以Bt蛋白Bt886-cry3Aa為基礎的融合蛋白及其用途的製作方法

2023-10-07 10:55:34 2

專利名稱：以Bt蛋白Bt886-cry3Aa為基礎的融合蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是一種以Bt蛋白B^86-Cry3Aa為基礎的融合蛋白及其用途。
背景技術：
蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽性細菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也稱δ-內毒素(delta-endotoxin)，它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切關係 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775-806.]。自 1981 年 khn印f 等克隆了 Bt 的第一個 ICPs 基因，並於1985年發表了它的DNA鹼基序列及其編碼蛋白的胺基酸序列，截止目前為止已發現和克隆了四五百種ICPs基因。蘇雲金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、高效等優點而被廣泛的應用於蟲害防治。1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲準應用，它使用的基因來自Bt cryIAc。在接下來的幾年裡，轉cryIAb基因的抗蟲玉米，轉cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有crylAc/cryIA基因的抗蟲棉以來，已經被普遍種植。在轉基因作物商業化的第一個12年(1996-2007)中，由於能得到持續穩定的收益， 農民種植轉基因作物量逐年增加，給工業化國家和發展中國家的農民都帶來了經濟和環境效益。蘇雲金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白在植物保護領域的應用潛力巨大，有待人們去大力開發。Bt886-cry3Aa是目前分離出的已知對對鞘翅目害蟲有特異毒殺作用的蘇雲金芽孢桿菌分泌的毒力晶體蛋白，該毒力蛋白對桑天牛有特異毒力。桑天牛，屬鞘翅目天牛科溝脛天牛亞科。其寄主包括桑、構、^^、白楊、歐美楊、柳、榆、蘋果、沙果、櫻桃、梨、野海棠、柞、褚、刺槐、樹豆、楓楊、批把、油桐、花紅、柑桔等。 其成蟲食害寄主嫩枝皮和葉；幼蟲於枝幹的皮下和木質部內，向下蛀食，隧道內無糞屑，隔一定距離向外蛀1通氣排糞屑孔，排出大量糞屑，削弱樹勢，重者枯死。Bt蛋白或基因的應用將是防治天牛為害林木的有效突破口。篩選分離克隆新的、 高毒力的Bt基因，提高現有Bt蛋白的毒力及殺蟲活性，可以豐富殺蟲基因資源，為轉基因植物與工程菌株提供新的基因來源，可以降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風險，避免新的生態災難降臨，具有重要的經濟、社會和生態效益。

發明內容
本發明根據上述領域的需求，提供一種人工融合的Bt蛋白，本發明的實驗數表明該融合蛋白比野生Bt蛋白能夠在害蟲體內滯留更長時間，從而具有更高的殺蟲活性。以Bt蛋白Bt886_cry3Aa為基礎的融合蛋白，其特徵在於所述Bt886_cry3Aa蛋白的肽鏈的至少一端融合了胺基酸序列如ID No. 1的短肽Pl ；或者所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽鏈的氨基端融合了胺基酸序列如kq ID No. 1 的短肽Pl且羧基端融合了胺基酸序列如^^ ID No. 2所示的短肽P2。所述融合蛋白的胺基酸序列是^^ ID No. 3所示的胺基酸序列；或者kq ID No. 3 所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個胺基酸且具有同等蛋白活性的胺基酸序列。所述融合蛋白的胺基酸序列是^^ ID No. 4所示的胺基酸序列；或者kq ID No. 4 所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個胺基酸且具有同等蛋白活性的胺基酸序列。所述融合蛋白的胺基酸序列是^^ ID No. 5所示的胺基酸序列；或者kq ID No. 5 所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個胺基酸且具有同等蛋白活性的胺基酸序列。編碼上述任一融合蛋白的基因。所述基因的核苷酸序列如kq ID No. 6、7或8所示。含有上述基因的重組表達載體。由所述重組表達載體轉化而得的宿主細胞。含有上述融合蛋白的殺蟲劑。