DMEM培養基，Hyclone公司，貨號SH30021. OlB ；F12培養基， Hyclone公司，貨號SH30026. OlB ；各種因子按照該文獻添加；5)表皮角質細胞培養基，Cascade公司，貨號M-EPI-500，該基本培養基中加入添力口劑 HKGS，Cascade 公司，貨號 S-001-5 ；6)文· :ffu WY and Morris RJ. 2005. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods Mol Biol 289:79—86 中公開的William』 s E完全培養基。結果顯示，僅有William』 s E完全培養基能夠成功且穩定的培養出毛囊幹細胞。在此基礎上，對William』 s E完全培養基中的胎牛血清含量進行了優化，具體試驗的胎牛血清體積百分含量分別為10%、15%和20%。結果顯示，William' s E完全培養基中的胎牛血清含量為10%和20%時，毛囊幹細胞克隆生長狀態很不好，常分泌出明亮的絲狀物纏繞在克隆上方，增殖很慢甚至不增殖，而胎牛血清含量為15%時，細胞生長狀態最好。三.用William，s E完全培養基培養毛囊1.配製William，s E完全培養基。向William，s E基本培養基(購自Gibco公司)中添加以下因子，各種因子的最終濃度為10納克/毫升的表皮生長因子，5微克/毫升的胰島素，1微克/毫升的氫化可的松，5. 8毫摩爾/升的L-谷醯胺，0. 115微克/毫升的維生素A，1微克/毫升的維生素D2，1微克/毫升的轉鐵蛋白，100納克/毫升的亞油酸，20 微克/毫升的牛血清白蛋白，200單位/毫升的青黴素鈉，200單位/毫升的硫酸鏈黴素。向添加因子後的William』 s E培養基中加體積百分含量為15%的胎牛血清，即為William』 s E完全培養基。2.將毛囊轉入6孔培養板，加William』 s E完全培養基，37°C、5% C02、100%溼度
的培養箱中培養。毛囊一般在第3-7天貼壁，然後毛囊幹細胞會從隆突部爬出，細胞邊緣明亮，緊密排列，為典型角質細胞特徵，如圖3所示，其中A是40倍放大，可以看到整個克隆；B 說明只有隆突部長出了克隆；C是A的部分放大，放大倍數100倍；本實施例中用到的所有毛囊幹細胞均來源於這一根毛囊。同時，可能會有成纖維細胞爬出。將取自同一隻大鼠的30根觸鬚隨機分為3組，每組10根，用上述方法分別培養， 發現3組中能夠貼壁並形成克隆的毛囊數量分別為10、5、7，表明有73%的毛囊能夠成功貼壁並形成毛囊幹細胞克隆。四.毛囊幹細胞的純化毛囊幹細胞具有貼壁緊的特點，利用這一特點，在室溫25°C左右，用消化液(含有質量百分含量為0. 的胰酶和0. 008%的EDTA的磷酸緩衝液)消化時，成纖維細胞會被消化下來，而幹細胞克隆仍貼在培養板上。用磷酸緩衝液小心將消化下來的成纖維細胞收集起來，離心後可以傳代或凍存，以備用於與毛囊幹細胞的共培養，為幹細胞提供與體內相似的模擬環境，有利於幹細胞的生長。再向培養板中加消化液，轉到37°C培養箱繼續消化 3-5分鐘，用磷酸緩衝液收集消化下來的毛囊幹細胞，離心後可以傳代或凍存。圖4示出了純化前後的培養細胞，其中A為消化前毛囊幹細胞和成纖維細胞的共培養照片；B為室溫消化後成纖維細胞全部脫落，只剩下毛囊幹細胞克隆照片。從圖8中重新貼壁後的細胞形態以及免疫螢光染色結果可以看出，純化後的幹細胞純度很高，接近 100%。五.毛囊幹細胞的傳代和增殖純化後，極低密度接種幹細胞時(例如只接種幾個毛囊幹細胞甚至1個)，要想讓單個的幹細胞增殖並重新形成克隆(幹細胞能夠自我更新，即理論上，單個幹細胞就能夠重新形成克隆)，需要加成纖維細胞共培養，成纖維細胞為幹細胞增殖提供適當的微環境， 若沒有成纖維細胞提供微環境，毛囊幹細胞就會發生分化。因此，將單根毛囊生長出的毛囊幹細胞和成纖維細胞按照1 1的比例接種到 IOcm培養皿中，加William』 s E完全培養基，37°C、5% C02、100%溼度的培養箱中培養，2-3 天更換培養液，大約2周後細胞長滿，可繼續傳代或在液氮中凍存備用。此細胞克隆效率高，第八代毛囊幹細胞的照片如圖5中的A所示，B是第十代毛囊幹細胞的生長曲線，共3次重複，500個細胞生長15天，可以達到接近IO7數量級；C是第十代毛囊幹細胞的克隆形成效率，接種1000個細胞，形成了 491個克隆，克隆形成效率為49. 1%，可以長期穩定傳代並保持細胞和克隆形態不變。由此，從一根毛囊就獲得了可以長期使用的足量的毛囊幹細胞。六.毛囊幹細胞的鑑定分別從細胞形態結構以及mRNA水平和蛋白質水平上對毛囊幹細胞進行鑑定。1.細胞形態結構鑑定用溴化丙錠(PI)染細胞核，具體方法如下1)細胞貼壁1小時後，用質量百分含量為4%的多聚甲醛固定10分鐘；幻用磷酸緩衝液洗三遍；幻10微克/毫升的PI (磷酸緩衝液配製，購買自北京中杉金橋生物技術有限公司)在室溫25°C左右染核10分鐘；4)用磷酸緩衝液洗三遍。染色結果發現，毛囊幹細胞具有很大的核質比，即細胞核在細胞中所佔的比例很大，這些都符合幹細胞的基本特徵，具體照片如圖6所示，其中A是用PI染細胞核， B是明視場，C是兩者合併的照片。2. mRNA水平鑑定
