柯裡拉京的提取分離方法及其應用的製作方法

2023-10-07 13:29:49

柯裡拉京的提取分離方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種柯裡拉京的提取分離方法及其應用。用無水丙酮處理龍眼果核粉末一次再用丙酮水溶液提取兩次；將適量層析聚醯胺與丙酮水溶液提取液混勻回收丙酮後上聚醯胺層析柱，依次用純水、不同濃度甲醇水溶液、甲醇洗脫，將40％～60％甲醇洗脫液分瓶收集濃縮分出柯裡拉京晶體，再將母液和其餘含柯裡拉京的洗脫液合併濃縮至幹後溶於甲醇上葡聚糖凝膠LH-20柱，甲醇洗脫，將洗脫物分瓶收集靜置，合併有柯裡拉京晶體析出的洗脫物，再靜置至析出柯裡拉京晶體無增加，分出柯裡拉京晶體將其與層析聚醯胺柱分得的柯裡拉京晶體合併，再以乙醇重結晶得高純度的柯裡拉京。本發明提取分離的柯裡拉京具有抑制酪氨酸酶的作用。
【專利說明】柯裡拉京的提取分離方法及其應用

【技術領域】：
[0001] 本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種柯裡拉京的提取分離方法及其應用。

【背景技術】：
[0002] Ran址adilok N等報導幹龍眼果核含柯裡拉京3. 7-8. 6mg/g ;Soong和Barlow利 用HPLC-ESI-MS聯用技術確定了龍眼核中含有柯裡拉京（corilagin)、沒食子酸（gallic acid)、稼花酸（ellagic acid)等13種酷類物質。
[0003] 柯裡拉京（Corilagin)是一種沒食子醜六輕基聯苯化喃型葡萄糖巧化合物，屬 於可水解丹寧，能溶於水、甲醇、己醇、丙麗等大極性溶劑，毒性小。早在1952年Schmi化， O.T.和Lademann，R.就發現了它是自由基強力清除劑，對許多也血管疾病包括高血壓、動 脈粥樣硬化、中風、充血性也衰、和缺血性也疾病有著很好的作用；對抗腫瘤、抗病毒同樣有 很好的作用；它還是治療己型肝炎的葉下珠肝片的主要成分之一。
[0004] 對於龍眼果核多酷的提取條件有文獻報導。如；丙麗濃度50% (v/v)，料液比1 ; 140 (g/血)，浸提溫度5(TC，浸提時間2h，超聲20min，浸提立次，龍眼核多酷得率為62. Img/ g(PB法）（王志遠，龍眼殼與龍眼核多分的分離純化結構鑑定及抗氧化活性巧].廈口：廈 口大學，2007.)。提取時間106min，己醇體積分數為58%，提取溫度64°C，料液比為1 : 9， 在此條件下，多酷得率為42. 690mg/g(福林酷法）（吳蘭蘭等。響應面法優化龍眼核多酷提 取工藝的研究[J].集美大學學報（自然科學版），15巧）；22-26)。
[0005] 大連美侖生物技術有限公司網站銷售信息顯示；20mg柯裡拉京標準品（HPLC分析 純度> 98% )售價960元。
[0006] 龍眼主要分布和栽培在福建、廣東和廣西，果肉服厚多汁、營養豐富，有很高的營 養價值和食療價值，自古就有"強魄聰明、輕身不老、通神明"的說法，現代藥理也已證明龍 眼肉提取液有抗衰老、抗癌和免疫調節與促進智力發育等功效，被人們推崇為"果中聖品"。 我國是龍眼的原產國和生產國，種植面積和產量分別佔世界的70%和50% W上，是最大的 龍眼生產國。近10年來，總產量大幅度增長，由1997年的36. 53萬噸增加到2006年的 110. 65萬噸，增幅達202. 90%，其中2006年廣東47. 56萬噸，廣西38. 57萬噸，福建21. 28 萬噸。但由於水果上市比較集中，膽運條件有限及儲藏保鮮技術不足，鮮果消費受到限制， 大量的鮮果用於加工如桂圓肉、龍眼酒、龍眼糖水罐頭等，所產生的果核未加W利用，造成 巨大浪費。


