改良toll樣受體5刺激活性的修飾的鞭毛蛋白的製作方法

2023-10-24 03:02:27 1

專利名稱：：改良toll樣受體5刺激活性的修飾的鞭毛蛋白的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有增強的toll樣受體-5(下文稱為"TLR5")刺激活性的鞭毛蛋白突變體，特別涉及由點突變TRL5激動劑鞭毛蛋白的某些胺基酸以增強鞭毛蛋白的TLR5剌激活性而製備的鞭毛蛋白突變體。
背景技術：
：鞭毛是決定細菌運動性的重要結構元件，其通常由鉤狀體、基體和絲狀體所組成。己知鞭毛有助於遊動或集群運動、細菌趨向性、病原微生物對宿主細胞的粘附和生物膜的形成。形成鞭毛絲狀體的亞基蛋白被稱為鞭毛蛋白，鞭毛蛋白規則地裝配形成絲狀體。Hayashi等公開了哺乳動物細胞中表達的TLR5可識別革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的鞭毛蛋白而激活NF-kB(HayashiF，SmithKD，OzinskyA,HawnTR，YiEC,GoodlettDR,EngJK，AkiraS,UnderhillDM,AderemA:Nature410:1099-1103,2001)。Toll樣受體(TLRs)是典型的"模式識別受體(PRRs)"，它識別存在於病原體中的"病原體相關分子模式(PAMPs)"，且不僅在哺乳動物中發現了該受體，還在昆蟲和植物細胞的表面發現該受體。至今已發現十三種TLRs，這積極地引導了對TLRs激動劑的研究(AkiraS,UematsuS，TakeuchiO:Cell124(4):783-801,2006)。PRRs(例如TLRs)分布在宿主細胞的表面或細胞質中，在受到多種PAMPs刺激之後，PRRs能誘導先天性免疫應答，而且調節適應性免疫應答。因而，TLR激動劑可作為適合於開發多種免疫調節劑(尤其是疫苗佐劑)的靶點。在本文中，術語"疫苗佐劑"指在與疫苗共同給藥時，可以增強、延長或5加速由疫苗抗原誘導的Ag-特異性免疫應答的物質。批准用於人體的疫苗佐劑包括磷酸鋁，氫氧化鋁，和角鯊烯乳化劑。疫苗佐劑必須滿足以下五個要求中的至少一個1)調節共刺激分子在抗原呈遞細胞表面上的表達，誘導抗原特異性T淋巴細胞應答，或免疫調控(例如調控細胞因子的分泌)；2)抗原呈遞；3)誘導CD8+細胞毒性T淋巴細胞應答；4)靶向作用；和5)形成貯存。理想的疫苗佐劑1)必須是安全的；2)必須是在體內可生物降解的；3)與抗原單獨給藥時相比，必須顯示有效的預防性或治療性免疫應答；4)必須是經化學或生物驗證的物質；5)優選在濃度低於抗原時起作用；和6)必須具有長的半衰期，以便它們可以容易地用於商業或臨床應用。目前用作疫苗佐劑或可考慮用作疫苗佐劑的物質包括1)礦物鹽，例如氫氧化鋁凝膠；2)表面活性劑物質；3)細菌衍生的物質；4)細胞因子或激素；5)聚陰離子；6)聚丙烯基；7)載體；8)含病毒的活體載體；和9)賦形劑，例如礦物油脂質體。其中，目前正被活躍研究且受到很大關注的蛋白衍生的疫苗佐劑包括霍亂弧菌(附n'oc/^/erae)衍生的霍亂毒素(CT)和大腸桿菌(五sc/^n'c/n'aco//)衍生的不耐熱毒素(LT)。據報導這些疫苗佐劑誘導在黏膜區和血漿中產生抗原特異性抗體，並誘導B7-2在抗原呈遞細胞(APCs)表面的表達以刺激CD4+輔助T細胞的共刺激信號。但是，這些佐劑是具有高腸毒性的外毒素，因而正在進行有關降低它們的毒性和增強它們的佐劑活性的研究。如PCT國際專利公開文本WO2005/070455中所公開的，本發明人構建了轉座子突變體文庫以篩選創傷弧菌(P%n'OVM/m:/Cw)的粘附和入侵因子，並分析了已喪失對宿主細胞的粘附和運動性的三個克隆的Tn側翼區，結果本發明人鑑別了兩個含56個基因的鞭毛操縱子。在這個分析過程中，發現創傷弧菌總共有六個鞭毛蛋白基因(_/7"丄^a萬、^aF、y/aC、^/7aD和^a五)，白的主要組分。本發明人研究了創傷弧菌的極性鞭毛蛋白成分——鞭毛蛋白重組蛋白(FlaB)可作為針對創傷弧菌的組成疫苗的可能性，結果本發明人發現了鞭毛蛋白重組蛋白(FlaB)除具有高抗原性以外，還具有強的疫苗佐劑效力。為解釋這個發現，本發明人進行了進一步的研究。結果證明了當疫苗抗原破傷風類毒素與鞭毛蛋白一起施用於試驗動物鼻腔時，所述鞭毛蛋白通過將信號傳遞給宿主細胞的TLR5以激活免疫系統而擴大了疫苗效力，當致死劑量的破傷風毒素攻擊通過施用破傷風毒素和鞭毛蛋白而免疫的小鼠時，所述鞭毛蛋白誘導了對毒素的完全的防禦免疫，表明所述鞭毛蛋白具有優異的黏膜疫苗佐劑效力(LeeSE,KimSY，JeongBC，KimYR，BaeSJ,AhnOS,LeeJJ，SongHC,KimJM，ChoyHE,ChungSS，Kweon麗，RheeJH.:Infect.Immun.74:694-702，2006)。在多種TLR激動劑中，刺激TLR5的鞭毛蛋白是一種不同於其他TLR激動劑(CpG-DNA、MLP(支原體脂肽))的蛋白質組成。因而，可以合成特性可被持續控制的重組鞭毛蛋白，此外，可以構建多種具有增強的TLR5刺激活性的重組融合蛋白。