脂質體包封的拓撲異構酶抑制劑的製作方法

2023-10-07 11:50:44 2

專利名稱：脂質體包封的拓撲異構酶抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有被包封的拓撲異構酶抑制劑的脂質體組合物。
對於某些診斷期間就已全部或微散播的擴散性腫瘤來說，化療是有效的。這些包括睪丸癌、擴散性大細胞淋巴癌、霍奇森病和絨毛膜癌及兒童腫瘤如急性淋巴細胞白血病。對於擴散性癌症的其他類型來說，化療提供的是一種緩解性而非治癒性治療。有效的緩解性治療可暫時清除癌症的症狀和徵兆以及延長生命。最近的進展表明，化療對一些癌症腫瘤的化學控制是可能的。
用於癌症治療的一類藥物是拓撲異構酶抑制劑。這些化合物抑制拓撲異構酶的酶活性，該酶參與DNA的複製、修復、遺傳重組和轉錄。拓撲異構酶抑制劑的一個例子是喜樹鹼，為一種幹擾拓撲異構酶Ⅰ活性的天然化合物，該酶涉及DNA複製和RNA轉錄。喜樹鹼及喜樹鹼類似物拓撲替康(topotecan)及伊立替康(irinotecan)已被批准用於臨床。
通過幹擾拓撲異構酶Ⅰ的斷裂/重新連接活性，喜樹鹼及其類似物對癌症的化療有效。這種化合物穩定並形成一種可逆的酶-喜樹鹼-DNA三元複合物，該複合物能阻止拓撲異構酶反應中斷裂/連接循環中的重新連接步驟。
喜樹鹼存在的一個問題是水不溶性，這妨礙了藥物的運送。已製備了許多喜樹鹼類似物以改善此類化合物的水溶解性。喜樹鹼及其類似物的另一個問題是其α-羥基內酯環在水環境中易於水解。內酯環開環形成藥物的羧酸鹽形式而表現為極低的抗拓撲異構酶Ⅰ活性。
已有許多方法描述了改善喜樹鹼及其類似物的穩定性。其中一個方法是將化合物包封在脂質體中。
Burke(US5552156)描述了一種脂質體組合物，試圖解決喜樹鹼及其類似物的不穩定性，該方法是將化合物包封在脂質體中，該脂質體具有一個允許化合物滲透、嵌入的脂質雙層膜。當化合物嵌入雙層膜中，它在脂質體中心遠離水環境從而避免了水解。
該方法的一個問題在於脂質體被網狀內皮系統(RES)快速從血液中清除掉，這樣就阻止了藥物的運送尤其是在腫瘤部位的聚集。
Subramanian和Muller等(Oncology Reseach,7(9):461-469(1995))描述了拓撲替康的脂質體製劑，並且報導以脂質體包封的形式可穩定拓撲替康避免因其內酯環水解而造成的失活。然而，這種脂質體包封藥物的體外生物活性僅為游離藥物的60％。
Lundberg(Anti-Cancer Drug Design,13:453(1998))描述了喜樹鹼類似物的兩種親脂性、油酸酯衍生物，所述喜樹鹼類似物包封於脂質體中並嵌入雙層膜中以穩定其內酯環。Daoud(Anti-Cancer Drug,6:83-93(1995))描述了包括嵌入雙層膜上的喜樹鹼的脂質體組合物。這些參考中的脂質體均為常規方法製得，即藥物被動包封於脂質體中且將藥物隱蔽在脂質雙層膜中得以穩定。該方法製得的脂質體難以負載足夠量的藥物以達到臨床療效。
因此，本領域仍需要具有以下特性的脂質體製劑(ⅰ)包括一種拓撲異構酶抑制劑，例如喜樹鹼及其類似物；(ⅱ)在血流中能維持較長時間；(ⅲ)保持抗癌活性；和(ⅳ)包括所負載的足夠量臨床用藥物。
發明簡述相應地，本發明的一個目的是提供用於改善癌症治療的拓撲異構酶抑制劑組合物。
本發明的另一個目的是提供用於抗腫瘤治療的拓撲異構酶抑制劑給藥的脂質體組合物。
另一方面，本發明包括一種用於治療患者腫瘤的組合物，它包括含有可成囊類脂和1-20摩爾％的用親水聚合物衍生化的可成囊類脂的脂質體。所述脂質體在聚合物能分布於脂質體雙層膜兩側上的條件下形成。脂質體中包封的的是拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑，其濃度至少為0.10微摩爾藥物/微摩爾類脂。脂質體具有一定的內/外離子梯度，該梯度足以使特定濃度的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑保留在脂質體中。