【發明內容】
：
[0007] 本發明的第一個目的是提供一種柯裡拉京的提取分離方法。
[0008] 本發明的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，包括W下步驟：
[0009] (1)、柯裡拉京的提取：先將龍眼果核粉末按照一定的質量體積比加入無水丙麗， 室溫攬拌進行預處理，靜置析出上層液，棄該上層液；再將龍眼果核粉末按照一定的質量 體積比第二次加入丙麗水溶液，控制溫度進行攬拌，靜置析出上層液並過濾，得到第二次濾 液；最後將龍眼果核粉末按照一定的質量體積比第H次加入丙麗水溶液，操作同第二次，得 到第H次濾液；合併第二、H次濾液，得到提取液，該提取液用於下一步分離；
[0010] (2)、提取液分離製備柯裡拉京；取經預處理的層析聚醜胺上層析柱，再取經預 處理的層析聚醜胺於步驟（1)所得的提取液中混勻，得到混合物，回收丙麗並蒸發水分至 混合物成粘稠狀，之後將混合物加至聚醜胺層析柱，依次用純水、5%?15%甲醇、25%? 35%甲醇、40%?60%甲醇、無水甲醇進行洗脫，將40 %?60%甲醇洗脫液分瓶收集濃縮 並檢驗柯裡拉京洗脫情況（因為在此梯度洗脫體系中，柯裡拉京不會被體積分數小於35% 的甲醇水溶液洗出，而且用體積分數40%?60%甲醇能完全洗出，因此只需對此部分進行 後續處理），將該分瓶收集濃縮的洗脫物中柯裡拉京固體含量大於等於60%的洗脫物合併 濃縮後有柯裡拉京晶體析出，濾出晶體後將母液和其他經檢測含柯裡拉京的洗脫物合併濃 縮至幹，再溶於無水甲醇後上葡聚糖凝膠柱，用無水甲醇進行洗脫，將洗脫物分瓶收集，靜 置，合併有柯裡拉京晶體析出的洗脫物，再靜置至析出柯裡拉京晶體無增加，分出柯裡拉京 晶體，將其與層析聚醜胺柱40%?60%甲醇洗脫分得的柯裡拉京晶體合併，再W無水己醇 重結晶，最終得到高純度的柯裡拉京。
[0011] 所述的龍眼果核粉末，其製備方法為：在龍眼果場收集龍眼加工丟棄的果核，自然 曬乾，粉碎過20目篩得龍眼果核粉末。
[0012] 優選，步驟（1)中先將龍眼果核粉末按照質量體積比為1 ;15加入無水丙麗。
[0013] 優選，步驟（1)中再將龍眼果核粉末按照質量體積比為1 ;15第二次加入80%丙 麗水溶液，控制溫度為55C進行攬拌化，靜置析出上層液並0. 04?0. 05MPa真空過濾。
[0014] 優選，步驟（1)中最後將龍眼果核粉末按照質量體積比為1 ;15第H次加入60% 丙麗水溶液。
[0015] 步驟（2)中所述的取經預處理的層析聚醜胺上層析柱，所取的經預處理的層析聚 醜胺與步驟（1)中被提取的龍眼果核粉末的質量比（w/w)優選為0.8:1 ;所述的再取經預 處理的層析聚醜胺於步驟（1)所得的提取液中混勻，所再取的取經預處理的層析聚醜胺與 步驟（1)中被提取的龍眼果核粉末的質量比（w/w)優選為0.2:1 ;所述的預處理，具體方法 為：取聚醜胺W 90?95% (V)己醇浸泡，不斷攬拌，除去氣泡後裝入柱中，用3?4BV的 90?95% (V)己醇洗脫，洗至洗脫液透明並在蒸乾後無殘渣（或極少殘渣），再依次用2? 2. 5BV 5% (W)化0H水溶液、1BV的蒸觸水、2?2. 5BV的10% (W)醋酸水溶液洗脫，最後用 蒸觸水洗脫至中性。
[0016] 步驟（2)中所述的回收丙麗，優選為常壓旋轉蒸發回收丙麗，所述的蒸發水分，優 選為減壓旋轉蒸發水分。
