一種高分子量麥谷蛋白基因及用途的製作方法

2023-10-11 23:58:19 1

專利名稱：一種高分子量麥谷蛋白基因及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學技術領域，涉及一種高分子量麥谷蛋白基因的DNA分子及其應用。
背景技術：
小麥種子儲藏蛋白主要由麥醇溶蛋白(Gliadin)和麥谷蛋白(Glutenin)組成， 麥谷蛋白又分為高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GQ和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)， 亞基間通過二硫鍵結合形成大的谷蛋白聚合體，賦予麵團獨特的粘彈性和延展性 [Payne PI, Law CN, Mudd EE. Control by homologous group 1 chromosomes of the high-molecular~weight subunits ofglutenin，a major protein of wheat endosperm. Theor Appl Genet，1980，58 :113-120 ；Wrigley C W. Giant proteins with flour power. Nature，1996，381 :738-739 ；GianibelliM C，Larroque 0 R，MacRitchie F. Biochemical, genetic， molecular characterizationof wheat glutenin and its component subunits. Cereal Chem，2001，78 :635-646]，可以加工成麵包、麵條和糕點等多種食品。高分子量麥谷蛋白基因位點Glu-I位於小麥第1同源群染色體長臂，在A、B、D組染色體上含有相應的Glu-Al、Glu-Bl和Glu-Dl同源基因複合位點，每個Glu-I位點又包含分別編碼χ-和y-型高分子量麥谷蛋白亞基的2個緊密連鎖的基因[Payne P I，Holt L M，Law C N. Structural and genetical studies on the weightsubunits of wheat glutenin. Theor Appl Genet, 1981,60 :229-236 ；Shewry P R，HalfordN G and Tatham A S. The high-molecular~weight subunits of wheat glutenin. Journalof Cereal Science， 1992,15(2) :105-120] οHMW-GS有多種等位變異類型，其組成和數量與小麥麵粉品質性狀密切相關[Payne P I, Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread makingquality. Ann Rev Plant Physiol,1987, 38 :141-153], Payne(1982)
立了 HMW-GS對麵筋品質貢獻的評分系統，Glu-Al位點的1和2*亞基，Glu-Bl位點的7+8、 17+18和Bx7°e+8亞基，Glu-Dl位點的5+10亞基均是對麵粉品質有明顯正向效應的優質亞基[Payne PI, Lawrence G J. Catalogue of alleles for complex gene loci Glu-Al, Glu-Bl and Glu-Dlwhich code for high molecular weight subunits of glutenin in hexaploid wheat. CerealRes Commun，1983，11 (1) J9-35]。採用圖位克隆方法，迄今已分離了來自普通小麥的Axl、Bx7、Dx5、By8和By 12等HMW-GS等位基因。HMW-GS含有結構保守的N端和C端，以及由三種重複的短肽(PGQGQQ，GYYPTSPQQ，GQQ)組成的重複區域。HMW-GS 等位基因在整體結構上十分相似，根據其N端和C端保守序列設計引物，各國學者又先後從粗山羊草、中間燕麥草、長穗偃麥草等小麥近緣物種中克隆到多個同源的高分子量麥谷蛋白基因[Wan Y，Wang D, Shewry PR，Halford NG. Isolation and characterization of five novel high molecular weightsubunit genes from Triticum timopheevi and Aegilops cylindrica. Theor Appl Genet，2002，104 :擬8_839]，成為小麥品質改良的重要基因資源。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的高分子量麥谷蛋白基因及其應用。本發明所述新的高分子量麥谷蛋白基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；2)其核苷酸序列是序列表中序列2 ；3)在嚴格條件下能與1)、2)限定的DNA分子雜交的DNA分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC, 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然後用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列1)的DNA分子對應的胺基酸序列具有X型高分子量麥谷蛋白亞基的結構特徵,命名為Glu-Mx。序列2)的DNA分子對應的胺基酸序列具有Y型高分子量麥谷蛋白亞基的結構特徵,命名為Glu-My。含Glu-Mx或Glu-My的重組菌屬於本發明的保護範圍。含Glu-Mx或Glu-My的IM/IB代換系也屬於本發明的保護範圍。本發明獲得的Glu-Mx和Glu-My基因具有增強麵粉品質的潛在功能，在轉基因優質小麥新品種的培育方面有很好的應用價值。