在mRNA 水平，參照文獻 Zhao P, De A，Hu Ζ, Li J, Mulders SM, Sollewijn Gelpke MD, Duan ΕΚ,Hsueh AJ. Gonadotropin stimulation of ovarian fractalkine expression and fractalkine augmentation of progesterone biosynthesis by luteinizing granulosa cells. Endocrinology. 2008 Jun ； 149 (6) :2782-9 中描述的 TRIzol 法及 Real time-PCR實驗步驟，提取第7代和第12代毛囊幹細胞及新生大鼠成纖維細胞的總mRNA， 通過Real-time PCR進行鑑定，所使用的引物序列見表1，即選用了以下國際上鑑定毛囊幹細胞常用標誌分子的基因基底層角質細胞的標誌分子K14、毛囊幹細胞的標誌分子K15和 α 6-整合素、基底層角質幹細胞的標誌分子Ρ63，檢測其相對表達量，以持家基因Actin的表達做為內參。結果表明，與新生大鼠成纖維細胞相比，上述標誌分子的基因均在第7代和第12代毛囊幹細胞中高表達，具體如圖7所示。表1 Real-time PCR用到的引物序列
權利要求
1.一種毛囊幹細胞的分離培養方法，其特徵在於，所述方法是利用器官培養的方法，採用William』 S E完全培養基對毛囊進行培養並分離純化出毛囊幹細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法中所採用的William’s E完全培養基為在William's E基本培養基中添加以下成分10納克/毫升的表皮生長因子，5微克/毫升的胰島素，1微克/毫升的氫化可的松，5. 8毫摩爾/升的L-谷醯胺，0. 115微克/ 毫升的維生素A，1微克/毫升的維生素D2，1微克/毫升的轉鐵蛋白，100納克/毫升的亞油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200單位/毫升的青黴素鈉，200單位/毫升的硫酸鏈黴素；優選地，所述William』 s E完全培養基中還包括體積百分含量為15%的胎牛血清。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述培養毛囊的條件如下37°C、5% CO2禾口 100%溼度。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括採用消化液純化通過器官培養法獲得的毛囊幹細胞的步驟；優選地，所述消化液為包含質量百分含量為0. 1 %的胰酶和0. 008 %的EDTA的硫酸緩衝液；更優選地，所述純化步驟如下在20 30°C下，用消化液消化從毛囊長出的細胞，清洗，再用該消化液於37°C下繼續消化3-5分鐘，用磷酸緩衝液收集消化的毛囊幹細胞，離心後進行傳代或凍存。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括傳代和增殖純化的毛囊幹細胞的步驟；優選地，所述傳代和增殖的條件如下William』 s E完全培養基，37°C、5% C02、100%溼度，2-3天更換一次培養液。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括鑑定所製備的毛囊幹細胞的步驟；優選地，所述鑑定方法選自細胞形態結構鑑定、mRNA水平鑑定和蛋白質水平鑑定。
7.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法中的毛囊來自哺乳動物皮膚；優選地，所述毛囊來自哺乳動物觸鬚，優選為大鼠觸鬚。
8.權利要求1至7中任一項所述的方法所製備出的毛囊幹細胞。
全文摘要
本發明提供一種毛囊幹細胞的分離培養方法。本發明提供的方法是利用器官培養的方法，採用William’s E完全培養基對毛囊進行培養並分離純化出毛囊幹細胞。本發明僅用很小的皮膚材料，通過顯微剝離技術，在體視鏡下剝離出大鼠觸鬚毛囊，然後對整個觸鬚毛囊進行培養，毛囊幹細胞從隆突部長出並形成克隆，此細胞的克隆形成效率高，易純化，能長期傳代並保持毛囊幹細胞特性不變，用一根觸鬚毛囊就能獲得可以長期使用的足量的毛囊幹細胞。
文檔編號C12N5/071GK102344906SQ201010622708
公開日2012年2月8日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年7月21日
發明者張守兵, 段恩奎 申請人:中國科學院動物研究所