[0017] 優選，步驟（2)中依次用純水3BV、5%?15%甲醇48￥、25%?35%甲醇48￥、 40%?60%甲醇48￥、無水甲醇88￥進行洗脫，洗脫流速為0.58￥/11。
[0018] 步驟（2)中所述的將40%?60%甲醇洗脫液分瓶收集濃縮，優選為將40%? 60%甲醇洗脫液按1/9BV分瓶收集濃縮。
[0019] 優選，步驟（2)中濾出晶體後將母液和其他經檢測含柯裡拉京的洗脫物合併濃縮 至幹，再W質量體積比（g/ml)為1:5溶於無水甲醇後上葡聚糖凝膠柱，所述的葡聚糖凝膠 柱為葡聚糖凝膠LH-20柱，上樣量與葡聚糖凝膠LH-20的質量體積比（g/ml)為1:100,用 4BV無水甲醇進行洗脫，洗脫流速為Iml/min，將洗脫液分瓶收集，優選為按1/5BV分瓶收 集。
[0020] 本發明的柯裡拉京的提取分離方法，採用步驟（1)中的方法在龍眼果核中提取柯 裡拉京的得率是7. Img/g乾果核。本發明採用RP-HPLC法測定從龍眼果核中提取柯裡拉京 的得率和跟蹤提取物分離製備柯裡拉京的情況，並評價柯裡拉京抑制酪氨酸酶的作用。
[0021] W 1. Ommol/L的kDOPA為底物，先將1. 0血3mol/L kDOPA溶液（溶液為抑= 6. 8的磯酸鹽緩衝溶液）置於比色杯中，加入0. 85血抑=6. 8的磯酸鹽緩衝溶液，在3(TC 恆溫水浴中恆溫lOmin，加入1. 0血柯裡拉京溶液（溶液為抑=6. 8的磯酸鹽緩衝溶液中） 和0. 15mL 0. 15g/L酪氨酸酶水溶液，測定0〇475。此測活體系中，酶的終質量濃度為7. 5mg/ L。對酶的相對抑制率（I)可W定義為式：
[0022] / = (i-S^)xi〇〇%
[0023] 式中；ODi是指含有底物、酪氨酸酶、柯裡拉京的測活體系的吸光度值；0化是指含 有底物、酪氨酸酶，但不含柯裡拉京的測活體系的吸光度值；〇〇3是指含有底物、柯裡拉京， 但不含酪氨酸酶的測活體系的吸光度值；〇〇4是指含有底物，但不含酪氨酸酶、柯裡拉京的 測活體系的吸光度值。
[0024] 結果是0. 5mg/mU〇. 79mmol/L)柯裡拉京對酪氨酸酶的抑制率是51. 38%。而化妝 品美白添加劑熊果巧的酪氨酸酶的ICw值是5. 3mmol/L。
[0025] 因此，本發明的第二個目的是提供柯裡拉京在抑制酪氨酸酶方面的應用，該應用 可用於製備美白化妝品。
[0026] 本發明的技術效果；採用丙麗水溶液提取，提取效果好，柯裡拉京的得率在6mg/g 乾果核W上，溶劑易於回收，採用無水丙麗預處理龍眼果核粉末不但可W獲得精油（另作 處理）而且還能減少提取液中的油溶性組分因此可簡化處理步驟，提取物不需用常規方法 處理即W不同極性溶劑分別萃取而直接上聚醜胺層析柱，一次柱層析就能得到高純柯裡拉 京，柯裡拉京晶體的純度達到98% W上，操作簡單，同時為柯裡拉京提供了一個新的應用， 也為龍眼果核的開發應用提供了一條有效途徑。通過本發明的方法提取分離得到的柯裡拉 京對酪氨酸酶有明顯的抑制作用，可用於製備美白化妝品。

【具體實施方式】：
[0027] W下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。其他沒有詳細說 明的技術步驟均為本領域人員所熟知的方法。
[0028] 實施例1 :