在一個實施方案中，拓撲異構酶抑制劑是選自包括喜樹鹼及其衍生物的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑。例如，喜樹鹼衍生物可以是9-氨基喜樹鹼、7-乙基喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、10,11-亞甲二氧基喜樹鹼、9-氨基-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼或9-氯-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼。
在另一實施方案中，喜樹鹼衍生物為伊立替康、拓撲替康、(7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼，7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)-喜樹鹼或7-(2-N-異丙氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼。
在另一實施方案中，拓撲異構酶抑制劑是拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑，例如6-[[2-(二甲基氨基)-乙基]氨基]-3-羥基-7H-茚並[2,1-c]喹啉-7-酮二鹽酸化物，阿佐特星(azotoxin)或3-甲氧基-11H-吡啶[3』,4』-4,5]吡咯[3,2-c]喹啉-1,4-二酮。
脂質體組合物中所含的親水性聚合物可以是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑烷、聚乙基噁唑烷、聚羥丙基噁唑烷、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸羥丙酯、聚丙烯酸羥乙酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇和聚天冬醯胺。
在優選實施方案中，親水性聚合物為分子量為500-5,000道爾頓的聚乙二醇。
在另一實施方案中，脂質體進一步包括相變溫度高於37℃的可成囊類脂。
在另一實施方案中，可成囊類脂為氫化大豆卵磷脂、二硬脂醯卵磷脂或鞘磷脂。一個優選的脂質體組合物含有20-94摩爾％的氫化大豆卵磷脂、1-20摩爾％的用聚二乙醇衍生化的二硬脂醯卵磷脂和5-60摩爾％的膽固醇。
另一優選組合物中包括30-65摩爾％的氫化大豆卵磷脂、5-20摩爾％的用聚二乙醇衍生化的二硬脂醯卵磷脂和30-50摩爾％的膽固醇。
另一方面，本發明包括用於拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑給藥的組合物，包括含有可成囊類脂並具有一定的內/外離子梯度的脂質體，該梯度足以使藥物保留在脂質體中。脂質體中包封的是拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑，其濃度至少為0.20微摩爾藥物/微摩爾類脂。
另一方面，本發明包括治療患者腫瘤的方法，包括製備含有用親水聚合物鏈衍生化的1-20摩爾％的可成囊類脂的脂質體，所述脂質體在聚合物能分布於脂質體雙層膜兩側上的條件下形成。脂質體中包封的是拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑，其濃度至少為0.10微摩爾/微摩爾類脂。脂質體具有一定的內/外離子梯度，該梯度足以使特定濃度的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑保留在脂質體中。然後將脂質體給予受試者。
在這方面的一個實施方案中，方法進一步包括採用遙控載藥法(remoteloading)例如硫酸銨梯度將拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑包封在脂質體中。
結合附圖閱讀下面的詳細描述，本發明的這些及其他目的和特徵將得到更為全面的理解。


圖1B為給予大鼠脂質體包封的MPE-喜樹鹼(實心圓)和游離(非脂質體)MPE-喜樹鹼(實心方形)後MPE-喜樹鹼血藥濃度隨時間(小時)變化曲線。
圖2A為接種HT-29結腸腫瘤後小鼠的體重(g)隨時間(天)變化曲線。於接種腫瘤後第10、16和23天，給予動物24mg/kg(實心圓)、15mg/kg(實心三角)和6mg/kg(實心方形)脂質體包封的MPE-喜樹鹼和24mg/kg(空心圓)、15mg/kg(空心三角)和6mg/kg(空心方形)游離形式的MPE-喜樹鹼。