圖1為Glu-Mx與普通小麥Bx7、BX13和BX20基因的同源性比較；圖2為Glu-My與普通小麥Dy 10、Dy 12基因的同源性比較；圖3為Glu-Mx與粗山羊草Dx2t基因的同源性比較；圖4為Glu-My與粗山羊草Dy 12. 2t基因的同源性比較；圖5為小麥B組染色體IB與山羊草屬M組染色體IM的代換系及其小麥輪迴親本 「R88」，其中A為1M/1B代換系，B為輪迴親本R88。
具體實施例方式實施例1、X-型、Y-型高分子量麥谷蛋白基因的獲得取培養20天的粗齒山羊草(Aegilop. heldreichii, 2n = MM)的幼苗葉片50mg, 採用CTAB法提取基因組DNA。根據高分子量麥谷蛋白基因的N端和C端保守序列合成PCR 引物Pr1和Pr2，引物序列如下正向引物Pr1 5，-ATGGCTAAGCGGC/TTA/GGTCCTCTTTG-3，反向引物Pr2 5，-CTATCACTGGCTG/AGCCGACAATGC-3，PCR反應程序為94°C預變性^iin ；然後94°C變性40s，64°C復性40s，72°C延伸 2min 30s, 30個循環；最後72°C保溫lOmin。電泳回收純化大小分別約為1. Skb和2. 5kb的DNA片段，將該DNA片段與載體 PMD-19T連接構建載體，轉化大腸桿菌DH5ci，酶切鑑定。隨機挑選6個鑑定正確的克隆進行測序，獲得2個不同序列的DNA片段。對所獲得的序列進行生物信息學分析，它們的胺基酸序列均含有小麥高分子量麥谷蛋白的典型結構特徵如保守的N端和C端結構，以及由PGQGQQ，GYYPTSPQQ，GQQ三種重複的短肽組成的中央重複區域等。序列表中序列1對應的胺基酸序列的N端和C端分別含有3個和1個半胱氨酸，中間重複區含有X型HMW-GS特有的GQQ重複單元，將其命名為 Glu-Mx,大小為M81bp。序列表中序列2對應的胺基酸序列的N端和C端分別含有5個和 1個半胱氨酸，具有Y型HMW-GS的胺基酸結構特徵，將其命名為Glu-My，大小為1860bp。將粗齒山羊草(Ae.heldreichii)的HMW-GS編碼基因序列分別與來自普通小麥 CTriticeaavestium)，粗山羊草(Aegilop tachuii)的HMW-GS基因序列進行同源性比對分析發現=Glu-Mx與普通小麥Bx7、BX13和BX20亞基基因的序列相似性僅為81. 55% (見圖 1), Glu-My與普通小麥DylO、Dyl2亞基基因的序列相似性為90. 12% (見圖2)。Glu-Mx與粗山羊草DX2t亞基基因的序列相似性為89. 02 % (見圖3)，Glu-My與粗山羊草DX12. 2t亞基基因的序列相似性為73. 46% (見圖4)，Glu-Mx和Glu-My核苷酸序列的變異主要表現為大量的鹼基替換和插入缺失發生，是一種新的高分子量麥谷蛋白基因。實施例2、1M/1B小麥代換系的獲得及品質指標分析本發明獲得的Glu-Mx和Glu-My基因位於山羊草屬M組第一同源染色體上(即 1M)，採用染色體工程方法，將同樣含有M染色體組的歐山羊草與普通小麥品種「R88」雜交、 連續多代回交，獲得1M/1B染色體代換系，該代換系與回交親本「R88」農藝性狀一致(見圖 5)。主要品質指標的檢測結果表明在麵粉蛋白質含量、溼麵筋含量、籽粒硬度、形成時間和穩定時間多個品質指標方面，1M/1B染色體代換系均比親本「R88」和對照「中國春」有顯著提高，說明在普通小麥基因組中導入含有Glu-Mx和Glu-My的IM染色體物質，能夠明顯改良小麥麵粉的品質。表1. 1M/1B小麥代換系的主要品質指標
材料蛋白質含水量溼麵筋硬度吸水率形成時間穩定時間
值
R8815. 1 10. 551. 333. 167. 9 52. 11. 72. 5
1M/1B 代
^ 19.4 10. 5 59.9 39.4 83.6 50. 12. 73.2
換系 ------——
中國春 1810.16838.468.4 50.81.51.2注下劃線標註數字表示增加幅度顯著的品質指標。序列表1 ATGGCTAAGCGGCTGGTCCTCTTTGTGGCGGTAGTTGTCGCCCTCGTGGCTCTCACCCTCGCTGAAGGT GAGGCCTCTGGACAACTACAGTGTGAGCGCGAGCTCAAGGCATGCCAGCAAGTCATGGACCAGCAGCTCCGAGACTT TAGCCCCGAGTGCCACCCCGTCGTCGTCAGCCCAGTCGCTGGACAATACCAGCAGCAAATCGTGCCCAAGGGCGGAT CTTTCTACCCCGGCGAGACCACGCCACCGCAGCAACTCCAACAAAGTATATTTTGGGGAATACCTGCACTACTAAAA AGGTATTACCCAAGTATAACTTCTCCGCAGCAGGTTTCATACTATCCAGGCCAAGCTTCTCCGCAACGGCCAGGACA AGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAATCAGGACAAGGACAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAACAGCCAG GACAATGGCAACAACCGGAACAAGGGCAACCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAACCAGGACAATTGCAACAA CCAAAACAAGGCCAACAAGCTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCCAATTTCTTCGCAGCTGCAGCC AGGACAATTGCAGCAACCAGCACAAGGGCAACAAGGGCAGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAACAGCCAGGACAAGGCCAACAACCAGAACAAGGGCAACAAGGTCAACAGCCAGGACAAGGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAAGGT CAGCAACTTGGACAAGGACAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCTGCAACAGTCGGGACAAGGGCAACCAGGGTACTA CCCAACTTCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGGGCAATCAGAGTACTACCCAACTTCTCTGCAGCAACCAGGACAAGGGC AGCAGCCAGGACAACTGCAGCAACCAGGACAAGGGCAGCAGCCAGGACAACTGCAACAACCAGCACAAGGGCAGCAA CCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGCCAGCAGCCAGGACAAGGGCAGCAATCGAG ACAAGGGCAGCCAGGGTACTACCCAACTTCTCCACAGCAGTCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCCAACTTCTT CGCAGCAGCCAGGACAATCGCAGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCTAGGACAAGGGCAACAAGCTCAG CAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCGGGACAAAGGCAGCCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAGTCAGGACAAGG GCAACCAGGGTACTACCTAACTTCTCCACAGCAGCCAGGACAATTGCAACAATCGGCACAAGGGCAAGAAGGACAGC AACCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAACAGCCAGGACAAGGGCAACAAAGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGT CAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAACCGGGACAAGGGCAGCC AGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAGTCAGGACAAGGGCAACAGCCAGGACAATGGCAACAACCAGGACAAGGGC AACCAGGGTACTACCCAACTTCTTCGTTGCAGCCTGGACAAGGGCAACCAGGGTACGACCCAACTTCTCCGCAACAG CCAGGACAAGGGCAGCAGTCAGGACAATTGCAACAACCAGCACAAGAGCAACAACTAGCACAAGGGCAGCAACCAGC ACAAGGGCAACAAGGTCAACAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGGCAGCAAC CAGCACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGCACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGCACAAGGGCAGCAACCGGGA CAAGGGCAGCCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGGAGTCAGGACAAGGGCAACAGCCAGGACAATGGCAACAATC AGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCTAACTTCTCTGTTGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAGCTT CTCTGCAGCAACCAGGACAATGGCAACAATCAGGACAAGGGCAACAGGGGTATTACTCAACTCCGCAGCTGTCAGGA CAAGGGCAACAGCCAGGACAATGGCTGCAACCAGAACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAACATTC AGGACAAGGGCAACAGCCAGGACAATGGCTGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAAC AGCCAGGACAAGGGCAGCAATCAGGACAAGGGCAGCAAGGCTACTACAGCTCATACCATGTTAGCGCGGAGCACCAG GCGCCCAGTCTAAAGGTGGCAAAGGCGCAGCAGCTCGCGGCACAGCTGCCGGCAATGTGCCGGCTGGAGGGCGGCGA CGCATTGTCGGCCAGCCAGTGATAG序列表2 ATGGCTAAGCGGTTGGTCCTCTTTGCGACAGTAGTCATTGCCCTCGTGGCTCTCACTGTCGCTCAAGGT GAGGCCTCTAGGCAACTACAGTGCGAGCGCGAGCTCCAGGAGAGCTCGCTTGAGGCATGCCGGCTGGTTGTGGACCA ACAGTTGGCCGGTCGGCTGCCATGGAGCACGGGGCTCCAGATGCGGTGCTGCCAGCAGCTCCGAGATGTTAGTGCCA AGTGTCGCCCCGTCGCCGTCAGCCAAGTCGCAAGACAATATGAGCAAACCGCGTTGCCGCCCAAGGGCGGATCCTTC TACCCTCGCGAGACCACGCCACTGCAGCAACTCCAACAAGGAATATTTTGGGGAACATCTTCACAAACAGTACAAGG