[0029] (1)、柯裡拉京的提取；先在龍眼果場收集龍眼加工丟棄的果核，自然曬乾，粉碎過 20目篩得龍眼果核粉末，取龍眼果核粉末lOOg於2000血H 口燒瓶中，再加入1500血無水 丙麗，安裝帶密封的攬拌裝置，其餘兩口塞緊，室溫攬拌進行預處理比，靜置比，析出上層 液（基本澄清），棄該上層液；第二次加入1500mL 80%丙麗水溶液，並安裝溫度計和回流裝 置，置於水浴鍋加熱並控制溶液溫度為55C，攬拌化，之後靜置比，析出上層液並0. 04? 0. 05M化真空過濾，得到第二次濾液；第H次加入1500血60%丙麗水溶液，操作同第二次， 得到第H次濾液；合併第二、H次濾液，得到提取液，該提取液用於下一步分離；
[0030] (2)、提取液分離製備柯裡拉京；按規定的方法預處理層析聚醜胺巧0-100目），具 體方法為：取聚醜胺W90?95% (V)己醇浸泡，不斷攬拌，除去氣泡後裝入柱中，用3? 4BV的90?95% (V)己醇洗脫，洗至洗脫液透明並在蒸乾後無殘渣（或極少殘渣），再 依次用2?2. 5BV5% (W)化OH水溶液、1BV的蒸觸水、2?2. 5BV的10% (W)醋酸水溶液 洗脫，最後用蒸觸水洗脫至中性。取經預處理的層析聚醜胺80g溼法裝柱，層析柱規格為 〇30X300mm，再取經預處理的層析聚醜胺20g於步驟（1)所得的提取液中混勻，得到混合 物，再常壓旋轉蒸發回收丙麗接著減壓旋轉蒸發水分至混合物成粘稠狀，之後將混合物加 至聚醜胺層析柱，次用純水3BV、10%甲醇4BV、30%甲醇4BV、50%甲醇4BV、無水甲醇8BV 進行洗脫，洗脫流速為0. 5BV/h，將50 %甲醇洗脫液按1/9BV分瓶收集濃縮並分別W薄層 聚醜胺板（W氯仿；甲醇；水=15 ;3 ;1為展開劑，柯裡拉京的Rf值是0. 23)輔W RP-HPLC 法（色譜條件；Ine;rtsil ODS-3Ci8反相色譜柱（4. 6mmX250mm，5]im，日本島津），流動相： 己膳-體積分數〇.1%磯酸水溶液，梯度洗脫程序為〇?1〇1111115%?11%，10?35111山 11%?13%，35?4511111113%?16%，流速；1.011117111111，檢測波長 280皿，柱溫301：，流速 l.OmL/min，柯裡拉京保留時間為32. 17min)檢驗洗脫物中柯裡拉京含量情況，將該分瓶收 集濃縮的洗脫物中柯裡拉京固體含量> 60%的洗脫物合併濃縮後有柯裡拉京晶體析出，濾 出晶體後將母液和其他經檢測含有柯裡拉京的洗脫物合併濃縮至幹，得到118. 4mg物質， 再溶於ImL無水甲醇後上葡聚糖凝膠LH-20柱，葡聚糖凝膠LH-20柱規格為〇 10 X 200mm， 用無水甲醇進行洗脫，洗脫流速為ImL/min，將洗脫物每2mL分瓶收集一個流份，靜置1天， 第44?49流份有柯裡拉京晶體析出，合併有柯裡拉京晶體析出的洗脫物，再靜置至析出柯 裡拉京晶體無增加，分出柯裡拉京晶體，將其與層析聚醜胺柱50%甲醇洗脫分得的柯裡拉 京晶體合併，再W無水己醇重結晶得83. 6mg柯裡拉京晶體。
[0031] 經本實施例步驟（1)中的方法提取的柯裡拉京的得率是7. Img/g乾果核，再通過 步驟（2)的分離純化後，經RP-HPLC法分析所得到的柯裡拉京晶體的純度為98. 32%。
[0032] W 1. Ommol/L的kDOPA為底物，先將1. 0血3mol/L kDOPA溶液（溶液為抑= 6. 8的磯酸鹽緩衝溶液）置於比色杯中，加入0. 85血抑=6. 8的磯酸鹽緩衝溶液，在3(TC 恆溫水浴中恆溫lOmin，加入1. 0血柯裡拉京溶液（溶液為抑=6. 8的磯酸鹽緩衝溶液中） 和0. 15mL 0. 15g/L酪氨酸酶水溶液，測定0〇475。此測活體系中，酶的終質量濃度為7. 5mg/ L。對酶的相對抑制率（I)可W定義為式：
[0033] / = (1-造5競)> 100%