圖2B為接種HT-29結腸腫瘤後腫瘤體積(mm3)隨時間(天)變化曲線。於接種腫瘤後第10、16和23天，給予動物24mg/kg(實心圓)、15mg/kg(實心三角)和6mg/kg(實心方形)脂質體包封的MPE-喜樹鹼和24mg/kg(空心圓)、15mg/kg(空心三角)和6mg/kg(空心方形)游離形式的MPE-喜樹鹼。
圖3A為接種HT-29結腸腫瘤後小鼠的體重(g)隨時間(天)變化曲線。於接種腫瘤後第9、16和23天，給予動物5mg/kg(空心三角)、3mg/kg(空心倒三角)、1mg/kg(空心菱形)、0.5mg/kg(空心圓)和0.1mg/kg(空心方形)脂質體包封的MPE-喜樹鹼和20mg/kg游離形式的MPE-喜樹鹼。
圖3B為接種HT-29結腸腫瘤後腫瘤體積(mm3)隨時間(天)變化曲線。於接種腫瘤後第9、16和23天，給予動物5mg/kg(空心三角)、3mg/kg(空心倒三角)、1mg/kg(空心菱形)、0.5mg/kg(空心圓)和0.1mg/kg(空心方形)脂質體包封的MPE-喜樹鹼和20mg/kg游離形式的MPE-喜樹鹼。
圖4A-4B為給予大鼠脂質體包封的拓撲替康(實心三角)和游離(非脂質體)拓撲替康(實心方形)後拓撲替康血漿濃度隨時間(小時)變化曲線。圖4A和圖4B分別給予2mg/kg和5mg/kg。
圖5A為接種HT-29結腸腫瘤後小鼠的體重(g)隨時間(天)變化曲線。於接種腫瘤後第9、16和23天，給予動物2mg/kg(菱形)、5mg/kg(圓)和8mg/kg(空心方形)脂質體包封的拓撲替康；4mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼(三角)；25mg/kg游離形式的拓撲替康(倒三角)和鹽水(實心方形)。
圖5B為接種HT-29結腸腫瘤後腫瘤體積(mm3)隨時間(天)變化曲線。於接種後第9、16和23天，給予動物2mg/kg(菱形)、5mg/kg(圓)和8mg/kg(空心方形)脂質體包封的拓撲替康；4mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼(三角)；25mg/kg游離形式的拓撲替康(倒三角)和鹽水(實心方形)。
圖6為給予大鼠脂質體包封的CKD602(實心圓)和游離(非脂質體)拓撲替康(實心方形)後CKD602血漿濃度隨時間(小時)變化曲線。
圖7A為接種HT-29結腸腫瘤後小鼠的體重(g)隨時間(天)變化曲線。於接種腫瘤後第9、16和23天，給予動物4mg/kg(菱形)、2mg/kg(圓)和1mg/kg(空心方形)脂質體包封的CKD602；4mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼(三角)；20mg/kg游離形式的CKD602(倒三角)和鹽水(實心方形)。
圖7B為接種HT-29結腸腫瘤後腫瘤體積(mm3)隨時間(天)變化曲線。於接種後第9、16和23天，給予動物4mg/kg(菱形)、2mg/kg(圓)和1mg/kg(空心方形)脂質體包封的CKD602；4mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼(三角)；20mg/kg游離形式的CKD602(倒三角)和鹽水(實心方形)。
發明的詳細描述1．定義除非另有所指，以下術語具有下述含義。
「有效量」或「有效劑量」指抑制不良細胞生長例如阻止不良細胞生長或減少已有的細胞生長如腫瘤細胞生長所需的量。該有效量受本領域已知的因素影響，例如細胞生長的類型、給藥的方式方法、受試者的年齡、細胞生長的嚴重性等。本領域技術人員會考慮到這些因素並確定相應的有效量。
「治療上有效的抗腫瘤療法」指能有效地保持或降低原發腫瘤或轉移腫瘤的大小如體積的治療方法。
「拓撲異構酶Ⅰ抑制劑」指能抑制或降低拓撲異構酶Ⅰ的活性的任何化合物。
「拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑」指能同時抑制或降低拓撲異構酶Ⅰ和拓撲異構酶Ⅱ的活性的任何化合物。