所述基因或重組表達載體在製備轉基因植物中的應用。所述基因或重組表達載體在提高植物抗蟲性中的應用。所述融合蛋白的製備方法，其特徵在於將權利要求7所述的重組表達載體轉入到宿主細胞中，誘導宿主細胞表達融合蛋白，分離融合蛋白。 本發明在前人已分離出的對鞘翅目有特異毒殺作用的Bt886-Cry3Aa基因以及篩選獲得的天牛腸道內切葡聚糖酶特異結合活性短肽Pi、P2的基礎上，將編碼Pp P2短肽的DNA序列與Bt886-cry3Aa基因通過PCR擴增進行基因重組獲得多種連接方式Cry3Aa融合蛋白的基因，並將Cry3Aa融合蛋白和Cry3Aa蛋白的基因分別構建到原核表達載體中得到融合蛋白的表達載體pET-30b(+)-Cry3Aa，pET-30b (+)-Pl-cry3Aa, pET-30b ( + )-P2-cry3Aa, pET_30b ( + )_cry3Aa_Pl，pET_30b ( + )_cry3Aa_P2， pET-30b (+) -Pl-cry3Aa-P2, pET_30b (+) -P2-cry3Aa_Pl。將這些表達載體轉化到大腸桿菌中進行高效表達，獲得親合短肽與殺蟲晶體蛋白的融合蛋毒白。本發明以桑天牛幼蟲為試蟲，進行融合肽生物活性的分析測定，計算Cry3Aa融合蛋白和Cry3Aa蛋白的致死率和生長抑制率，比較了 Cry3Aa融合蛋白與野生型Cry3Aa毒蛋白的毒性差異，將Cry3Aa融合蛋白與Cry3Aa毒蛋白飼餵桑天牛幼蟲，比較Cry3Aa蛋白與融合Cry3Aa毒蛋白在昆蟲消化道中的殘留量和排洩物中的含量，分析毒蛋白在昆蟲消化道內的滯留時間的差異，這些實驗證明本發明獲得的其中三種融合蛋白(Pl_cry3Aa，cry3Aa-Pl和Pl-cry3Aa-P2)較野生型 Cry3Aa蛋白具有更高的殺蟲活性，能在害蟲體內滯留更長時間，如表1及圖5所示。
本領域技術人員可以根據本發明公開的融合蛋白的胺基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代，缺失和/或增加一個或幾個胺基酸得到與所述融合蛋白相同功能和活性的突變蛋白，應當理解為也在本發明的保護範圍內。編碼本發明的融合蛋白的基因，除本發明提供mkq ID No. 6、7、8所示的核苷酸外，由於密碼子的簡併性以及不同物種對密碼子的偏好性，本領域技術人員可以調整出多種編碼本發明的融合蛋白的基因序列。也都在本發明的保護範圍內。將編碼上述融合蛋白的基因作為外源基因克隆到適合不同宿主的骨架載體中得到多種重組表達載體，如本發明得到的pET-30b (+)-cry3Aa、pET_30b (+)-Pl-cry3Aa、 pET-30b ( + )-P2-cry3Aa、pET_30b ( + )_cry3Aa_Pl、pET_30b ( + )_cry3Aa_P2、 pET-30b (+) -Pl-cry3Aa-P2、pET_30b (+) -P2-cry3Aa_Pl，然後將重組表達載體轉入宿主細胞中，如本發明採用的大腸桿菌BL21(DE3)感受態中，誘導表達出本發明所要求保護的融合蛋白ο這類重組表達載體，以及轉化有該重組表達載體的宿主細胞也在本發明要求保護的範圍內。這些表達載體用於製備具有抗蟲性的轉基因植物的用途也在本發明的保護範圍內，這種用途能夠降低殺蟲劑的使用量，減少環境汙染，具有重要的應用價值。可以通過發酵轉入融合蛋白基因的菌株，獲得含有融合蛋白的發酵液，將其製備成殺蟲劑。本領域技術人員，可以通過將轉入上述重組表達載體的細菌或真菌進行大規模發酵得到本發明的融合蛋白。


圖1. SDS-PAGE 凝膠檢測M =Western Blot蛋白質分子量標準；1 未用IPTG誘導的cry3Aa ；2 加IPTG誘導的 cry3Aa 3 未用 IPTG 誘導的 Pl_cry3Aa ；4 加 IPTG 誘導的 Pl_cry3Aa ；5 未用 IPTG 誘導的 P2-cry3Aa ；6 加 IPTG 誘導的 P2_cry3Aa ；7 未用 IPTG 誘導的 cry3Aa_Pl ；8 加 IPTG 誘導的cry3Aa-Pl ；9 加IPTG誘導的pET_30b (+)空載對照；10 未用IPTG誘導的cry3Aa_P2 ； 11 力口 IPTG 誘導的 cry3Aa-P2 ； 12 未用 IPTG 誘導的 Pl-cry3Aa_P2 ； 13 力口 IPTG 誘導的 Pl-cry3Aa-P2 ；14 未用 IPTG 誘導的 P2_cry3Aa_Pl ；15 加 IPTG 誘導的 P2_cry3Aa_Pl圖2. Western Blot檢測目的蛋白M =Western Blot蛋白質分子量標準；1 未用IPTG誘導的cry3Aa ；2 加IPTG誘導的 cry3Aa ；3 未用 IPTG 誘導的 Pl_cry3Aa ；4 加 IPTG 誘導的 Pl_cry3Aa ；5 未用 IPTG 誘導的 P2-cry3Aa ；6 加 IPTG 誘導的 P2_cry3Aa ；7 和 16 加 IPTG 誘導的 pET_30b (+)空載對照；8 未用IPTG誘導的cry3Aa-Pl ；9 加IPTG誘導的cry3Aa_Pl ；10 未用IPTG誘導的 cry3Aa-P2 ；11 加 IPTG 誘導的 cry3Aa_P2 ；12 未用 IPTG 誘導的 Pl-cry3Aa_P2 ；13 加 IPTG 誘導的 Pl-cry3Aa-P2 ； 14 未用 IPTG 誘導的 P2-cry3Aa_Pl ； 15 加 IPTG 誘導的 P2-cry3Aa-Pl圖3.