[0034] 式中；ODi是指含有底物、酪氨酸酶、柯裡拉京的測活體系的吸光度值；0化是指含 有底物、酪氨酸酶，但不含柯裡拉京的測活體系的吸光度值；〇〇3是指含有底物、柯裡拉京， 但不含酪氨酸酶的測活體系的吸光度值；〇〇4是指含有底物，但不含酪氨酸酶、柯裡拉京的 測活體系的吸光度值。
[00巧]結果是0. 5mg/mU〇. 79mmol/L)柯裡拉京對酪氨酸酶的抑制率是51. 38%。
[003引 實施例2 :
[0037] (1)、柯裡拉京的提取；先在龍眼果場收集龍眼加工丟棄的果核，自然曬乾，粉碎過 20目篩得龍眼果核粉末，取龍眼果核粉末lOOg於2000血H 口燒瓶中，再加入1500血無水 丙麗，安裝帶密封的攬拌裝置，其餘兩口塞緊，室溫攬拌進行預處理比，靜置比，析出上層 液（基本澄清），棄該上層液；第二次加入1500mL 80%丙麗水溶液，並安裝溫度計和回流裝 置，置於水浴鍋加熱並控制溶液溫度為55°C，攬拌化，之後靜置比，析出上層液並0. 04? 0. 05MPa真空過濾，得到第二次濾液；第H次加入1500血60%丙麗水溶液，操作同第二次， 得到第H次濾液；合併第二、H次濾液，得到提取液，該提取液用於下一步分離；
[0038] (2)、提取液分離製備柯裡拉京；按規定的方法預處理層析聚醜胺巧0-100目），具 體方法為：取聚醜胺W90?95% (V)己醇浸泡，不斷攬拌，除去氣泡後裝入柱中，用3? 4BV的90?95% (V)己醇洗脫，洗至洗脫液透明並在蒸乾後無殘渣（或極少殘渣），再 依次用2?2. 5BV5% (W)化0H水溶液、1BV的蒸觸水、2?2. 5BV的10% (W)醋酸水溶液 洗脫，最後用蒸觸水洗脫至中性。取經預處理的層析聚醜胺80g溼法裝柱，層析柱規格為 〇30X300mm，再取經預處理的層析聚醜胺20g於步驟（1)所得的提取液中混勻，得到混合 物，再常壓旋轉蒸發回收丙麗接著減壓旋轉蒸發水分至混合物成粘稠狀，之後將混合物加 至聚醜胺層析柱，次用純水3BV、5%甲醇4BV、25%甲醇4BV、40%甲醇4BV、無水甲醇8BV 進行洗脫，洗脫流速為0. 5BV/h，將40 %甲醇洗脫液按1/9BV分瓶收集濃縮並分別W薄層 聚醜胺板（W氯仿；甲醇；水=15 ;3 ;1為展開劑，柯裡拉京的Rf值是0. 23)輔W RP-HPLC 法（色譜條件；Inedsil 0DS-3Ci8反相色譜柱（4. 6mmX250mm，5]im，日本島津），流動相： 己膳-體積分數〇.1%磯酸水溶液，梯度洗脫程序為〇?1〇1111115%?11%，10?35111山 11%?13%，35?4511111113%?16%，流速；1.011117111111，檢測波長 280皿，柱溫301：，流速 l.OmL/min，柯裡拉京保留時間為32. 17min)檢驗洗脫物中柯裡拉京含量情況，將該分瓶收 集濃縮的洗脫物中柯裡拉京固體含量> 60%的洗脫物合併濃縮後有柯裡拉京晶體析出，濾 出晶體後將母液和其他經檢測含有柯裡拉京的洗脫物合併濃縮至幹，得到113. 8mg物質， 再溶於ImL無水甲醇後上葡聚糖凝膠LH-20柱，葡聚糖凝膠LH-20柱規格為〇10X200mm， 用無水甲醇進行洗脫，洗脫流速為ImL/min，將洗脫物每2mL分瓶收集一個流份，靜置1天， 第44?49流份有柯裡拉京晶體析出，合併有柯裡拉京晶體析出的洗脫物，再靜置至析出柯 裡拉京晶體無增加，分出柯裡拉京晶體，將其與層析聚醜胺柱50%甲醇洗脫分得的柯裡拉 京晶體合併，再W無水己醇重結晶得80. 3mg柯裡拉京晶體。