GTACTACCCAAGCGTAACATCTTCTCAGCAGGGGTCATATTATCCAGGCCAAGCTTCTCCACAACAGCCAGGACAAG GGCAACGGCCAGGACAAGGGCAACAGCCAGGAAAATGGCAAGAACTAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTATATAACT TCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAGACAGGACAAGGGCAACAAGGATACTACCCAACTTCTCTACAGCAGCC AGGACAAGGGCAACAAATAGGACAATGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCACCCAGGACAAGGGCAAC AACCAGGACAAGGGCAACAAATACGACAAGGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAAATAGGACAAGGGCAACAGTCA GAACAAGGGCAACAATCAGGACGAGGGCAACAAGGGTACTATCCAACTTCTCCGCAGCAGCTAGGACAAGGGCAACA ACCAGGACAATGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCTGCAACAGCCAGGACAAGGTC AACAAGGGCACTACCCAGCTTCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGGTCAACAAGGGCGCTACCCAGCTTCTCAGCACCAG CCAGGACAGGGGCAACAAGGGCACTACCCAGCTTCTCTGCAGCAGTCAGGACAGGGGCAACAAGGCCACCACCCAGCTTCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAACAGGACAGCCAGGACAAAGGCAACAACCAGGACAAGGGCAAGAAA CAGGACAAGGGCAACAACCAGAACAAGAGCAACAAGGGTACTATCCAACTTCTCTGCAACAGCCAGGACAAGGGCAA CAACCAGAACAATGGCAACAACCAGGACAAAGTCAACAAGGGCACTACCCAGCTTCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGG ACAACCAGGACAAACGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAACCAGAACAAGAGCAACAACCAGGACAGGGGCAACAAG GGTACTATCCAACTTCTTCGCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACATCCAGGACAAGGGCAACAAGTGTACTACCCAACT TCCCCGCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGCACTACCCAACTTCTCCGCAGCAGCC AGGACAAGCGCAACAACCAGGACAAGGCAAACAAACAGGACAAGTGCAACAACTAGGACAAGGGCAACAAGGGTACT ACCCAACTTCTCTACAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAGTCAGGACAAGGGCAACAGTCAGGACAAGGACACCAACCA GGACAAGGGCAACAATCAGGACAAGAGCAACAAGTCTACGACAGCCCATACCATGTTAGCGTGGAGCAGCAAGCGGC CAGCCCAAAGGTGGCAAAGGCGCAGCATCCCGCGGCACAGTTGCCGGCAATGTGCCAGATGGAGGGGGGCGATGCAT TGTCGGCCAGCCAGTGATAG
權利要求
1.一種高分子量麥谷蛋白基因，其特徵是核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子； 或核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子；或核苷酸序列是能與序列表中序列1或序列 2雜交的DNA分子。
2.根據權利要求1所述的高分子量麥谷蛋白基因，其特徵在於所述能與序列表中序列1或序列2雜交的DNA分子，其對應的胺基酸序列具有高分子量麥谷蛋白特有的N端和 C端，且含有由PGQGQQ、GYYPTSPQQ或GQQ三種重複的短肽組成的中央重複區域。
3.含有權利要求1或2所述的高分子量麥谷蛋白基因的重組菌。
4.含有權利要求1或2所述的高分子量麥谷蛋白基因的1M/1B代換系。
5.權利要求1或2所述的高分子量麥谷蛋白基因或權利要求3所述的高分子量麥谷蛋白基因的重組菌在培育轉基因植物的用途。
全文摘要
本發明屬於分子生物學技術領域，涉及一種高分子量麥谷蛋白基因的DNA分子及其應用。本發明高分子量麥谷蛋白基因的DNA分子核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；或核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子；或核苷酸序列是能與序列表中序列1或序列2雜交的DNA分子。本發明的高分子量麥谷蛋白基因的DNA分子在培育轉基因植物中具有廣泛的用途。
文檔編號C12N1/19GK102559697SQ20101057711
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月7日 優先權日2010年12月7日
發明者周建平, 鄭寒, 陳靜 申請人:中國科學院成都生物研究所