一種蛋白質含量檢測方法
2023-10-24 06:31:42
專利名稱：一種蛋白質含量檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物化學分析檢測技術領域，具體涉及一種蛋白質含量檢測方法。
背景技術：
常規蛋白質濃度的檢測方法主要有Lowry法、BCA(Bicinchoninic acid)法和 Bradford法。Lowry法主要依據是鹼性條件下Cu2+與肽骨架的-CO-NH-基團形成藍色絡合物，然後將福林酚試劑中的鱗鎢酸和鱗鉬酸還原為鎢和鉬藍進一步呈色的結果。BCA方法是利用BCA能夠與Lowry法第一步反應形成的Cu+結合而生成的藍紫色複合物來測定的。 Bradford法的依據是染料考馬斯亮藍G-250能夠與蛋白質或分子量3 kD以上的肽中的賴氨酸和精氨酸結合形成有色物。這三種常用方法都是利用發色物質顏色的深淺與蛋白質濃度間存在線性關係而繪製標準曲線來測定樣品中蛋白濃度的，但在實際應用中都有局限。Lowry法操作繁瑣，而且還會受到很多化學成分的影響，例如表面活性劑Triton X-100或SDS含量僅達時，或者金屬離子螯合劑EDTA濃度達到10 mM時，或者尿素含量達3 M,或者硫酸銨濃度達0. 25 M等就會嚴重幹擾檢測結果；雖然BCA方法受表面活性劑幹擾影響小，但對還原劑、金屬離子螯合劑以及硫酸銨的存在很敏感。Bradford方法操作簡單，但與Lowry法類似，對表面活性劑的耐受性差，當0. 1% SDS或者0. 5%的TritonX-IOO 存在時，蛋白質樣品吸光值會受到較大影響。所以這些方法的具體使用總會因為測定液或者蛋白質裂解液的構成而局限，或者說，如果有幹擾物質存在，蛋白質濃度測定就需要針對不同的幹擾物質採取不同的方法，這樣給蛋白質含量測定帶來不便。因此，基於上述需要，本發明是上述方法為基礎，提高了對表面活性劑、還原劑、金屬離子螯合劑等幹擾物質的耐受性，而且也是具有較好穩定性的蛋白質檢測方法。英文縮寫、全稱及中文對照
DTTDithiothretol/ 二硫蘇糖醇
EDTAEthylene Diamine Tetraacetic Acid/乙二胺四乙酸
EGTAEthylene Glycol Tetraacetic Acid/乙二醇二乙醚二胺四乙酸
β -MEβ-Mercaptoethanol/ β-巰基乙醇
NP-40Nonidet Ρ-40/乙基苯基聚乙二醇
SDSSodium Dodecyl Sulfate/ 十二燒基硫酸鈉
BSABovine serum albumin/牛血清蛋白。
發明內容
本發明為提高蛋白質檢測對表面活性劑如SDS、TritonX-100和NP-40，還原劑DTT 和β -巰基乙醇，螯合劑EDTA和EGTA以及含氮化合物硫酸銨和尿素等幹擾物質的包容性， 提供一種簡單、快速而穩定性好的蛋白質濃度檢測方法。本發明所述的蛋白質含量檢測方法，流程如
圖11所示，包括如下步驟
1)標準蛋白溶液的製備稱取牛血清蛋白(BSA)溶解於蒸餾水中，將終濃度調配為4
3mg/mL，即為配製的標準蛋白溶液樣品；
2)試劑配製試劑①碳酸鈉1. 89 ι氫氧化鈉1. 00 ι試劑②酒石酸鈉0. 25 ι硫酸銅0. 125SDS2. 5 %
配製試劑②時，先將酒石酸鈉和硫酸銅混合靜置後再加入SDS ； 試劑③
將2 N福林酚溶液稀釋，然後調整pH為1，最後定容至10倍體積； 3)檢測蛋白質含量
將配製好的標準蛋白溶液按照二倍稀釋法採用蒸餾水稀釋至不同梯度濃度，然後於 96孔細胞培養板或者試管中分別加入同體積的標準蛋白溶液各梯度樣品、待測樣品、蒸餾水；
將試劑①和試劑②以50/1的體積比混合配成混合液，向上述96孔或者試管中分別加入樣品體積5倍的試劑①和試劑②的混合液；再分別加入樣品體積40倍的試劑③，混合均勻，在室溫下放置30 min，在570-630 nm範圍任一波長下測定吸光值，根據標準蛋白溶液各梯度樣品對應的數據繪製標準曲線，並推定線性回歸方程，再將待測樣品吸光值導入標準曲線回歸方程計算樣品中蛋白質含量。本發明步驟3)中檢測蛋白質含量的標準流程(微孔法和標準試管法)將配製完成的BSA標準蛋白溶液按照二倍稀釋法採用蒸餾水稀釋至最低濃度為0. 0625 mg/mL的7 個梯度濃度，然後於96孔細胞培養板或者試管中分別加入5 yL或者100 yL的BSA標準溶液各梯度樣品，空白對照為同體積的蒸餾水。另外按照標準蛋白溶液同樣體積將0. 1-4 mg/mL濃度區間的蛋白樣品分別加入96孔板或者試管中，每個標準或者待測樣品至少有3 個重複樣；