[0039] 經本實施例步驟（1)中的方法提取的柯裡拉京的得率是6.8mg/g乾果核，再通過 步驟（2)的分離純化後，經RP-HPLC法分析所得到的柯裡拉京晶體的純度為98. 20%。
[0040] W 1. Ommol/L的kDOPA為底物，先將1. 0血3mol/L kDOPA溶液（溶液為抑= 6. 8的磯酸鹽緩衝溶液）置於比色杯中，加入0. 85血抑=6. 8的磯酸鹽緩衝溶液，在3(TC 恆溫水浴中恆溫lOmin，加入1. 0血柯裡拉京溶液（溶液為抑=6. 8的磯酸鹽緩衝溶液中） 和0. 15mL 0. 15g/L酪氨酸酶水溶液，測定0〇475。此測活體系中，酶的終質量濃度為7. 5mg/ L。對酶的相對抑制率（I)可W定義為式：
[0041] / = (1-鮮S)xi〇〇〇'/。
[0042] 式中；ODi是指含有底物、酪氨酸酶、柯裡拉京的測活體系的吸光度值；0化是指含 有底物、酪氨酸酶，但不含柯裡拉京的測活體系的吸光度值；〇〇3是指含有底物、柯裡拉京， 但不含酪氨酸酶的測活體系的吸光度值；〇〇4是指含有底物，但不含酪氨酸酶、柯裡拉京的 測活體系的吸光度值。
[0043] 結果是0. 5mg/mU〇. 79mmol/L)柯裡拉京對酪氨酸酶的抑制率是51. 21%。
[0044] 實施例3 :
[0045] (1)、柯裡拉京的提取；先在龍眼果場收集龍眼加工丟棄的果核，自然曬乾，粉碎過 20目篩得龍眼果核粉末，取龍眼果核粉末lOOg於2000血H 口燒瓶中，再加入1500血無水 丙麗，安裝帶密封的攬拌裝置，其餘兩口塞緊，室溫攬拌進行預處理比，靜置比，析出上層 液（基本澄清），棄該上層液；第二次加入1500mL 80%丙麗水溶液，並安裝溫度計和回流裝 置，置於水浴鍋加熱並控制溶液溫度為55C，攬拌化，之後靜置比，析出上層液並0. 04? 0. 05MPa真空過濾，得到第二次濾液；第H次加入1500血60%丙麗水溶液，操作同第二次， 得到第H次濾液；合併第二、H次濾液，得到提取液，該提取液用於下一步分離；
[0046] (2)、提取液分離製備柯裡拉京；按規定的方法預處理層析聚醜胺巧0-100目），具 體方法為：取聚醜胺W90?95% (V)己醇浸泡，不斷攬拌，除去氣泡後裝入柱中，用3? 4BV的90?95% (V)己醇洗脫，洗至洗脫液透明並在蒸乾後無殘渣（或極少殘渣），再 依次用2?2. 5BV5% (W)化0H水溶液、1BV的蒸觸水、2?2. 5BV的10% (W)醋酸水溶液 洗脫，最後用蒸觸水洗脫至中性。取經預處理的層析聚醜胺80g溼法裝柱，層析柱規格為 〇30X300mm，再取經預處理的層析聚醜胺20g於步驟（1)所得的提取液中混勻，得到混合 物，再常壓旋轉蒸發回收丙麗接著減壓旋轉蒸發水分至混合物成粘稠狀，之後將混合物加 至聚醜胺層析柱，次用純水3BV、15%甲醇4BV、35%甲醇4BV、60%甲醇4BV、無水甲醇8BV 進行洗脫，洗脫流速為0. 5BV/h，將60%甲醇洗脫液按1/9BV分瓶收集濃縮並分別W薄層 聚醜胺板（W氯仿；甲醇；水=15 ;3 ;1為展開劑，柯裡拉京的Rf值是0. 23)輔W RP-HPLC 法（色譜條件；Ine;rtsil 0DS-3Ci8反相色譜柱（4. 6mmX250mm，5]im，日本島津），流動相： 己膳-體積分數0. 1%磯酸水溶液，梯度洗脫程序為0?lOmin 5%?11%，10?35min 11%?13%，35?4511111113%?16%，流速；1.011117111111，檢測波長 280皿，柱溫301：，流速 1. OmL/min，柯裡拉京保留時間為32. 