根據對鞭毛蛋白三維結構的研究結果，在鞭毛蛋白單體中極性胺基酸殘基和帶電荷胺基酸殘基與在其它單體中那些極性胺基酸殘基和帶電荷胺基酸殘基反應，致使發生單體之間的軸向相互作用而形成聚合體，從而形成鞭毛蛋白的特徵性絲狀體結構(YonekuraK,Maki-YonekuraS,NambaK:Completeatomicmodelofthebacterialflagellarfilamentbyelectroncryomicroscopy.Nature.2003424(6949):643-50;SamateyFA,ImadaK,NagashimaS，VondervisztF，KumasakaT,YamamotoM,NambaK:Structureofthebacterialflagellarprotofilament禾口implicationsforaswitchforsupercoiling.Nature.2001410(6826):331-7)。根據Smith等的研究，TLR5不識別絲狀體類型的鞭毛蛋白聚合體，但識別鞭毛蛋白單體(SmithKD,Andersen-NissenE，HayashiF，StrobeK,BergmanMA，BarrettSL，CooksonBT，AderemA.TolI-like7receptor5recognizesaconservedsiteonflagellinrequiredforprotofilamentformation和bacterialmotility.NatImmunol.20034(12):1247-53)。在目前臨床應用中使用的預防性和治療性疫苗(傳染病、自身免疫性疾病、過敏性疾病和癌症的疫苗)中觀察到的共同問題是這些疫苗缺乏有效的可特異性地擴大相關應答的疫苗佐劑。因而，強烈地需要開發更安全和更有效力的疫苗佐劑。
發明內容相應地，本發明人通過改變預期參與軸向相互作用的胺基酸殘基而製備了創傷弧菌鞭毛蛋白基因y/as的重組鞭毛蛋白突變體，該突變體可以抑制在鞭毛蛋白單體之間的軸向相互作用中涉及的極性電荷反應，且已經發現製備的鞭毛蛋白突變體與現有的(野生型)鞭毛蛋白相比具有顯著增強的TLR5剌激活性，從而完成了本發明。因此，本發明的目的是提供具有增強的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突變體。本發明的另一目的是提供含有至少一種所述鞭毛蛋白突變體作為活性成分的疫苗佐劑。為實現上述目的，本發明提供了用於抑制在TLR5激動劑鞭毛蛋白中鞭毛蛋白單體之間相互作用的鞭毛蛋白突變體。本發明還提供含有至少一種所述鞭毛蛋白突變體作為活性成分的疫苗佐劑。在本發明中，通過提供與現有鞭毛蛋白相比具有增強的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突變體開發了改良的鞭毛蛋白疫苗佐劑，已發現該改良的鞭毛蛋白疫苗佐劑通過刺激TLR5顯示出有效的黏膜疫苗佐劑效力，如PCT國際專利公開文本No.WO2005/070455中所公開的。根據本發明的鞭毛蛋白突變體將被應用於治療傳染病，自身免疫性疾病，過敏性疾病等等，此外在抗癌治療中，所述鞭毛蛋白突變體將提供連接基礎研究和臨床研究的重要環節。因而，本發明的鞭毛蛋白突變體應用到多種疫苗製劑中會創造很高的增值價值。圖1顯示了沙門氏菌(&/mo"e〃a)鞭毛蛋白St-FliC、大腸桿菌鞭毛蛋白Ec-FliC和創傷弧菌鞭毛蛋白Vv-FlaB之間的胺基酸同源性的比較，其中框中的序列為各菌株的鞭毛蛋白結構域(SamateyFA，等人.，Structureofthebacterialflagellarprotofilament禾口implicationsforaswitchforsupercoiling.Nature.2001410(6826):331-7)。圖2是顯示在構建本發明的鞭毛蛋白突變體過程中，在創傷弧菌鞭毛蛋白基因flaB上誘導定點突變的策略的示意圖(SamateyFA，等人，Structureofthebacterialflagellarprotofilament禾卩implicationsforaswitchforsupercoiling.Nature.2001410(6826):331-7)。圖3和4顯示本發明的重組鞭毛蛋白突變體對水溶液中的鞭毛蛋白聚合的影響。圖5和6是顯示本發明鞭毛蛋白突變體的TLR刺激活性的測量結果的圖表。具體實施例方式下文將更為詳細地描述本發明。本發明涉及鞭毛蛋白突變體，該鞭毛蛋白突變體是通過點突變TLR5激動劑鞭毛蛋白的某些胺基酸而製備，以使鞭毛蛋白突變抑制鞭毛蛋白單體的多聚合作用，因而該鞭毛蛋白突變體表現出增強的TLR5刺激活性。本發明涉及SEQIDNO:2所示的鞭毛蛋白突變體(D70A)，其是通過將野生型創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB上第70位的天冬氨酸(D70)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的，據分析所述鞭毛蛋白FlaB參與了TLR5激動劑鞭毛蛋白中鞭毛蛋白單體之間的軸向相互作用；SEQIDNO:4所示的鞭毛蛋白突變體(R93A)，其是通過將第93位上的精氨酸(R93)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的；SEQIDNO:6所示的鞭毛蛋白突變體(L97W)，其是通過將第97位上的亮氨酸(L97)定點誘變成色氨酸(W)而製備的；SEQIDNO:8所示的鞭毛蛋白突變體(N101A),其是通過將第101位上的天冬醯胺(N101)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的；SEQIDNO:10所示的鞭毛蛋白突變體(S103W)，其是通過將第103位上的絲氨酸(S103)定點誘變成色氨酸(W)而製備的；SEQIDNO:12所示的鞭毛蛋白突變體(E108A)，其是通過將第108位上的穀氨酸(E108)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的；SEQIDNO:14所示的鞭毛蛋白突變體(N135D)，其是通過將第135位上的天冬醯胺(N135)定點誘變成天冬氨酸(D)而製備的；SEQIDNO:16所示的鞭毛蛋白突變體(A151W)，其是通過將第151位上的丙氨酸(A151)定點誘變成色氨酸(W)而製備的；SEQIDNO:18所示的鞭毛蛋白突變體(N153W)，其是通過將第153位上的天冬醯胺(N153)定點誘變成色氨酸(W)而製備的；和SEQIDNO:20所示的鞭毛蛋白突變體(V291W)，其是通過將第291位上的纈氨酸(V291)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。此外，在鞭毛蛋白突變體之中，具有兩個或多個胺基酸取代的鞭毛蛋白突變體也在本發明的範圍之內，其實例可包括SEQIDNO:44所示的鞭毛蛋白突變體(D70A/N135D)，其是通過將野生型創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點誘變成丙氨酸(A)並將第135位上的天冬醯胺(N135)定點誘變成天冬氨酸(D)而製備的，但本發明的範圍不限於此。本文中術語"鞭毛蛋白"指構成決定細菌運動性的鞭毛的單個分子。10本發明所提供的鞭毛蛋白突變體具有顯著增強的TLR5刺激活性，而這個現象是由於所述鞭毛蛋白突變體與現有鞭毛蛋白突變體相比較顯著地降低了鞭毛蛋白的多聚合作用，從而抑制鞭毛蛋白聚合。相應地，根據本發明製備的具有顯著增強的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突變體可提供更有效的TLR激動劑以取代現有的鞭毛蛋白，從而提供與現有的鞭毛蛋白相比具有增強的效力的疫苗佐劑。證明本發明的鞭毛蛋白突變體具有增強的TLR5刺激活性的方法包括以下步驟1)製備SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突變體；2)確認鞭毛蛋白突變體抑制在水溶液中鞭毛蛋白的聚合；和3)確認在大腸桿菌中誘導的各重組鞭毛蛋白突變體的TLR5激活作用。實施例下文中將參照實施例和測試實施例更為詳細地描述本發明。但應該理解的是，這些實施例和測試實施例僅是舉例說明本發明，而不是限制本發明的範圍。本發明所用菌株和質粒的特徵在下表1中總結。在實施例和測試實施例中顯示了每種鞭毛蛋白突變體的製備方法和各鞭毛蛋白突變體的具體特性。tableseeoriginaldocumentpage12各菌株的培養和保存以下實施例和測試實施例所用的大腸桿菌在LuriaBertani培養基(DifcoCo.)中培養。該培養菌株於30M甘油中保存在-8(TC冰箱。實施例l:通過定點誘變製備重組鞭毛蛋白突變體根據以前報導的沙門氏菌鞭毛蛋白三維結構的分析數據(YonekuraK,Maki-YonekuraS，NambaK:Completeatomicmodelofthebacterialflagellarfilamentbyelectroncryomicroscopy.Nature.2003424(6949》643-50;SamateyFA，ImadaK,NagashimaS，VondervisztF，KumasakaT，YamamotoM，NambaK:Structureofthebacterialflagellarprotofilament禾口implicationsforaswitchforsupercoiling.Nature.2001410(6826):331-7)，和本發明人進行的生物信息學分析，創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB單體之間軸向相互作用所需要的胺基酸殘基如下。即分別為參與了軸向相互作用的各單體的上亞基(uppersubimit)第70位的天冬氨酸(D70)、上亞基第135位的天冬醯胺(D135)、和上亞基第153位的丙氨酸(A151)，通過分別與各單體的下亞基(lowersubunit)第10020位的天冬醯胺(N100)、下亞基第108位的穀氨酸(E108)、下亞基第93位的精氨酸(R93)和下亞基第292位的丙氨酸(A292)的極性電荷反應而形成多聚體。即在以下胺基酸殘基之間發生極性電荷反應上鞭毛蛋白D70與下鞭毛蛋白N100;上鞭毛蛋白N135與下鞭毛蛋白E107;上鞭毛蛋白A151與下鞭毛蛋白R93;和上鞭毛蛋白N153與下鞭毛蛋白A292。