根據實際計算所需用量按照2)試劑配製說明準備試劑①和試劑②的混合液，對96孔或者試管內各樣品需分別加入25 μ L或者500 μ L的試劑①和試劑②的混合液；
然後於96孔或試管各樣品中分別加入200 yL或者4 mL試劑③，混合均勻，在室溫下放置30 min，在570-630 nm範圍任一波長下測定吸光值。微孔法樣品可直接利用酶標儀進行測定，試管法樣品則將1 mL發色液倒入塑料比色杯在分光光度計中進行檢測。獲得數據後繪製標準曲線，並推定線性回歸方程，再將待測樣品吸光值導入標準曲線回歸方程計算樣品中蛋白質含量。本發明是在Lowry法基礎上進行改進完善的。Lowry法是首先在蛋白質樣品溶液加入NaOH溶液而使之處於鹼性條件下，然後與現配的由2% Na2CO3:1% CuS04:2%酒石酸鉀鈉(100/1/1)組成的混合液混合，室溫放置10 min，再加入福林酚試劑放置30-60 min，於 550 nm波長測定吸光度。本發明將Lowry法的第一步和第二步反應試劑做了重新安排，並且加入了表面活性劑成分SDS。此外，第三步反應步驟沒有直接使用福林酚試劑，而是將其稀釋使用，檢測吸光值的波長處於570-630 nm之間都可以，以590 nm為最佳，且發色液可以保持數小時內沒有顯著變化。本發明是對幹擾物質耐受性好及發色液穩定的蛋白質檢測方法。 本發明以Lowry法為基礎，結合三種常規蛋白質濃度測定方法的優點，繪製的標準曲線線性關係好，對幹擾物質耐受性提高，見表1 表1.已測試的常見幹擾物質及最大抗幹擾濃度
權利要求
1. 一種蛋白質含量檢測方法，包括如下步驟1)標準蛋白溶液的製備稱取牛血清蛋白溶解於蒸餾水中，將終濃度調配為4 mg/mL, 即為配製的標準蛋白溶液樣品；2)試劑配製試劑①碳酸鈉1. 89 ι氫氧化鈉1. 00 ι試劑②酒石酸鈉0. 25 ι硫酸銅0. 125SDS2. 5 %配製試劑②時，先將酒石酸鈉和硫酸銅混合靜置後再加入SDS ； 試劑③將2 N福林酚溶液稀釋，然後調整pH為1，最後定容至10倍體積； 檢測蛋白質含量將配製好的標準蛋白溶液按照二倍稀釋法採用蒸餾水稀釋至不同梯度濃度，然後於 96孔細胞培養板或者試管中分別加入同體積的標準蛋白溶液各梯度樣品、待測樣品、蒸餾水；將試劑①和試劑②以50/1的體積比混合配成混合液，向上述96孔或者試管中分別加入樣品體積5倍的試劑①和試劑②的混合液；再分別加入樣品體積40倍的試劑③，混合均勻，在室溫下放置30 min，在570-630 nm範圍任一波長下測定吸光值，根據標準蛋白溶液各梯度樣品對應的數據繪製標準曲線，並推定線性回歸方程，再將待測樣品吸光值導入標準曲線回歸方程計算樣品中蛋白質含量。
2.根據權利要求1所述的蛋白質含量檢測方法，其特徵在於，步驟3)中待測樣品在檢測前濃度調整至0. 1-4 mg/mL。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白質含量檢測方法，該方法是先配製標準蛋白樣品、試劑①、②、③，將標準蛋白樣品製成梯度，採用微孔法或標準試管法將試劑①、②、③加入到梯度樣品和待測樣品中，測定吸光度，繪製標準曲線，再根據待測樣品的吸光值推算濃度。本發明方法既能準確檢測蛋白質含量，還能適用於含多種幹擾物質的蛋白質溶液。本發明提高了蛋白質分析檢測過程中對表面活性劑、還原劑、螯合劑以及含氮化合物等幹擾物質的包容性，是一種簡單、快速、靈敏度高而穩定性好的蛋白質濃度檢測方法，在生命科學研究領域具有廣泛應用前景。
文檔編號G01N21/31GK102252987SQ201110175208
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月27日 優先權日2011年6月27日
發明者盧山, 董源 申請人:南京師範大學