檢測到的肽段在Cry3Aa胺基酸序列中的分布情況圖4. ELISA檢測目的蛋白圖5. Cry3Aa蛋白和融合Cry3Aa蛋白對桑天牛幼蟲的影響圖6.短肽融合Cry3Aa對桑天牛幼蟲生長發育的影響圖7.桑天牛幼蟲取食Cry3Aa和融合Cry3Aa蛋白後不同時間的排洩物重量圖8.取食Cry3Aa和短肽融合Cry3Aa後桑天牛不同時間排洩物中Cry3Aa含量
圖9. Cry3Aa和短肽融合Cry3Aa蛋白在桑天牛中腸內的滯留時間
具體實施例方式以下材料為已知材料，本實驗室也有保存，可自申請日起二十年內向公眾發放用於實驗。質粒pET-30b(+)_2K。桑天牛幼蟲。實施例1.構建融合基因的原核表達載體以本實驗室保存的攜帶有cry3Aa基因的pET-30b(+)_a(質粒為模板，以在引物5』 端添加了纖維素酶親合短肽P1，P2的引物(如下表)進行PCR擴增，得到Cry3Aa融合蛋白基因。通過一系列分子克隆操作獲得了 7個pET-30b(+)原核表達載體pET-30b(+)-Cry3Aa、 pET-30b ( + )-Pl-cry3Aa、pET_30b ( + )_P2_cry3Aa、pET_30b ( + )_cry3Aa_Pl、 pET-30b (+) -cry3Aa-P2、pET_30b (+) -Pl_cry3Aa_P2、pET_30b (+) -P2_cry3Aa_Pl。
權利要求
1.以Bt蛋白Bt886-cry3Aa為基礎的融合蛋白，其特徵在於所述Bt886_cry3Aa蛋白的肽鏈的至少一端融合了胺基酸序列如ID No. 1的短肽Pl ；或者所述Bt886-Cry3Aa蛋白的肽鏈的氨基端融合了胺基酸序列如kq ID No. 1的短肽Pl且羧基端融合了胺基酸序列如^^ ID No. 2所示的短肽P2。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其胺基酸序列是kqID No. 3,Seq IDID No. 5所示的胺基酸序列；或者kq ID No. 3、Seq ID No. 4或kq ID No. 5所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個胺基酸且具有同等蛋白活性的胺基酸序列。
3.編碼權利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4.根據權利要求3所述的基因，其核苷酸序列如％(1ID No.6、7或8所示。
5.含有權利要求3所述基因的重組表達載體。
6.由權利要求5所述重組表達載體轉化而得的宿主細胞。
7.殺蟲劑，含有權利要求1或2任一所述融合蛋白。
8.權利要求3所述基因或權利要求7所述重組表達載體在製備轉基因植物中的應用。
9.權利要求3所述基因或權利要求7所述重組表達載體在提高植物抗蟲性中的應用。
10.權利要求1或2所述融合蛋白的製備方法，其特徵在於將權利要求7所述的重組表達載體轉入到宿主細胞中，誘導宿主細胞表達融合蛋白，分離融合蛋白。
全文摘要
本發明以Bt蛋白Bt886-cry3Aa為基礎的融合蛋白及其用途，屬於生物技術領域。以Bt蛋白Bt886-cry3Aa為基礎的融合蛋白，其特徵在於所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽鏈的至少一端融合了胺基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1；或者所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽鏈的氨基端融合了胺基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1且羧基端融合了胺基酸序列如Seq ID No.2所示的短肽P2。該融合蛋白比野生Bt蛋白能夠在害蟲體內滯留更長時間，具有更高的殺蟲活性。
文檔編號A01N47/44GK102276728SQ20111022714
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月9日 優先權日2011年8月9日
發明者盧孟柱, 唐芳, 胡建軍, 趙樹堂, 郭長花, 陳敏 申請人:中國林業科學研究院林業研究所