在本發明中，通過對據分析參與鞭毛蛋白亞基之間軸向相互作用的以下胺基酸殘基進行定點誘變而製備以下鞭毛蛋白突變體SEQIDNO:2所示的鞭毛蛋白突變體(D70A)，其是通過將第70位上的天冬氨酸(D70)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的；SEQIDNO:4所示的鞭毛蛋白突變體(R93A)，其是通過將第93位上的精氨酸(R93)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的；SEQIDNO:8所示的鞭毛蛋白突變體(N101A),其是通過將第101位上的天冬醯胺(N101)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的；SEQIDNO:12所示的鞭毛蛋白突變體(E108A)，其是通過將第108位上的穀氨酸(E108)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的；SEQIDNO:14所示的鞭毛蛋白突變體(N135D)，其是通過將第135位上的天冬醯胺(N135)定點誘變成天冬氨酸(D)而製備的；SEQIDNO:16所示的鞭毛蛋白突變體(A151W)，其是通過將第151位上的丙氨酸(A151)定點誘變成色氨酸(W)而製備的；和SEQIDNO:18所示的鞭毛蛋白突變體(N153W)，其是通過將第153位上的天冬醯胺(N153)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。然而，據分析參與了鞭毛蛋白單體之間的軸向相互作用的第292位上的丙氨酸(A292)不用於構建突變體，因為即使在該胺基酸殘基被突變後軸向相互作用也不會發生改變。此外，通過對推測參與鞭毛蛋白單體之間的軸向相互作用的以下胺基酸殘基進行定點誘變來製備以下突變體SEQIDNO:6所示的鞭毛蛋白突變體(L97W)，其是通過將第97位上的亮氨酸(L97)定點誘變成色氨酸(W)13而製備的；SEQIDNO:IO所示的鞭毛蛋白突變體(S103W)，其是通過將第103位上的絲氨酸(S103)定點誘變成色氨酸(W)而製備的；和SEQIDNO:20所示的鞭毛蛋白突變體(V291W)，其是通過將第291位上的纈氨酸(V291)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。首先，為了獲得用於定點誘變的DNA模板，採用SEQIDNO.21所示的PCR引物FlaB畫V5(5'-gcggccgcatggcagtgaatgtaaatgtaaatacaaac國3';劃線部分用於克隆的A^I限制性內切酶識別位點)和SEQIDNO:22所示的PCR引物FlaB隱V4(5'-cccggggcctagtagacttagcgctga-3':劃線部分用於克隆的5Vwal限制性內切酶識別位點)，通過PCR擴增含有基因ORF的1,142-bpDNA片段。用引物FlaB-V5和FlaB-V4在以下條件下進行PCR擴增95。C起始變性1分鐘，然後95°C30秒變性、7(TC退火30秒和72'C延伸1分鐘進行30個循環，然後在72"C最後延伸IO分鐘。擴增的yZ"SDNA片段被克隆到PCR2.1-TOPO克隆載體(InvitrogenCo.)中，製得的載體稱為"pCMM270"。pCMM270質粒作為DNA模板用於後續的定點誘變。用於構建創傷弧菌鞭毛蛋白基因/"B定點突變體的PCR條件和克隆的質粒在下面表2中總結。tableseeoriginaldocumentpage15採用如上表2所示的各引物對、以pCMM270作為PCR模板、和使用保真屍/w聚合酶(StratageneCo.)按供應商的說明進行PCR反應來合成突變鏈。在以下條件下進行各PCR反應95'C起始變性45秒，然後95'C變性45秒、在表2所示溫度下退火1分鐘和68X:延伸10分鐘進行16個循環，之然後在68。C最後延伸IO分鐘。將SEQIDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的各擴增的定點突變y^BDNAs克隆到PCR2.1-TOPO克隆載體中，得到的載體稱為"pCMM272"、"pCMM281"、"pCMM282"、"pCMM283"、"pCMM284"、"pCMM285"、"pCMM273"、"pCMM286"、"pCMM287"和"pCMM288"(表2)。為製備SEQIDNO:44所示的D70A/N135D雙定點突變鞭毛蛋白D70A/N135D，以含DNA的pCMM273作為模板進行PCR反應。用SEQIDNO:23所示的PCR引物FlaB-SDl、SEQIDNO:24所示的PCR引物FlaB-SD2和保真屍/"聚合酶(StratageneCo.)按供應商的說明進行PCR來合成突變鏈(D70A)。在以下條件下進行PCR反應95。C起始變性45秒，然後95'C變性45秒、在63'C退火1分鐘和68。C延伸10分鐘進行16個循環，然後在68。C最後延伸10分鐘。SEQIDNO:43所示的擴增的D70A/N135D雙定點突變y/a萬DNA稱為"pCMM274"。以限制性內切酶A^I和Sm"I消化SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17和19的含有定點突變^7a5基因(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)的各DNA片段，然後克隆到以相同限制性內切酶消化的pTYB12質粒(NewEnglandBiolabs)中。