17min)檢驗洗脫物中柯裡拉京含量情況，將該分瓶收 集濃縮的洗脫物中柯裡拉京固體含量> 60%的洗脫物合併濃縮後有柯裡拉京晶體析出，濾 出晶體後將母液和其他經檢測含有柯裡拉京的洗脫物合併濃縮至幹，得到115. 2mg物質， 再溶於ImL無水甲醇後上葡聚糖凝膠LH-20柱，葡聚糖凝膠LH-20柱規格為〇10X200mm， 用無水甲醇進行洗脫，洗脫流速為ImL/min，將洗脫物每2mL分瓶收集一個流份，靜置1天， 第44?49流份有柯裡拉京晶體析出，合併有柯裡拉京晶體析出的洗脫物，再靜置至析出柯 裡拉京晶體無增加，分出柯裡拉京晶體，將其與層析聚醜胺柱50%甲醇洗脫分得的柯裡拉 京晶體合併，再W無水己醇重結晶得81. 4mg柯裡拉京晶體。
[0047] 經本實施例步驟（1)中的方法提取的柯裡拉京的得率是6.9mg/g乾果核，再通過 步驟（2)的分離純化後，經RP-HPLC法分析所得到的柯裡拉京晶體的純度為98. 26%。
[0048] W 1. Ommol/L的kDOPA為底物，先將1. 0血3mol/L kDOPA溶液（溶液為抑= 6. 8的磯酸鹽緩衝溶液）置於比色杯中，加入0. 85血抑=6. 8的磯酸鹽緩衝溶液，在3(TC 恆溫水浴中恆溫lOmin，加入1. 0血柯裡拉京溶液（溶液為抑=6. 8的磯酸鹽緩衝溶液中） 和0. 15mL 0. 15g/L酪氨酸酶水溶液，測定0〇475。此測活體系中，酶的終質量濃度為7. 5mg/ L。對酶的相對抑制率（I)可W定義為式：
[004引 / = 哉)xioo%
[0050] 式中；ODi是指含有底物、酪氨酸酶、柯裡拉京的測活體系的吸光度值；0化是指含 有底物、酪氨酸酶，但不含柯裡拉京的測活體系的吸光度值；〇〇3是指含有底物、柯裡拉京， 但不含酪氨酸酶的測活體系的吸光度值；〇〇4是指含有底物，但不含酪氨酸酶、柯裡拉京的 測活體系的吸光度值。
[0051] 結果是0. 5mg/mU〇. 79mmol/L)柯裡拉京對酪氨酸酶的抑制率是51. 29%。
【權利要求】
1. 一種柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 、柯裡拉京的提取：先將龍眼果核粉末按照一定的質量體積比加入無水丙酮，室溫 攪拌進行預處理，靜置析出上層液，棄該上層液；再將龍眼果核粉末按照一定的質量體積比 第二次加入丙酮水溶液，控制溫度進行攪拌，靜置析出上層液並過濾，得到第二次濾液；最 後將龍眼果核粉末按照一定的質量體積比第三次加入丙酮水溶液，操作同第二次，得到第 三次濾液；合併第二、三次濾液，得到提取液，該提取液用於下一步分離； (2) 、提取液分離製備柯裡拉京：取經預處理的層析聚醯胺上層析柱，再取經預處理的 層析聚醯胺於步驟（1)所得的提取液中混勻，得到混合物，回收丙酮並蒸發水分至混合物 成粘稠狀，之後將混合物加至聚醯胺層析柱，依次用純水、5%?15%甲醇、25%?35%甲 醇、40%?60%甲醇、無水甲醇進行洗脫，將40%?60%甲醇洗脫液分瓶收集濃縮並檢驗 柯裡拉京洗脫情況，將該分瓶收集濃縮的洗脫物中柯裡拉京固體含量>60%的洗脫物合併 濃縮後有柯裡拉京晶體析出，濾出晶體後將母液和其他經檢測含有柯裡拉京的洗脫物合併 濃縮至幹，再溶於無水甲醇後上葡聚糖凝膠柱，用無水甲醇進行洗脫，將洗脫物分瓶收集， 靜置，合併有柯裡拉京晶體析出的洗脫物，再靜置至析出柯裡拉京晶體無增加，分出柯裡拉 京晶體，將其與層析聚醯胺柱40%?60%甲醇洗脫分得的柯裡拉京晶體合併，再以無水乙 醇重結晶，最終得到高純度的柯裡拉京。