得到的質粒分別稱為"pCMM276"、"pCMM291'，、"pCMM292"、"pCMM293"、"pCMM293"、"pCMM294"、"pCMM295"、"pCMM277"、"pCMM296"、"pCMM297"、"pCMM298"和"pCMM278"。這些質粒被電轉化進大腸桿菌ER2566中，並向其中添加0.5mM的5-溴』引哚-3-氯-異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以誘導突變鞭毛蛋白基因的表達。使用1，4-二硫蘇糖醇(1,4-DTT)和幾丁質磁珠柱按供應商的說明從內含肽融合蛋白中獲得點突變鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)。使用之前，使用AffinityPakDetoxiGel內毒素消除凝膠(Pirece)去除在分離的點突變蛋白中含有的內毒素。使用Superdex120柱(AKTA-Prime,Amersham)對分離的重組蛋白進行凝膠過濾，從而純化高純度的SEQIDN0:2，4，6，8，10，12，14，16，18，20和44所示的重組鞭毛蛋白突變體。測試實施例1:重組鞭毛蛋白突變體的產生和其在水溶液中的生物化學特性為了製備重組鞭毛蛋白突變體，SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19和43所示的編碼鞭毛蛋白突變體的每個基因都被克隆到pTYB12質粒中，然後將質粒轉染到大腸桿菌ER2566中。在培養基中添加0.3mMIPTG(異丙基-!3-D-l-硫代半乳糖苷)以誘導重組鞭毛蛋白突變體的產生，然後通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和天然凝膠電泳來分析得到的蛋白。分析結果如圖3和4所示。圖3和4顯示了野生型鞭毛蛋白(FlaB)和突變鞭毛蛋白FlaB的SDS-PAGE分析結果，圖中顯示SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44的點突變鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70雄135D)和野生型鞭毛蛋白(FlaB)都在41.5kDa處有主要條帶。在天然凝膠電泳結果中，可以觀察到野生型FlaB蛋白形成了巨大的多聚體，使得大部分蛋白保留在濃縮膠中，而進入分離膠中的一些FlaB蛋白分布在66kDa和140kDa之間。然而，本發明的點突變鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)形成了大約140kDa的多聚體。上述結果表明野生型FlaB蛋白在水溶液中形成了巨大的多聚體，但本發明的點突變鞭毛蛋白突變體(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)形成的多聚體小於野生型鞭毛蛋白形成的多聚體。因此，可以確定SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的本發明鞭毛蛋白突變體(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)抑制了鞭毛蛋白的聚合。測試實施例2:鞭毛蛋白突變體的TLR5刺激活性為了測量參與TLR5-介導信號的NF-KB的轉錄活性，以確定野生型FlaB禾口SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的本發明鞭毛蛋白突變體的TLR5刺激活性，按1x105細胞/孔的密度將293T細胞分種在24孔板的每個孔中並培養過夜。然後，使用FuGENE6(Roche)將可使轉錄活性被觀測到的報告質粒NF-kB-Luc(由Jeong-MokKim教授，InstituteofBiomedicalScience,HanyangUniversityCollegeofMedicine,韓國提供)、克隆TLR5基因的p3xFlag-hTLR5質粒(由Dr.StevenB.Mizel，D印artmentsofMicrobiologyandImmunology,WakeForestUniversitySchoolofMedicine,USA提供)和P-半乳糖苷表達質粒(Clontech)同時導入細胞中。細胞再培養24小時之後，更換新鮮培養液，並以實施例l分離的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突變體(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W禾口D70A/N135D)處理細胞18-24小時。然後，通過用發光計(Berthold)測量螢光素酶活性來檢測細胞中NF-kB的轉錄，測量結果在圖5和6中顯示。如圖5和6所示，以20ng/ml野生型FlaB蛋白處理的組與僅以磷酸緩衝液處理的對照組相比，TLR5介導NF-kB轉錄活性增強了約6.6倍。而以20ng/ml的每各重組鞭毛蛋白FlaB突變體(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)處理的組與僅以磷酸緩衝液處理的對照組相比，TLR5介導的NF-kB轉錄活性分別增強了約24.6倍、14倍、25倍、22.6倍、23.7倍、21倍、21.7倍、22.5倍、24.5倍、16.6倍和14.9倍。序列表文本SEQIDNO:l和2是鞭毛蛋白突變體(D70A)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的。SEQIDNO:3和4是鞭毛蛋白突變體(R93A)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第93位上的精氨酸(R93)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的。SEQIDNO:5和6是鞭毛蛋白突變體(L97W)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第97位上的亮氨酸(L97)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。SEQIDNO:7和8是鞭毛蛋白突變體(N101A)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第101位上的天冬醯胺(N101)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的。SEQIDNO:9和10是鞭毛蛋白突變體(S103W)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第103位上的絲氨酸(S103)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。SEQIDNO:ll禾卩12是鞭毛蛋白突變體(E108A)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第108位上的穀氨酸(E108)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的。SEQIDNO:13和14是鞭毛蛋白突變體(N135D)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬醯胺(N135)定點誘變成天冬氨酸(D)而製備的。SEQIDNO:15禾卩16是鞭毛蛋白突變體(A151W)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第151位上的丙氨酸(A151)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。SEQIDNO:17和18是鞭毛蛋白突變體(N153W)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第153位上的天冬醯胺(N153)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。SEQIDNO:19和20是鞭毛蛋白突變體(V291W)的基因和胺基酸序列,該鞭毛蛋白突變體是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第291位上的纈氨酸(V291)定點突變成色氨酸(W)而製備的。SEQIDNO:21-42是用於SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突變體的引物序列。SEQIDNO:43和44是鞭毛蛋白突變體(D70A/N135D)的基因和胺基酸序列，該鞭毛蛋白突變體通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點突變成丙氨酸(A)並將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬醯胺(N135)定點誘變成天冬氨酸(D)而製備的。權利要求1、一種創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，該鞭毛蛋白突變體具有增強的toll樣受體(TLR-5)刺激活性。2、根據權利要求1所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:2所示的鞭毛蛋白突變體(D70A)，該鞭毛蛋白突變體(D70A)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的。3、根據權利要求1所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:4所示的鞭毛蛋白突變體(R93A)，該鞭毛蛋白突變體(R93A)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第93位上的精氨酸(R93)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的。