2. -種權利要求1所述的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，步驟（1)中先將龍眼 果核粉末按照質量體積比為1 :15加入無水丙酮。
3. -種權利要求1所述的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，步驟（1)中再將龍眼 果核粉末按照質量體積比為1 :15第二次加入80%丙酮水溶液，控制溫度為55°C進行攪拌 2h，靜置析出上層液並0. 04?0. 05MPa真空過濾。
4. 一種權利要求1所述的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，步驟（1)中最後將龍 眼果核粉末按照質量體積比為1 :15第三次加入60%丙酮水溶液。
5. -種權利要求1所述的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，步驟（2)中所述的取 經預處理的層析聚醯胺上層析柱，所取的經預處理的層析聚醯胺與步驟（1)中被提取的龍 眼果核粉末的質量比為0.8:1 ;所述的再取經預處理的層析聚醯胺於步驟（1)所得的提取 液中混勻，所再取的取經預處理的層析聚醯胺與步驟（1)中被提取的龍眼果核粉末的質量 比為0. 2:1 ;所述的預處理，具體方法為：取聚醯胺以體積分數為90?95%的乙醇浸泡，不 斷攪拌，除去氣泡後裝入柱中，用3?4BV的體積分數為90?95 %的乙醇洗脫，洗至洗脫液 透明並在蒸乾後無殘渣或極少殘渣，再依次用2?2. 5BV質量分數5 %的NaOH水溶液、1BV 的蒸餾水、2?2. 5BV的質量分數為10%的醋酸水溶液洗脫，最後用蒸餾水洗脫至中性。
6. -種權利要求1所述的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，步驟（2)中所述的回 收丙酮為常壓旋轉蒸發回收丙酮，所述的蒸發水分為減壓旋轉蒸發水分。
7. -種權利要求1所述的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，步驟（2)中依次用純 水3BV、5 %?15 %甲醇4BV、25 %?35 %甲醇4BV、40 %?60 %甲醇4BV、無水甲醇8BV進行 洗脫，洗脫流速為〇. 5BV/h。
8. -種權利要求1所述的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，步驟（2)中所述的 將40 %?60%甲醇洗脫液分瓶收集濃縮，為將40 %?60%甲醇洗脫液按1/9BV分瓶收集 濃縮。
9. 一種權利要求1所述的柯裡拉京的提取分離方法，其特徵在於，步驟（2)中濾出晶體 後將母液和其他分瓶收集濃縮的洗脫物合併濃縮至幹，再以質量體積比為1:5溶於無水甲 醇後上葡聚糖凝膠柱，所述的葡聚糖凝膠柱為葡聚糖凝膠LH-20柱，上樣量與葡聚糖凝膠 LH-20的質量體積比為1:100,用4BV無水甲醇進行洗脫，洗脫流速為lml/min，將洗脫液分 瓶收集，為將洗脫液按1/5BV分瓶收集。
10. 通過權利要求1的方法提取分離的柯裡拉京在抑制酪氨酸酶方面的應用。
【文檔編號】A61K8/60GK104447896SQ201410637490
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月12日 優先權日:2014年11月12日
【發明者】鄭公銘, 李忠軍, 劉綱勇, 鄒穎楠, 王永麗, 傅中, 張顯策, 王如意, 黃海潮, 付曉春 申請人:廣東食品藥品職業學院