4、根據權利要求1所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:6所示的鞭毛蛋白突變體(L97W)，該鞭毛蛋白突變體(L97W)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第97位上的亮氨酸(L97)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。5、根據權利要求1所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:8所示的鞭毛蛋白突變體(N101A)，該鞭毛蛋白突變體(N101A)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第101位上的天冬醯胺(N101)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的。6、根據權利要求1所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:10所示的鞭毛蛋白突變體(S103W)，該鞭毛蛋白突變體(S103W)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第103位上的絲氨酸(S103)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。7、根據權利要求1所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:12所示的鞭毛蛋白突變體(E108A)，該鞭毛蛋白突變體(E108A)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第108位上的穀氨酸(E108)定點誘變成丙氨酸(A)而製備的。8、根據權利要求1所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:14所示的鞭毛蛋白突變體(N135D)，該鞭毛蛋白突變體(N135D)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬醯胺(N135)定點誘變成天冬氨酸(D)而製備的。9、根據權利要求1所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:16所示的鞭毛蛋白突變體(A151W)，該鞭毛蛋白突變體(A151W)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第151位上的丙氨酸(A151)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。10、根據權利要求l所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:18所示的鞭毛蛋白突變體(N153W)，該鞭毛蛋白突變體(N153W)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第153位上的天冬醯胺(N153)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。11、根據權利要求l所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:20所示的鞭毛蛋白突變體(V291W)，該鞭毛蛋白突變體(V291W)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第291位上的纈氨酸(V291)定點誘變成色氨酸(W)而製備的。12、根據權利要求l所述的創傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:44所示的鞭毛蛋白突變體(D70A/N135D)，該鞭毛蛋白突變體(D70A/N135D)是通過將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點誘變成丙氨酸(A)並且將創傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬醯胺(N135)定點誘變成天冬氨酸(D)而製備的。13、一種疫苗佐劑，其特徵在於，該疫苗佐劑含有至少一種選自由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所組成的組中的鞭毛蛋白突變體作為活性成分。14、鞭毛蛋白突變體用於刺激toll樣受體-5活性的用途，其中，所述鞭毛蛋白突變體為至少一種選自由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所組成的組中的鞭毛蛋白突變體。全文摘要本發明公開了具有增強的toll樣受體-5(下文稱為「TLR5」)刺激活性的鞭毛蛋白突變體。更具體而言，本發明公開了由點突變TRL5激動劑鞭毛蛋白的某些胺基酸以增強鞭毛蛋白的TRL-刺激活性而製備的鞭毛蛋白突變體。文檔編號C07K14/255GK101622272SQ200880004041公開日2010年1月6日申請日期2008年2月5日優先權日2007年2月9日發明者李施恩,李浚行,金守永申請人:全南大學校產學協力團