「拓撲異構酶抑制劑」指拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑。
「MPE-喜樹鹼」指7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼。
「拓撲替康」指9-二甲基-氨甲基-10-羥基喜樹鹼。
「CKD-602」指7-(2-N-異丙氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼。Ⅱ．脂質體組合物本發明涉及用於拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑給藥的脂質體組合物。在支持本發明的實驗中，將下述三種拓撲異構酶抑制劑包封在脂質體中並研究了其體內特性拓撲替康，7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼(此處指「MPE-喜樹鹼」)和7-(2-N-異丙氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼(此處指「CKD-602」)。如下面將要描述的，採用遙控載藥法將藥物包封到脂質體中以使較高的藥物負載穩定地保留在脂質體中。製劑的體內實驗證明與用游離形式的拓撲異構酶治療相比，脂質體組合物令人驚奇地提高了治療活性。更具體地，如下面將要描述的，達到治療性抗癌療法所需脂質體包封的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑MPE-喜樹鹼的劑量要比游離藥物劑量低20倍。
在這部分，將描述脂質體組合物，包括脂質體的製備方法。
A．脂質體的組成適用於本發明的脂質體包括那些主要由可成囊類脂組成的脂質體。可成囊類脂例如磷脂在水中可自發形成雙層囊。脂質體也可包括摻入脂質雙層的其他一些類脂，這些類脂具有與內部相連的疏水基、雙層膜疏水區域和伸向外部、雙層膜極性表面的首基。
可成囊類脂優選具有兩條烴鏈、典型地為醯基鏈，和一個極性或非極性首基。有許多合成的和天然的可成囊類脂，包括磷脂，如卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、磷脂酸、磷脂醯肌醇和神經鞘磷脂，其中典型地兩條烴鏈有14-22個碳原子並具有不同的飽和度。上面所描述的具有不同飽和度醯基鏈的類脂和磷脂可由市售購得或按公開的方法製得。其他適宜的類脂包括糖脂和甾醇如膽固醇。
陽離子類脂作為脂質組合物中的次要或主要或唯一成分也適用於本發明脂質體。此類陽離子類脂典型地有一個親脂部分如甾醇、醯基或二醯基鏈，其中類脂荷淨正電。優選地，類脂的首基荷正電。示例性的陽離子類脂包括1,2-二油基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；N-1-(2,3,-雙十四烷基氧)丙基]-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)；N-1-(2,3,-二油基氧)丙基]-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DORIE)；N-[1-(2,3-二油基氧)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)；3[N-(N＇,N＇-二甲基氨基乙基)氨基甲醯基]膽固醇(DC-Chol)；和二甲基雙十八烷基銨(DDAB)。
可成囊的陽離子類脂也可以是中性類脂，例如二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)或兩親性類脂如磷脂，用陽離子類脂如多溶素或其它多元胺類脂衍生化。例如中性類脂(DOPE)即可用多溶素衍生為陽離子類脂。
在另一實施方案中，選擇可成囊類脂以達到特定程度的流動性或剛性，目的是控制脂質體在血清中的穩定性和控制脂質體所包封藥物的釋放速率。
通過摻入相對剛性的類脂，例如有較高相變溫度如高於室溫、優選高於體溫和直至80C的類脂，可以使脂質體具有更剛性的脂質雙層或液晶態雙層。剛性的例如飽和類脂使脂質雙層膜更具剛性。已知其他類脂成分例如膽固醇對脂質雙層結構的膜剛性也有貢獻。
另一方面，通過摻入相對流動性的類脂，典型地具有較低的液態-液晶態相變溫度如等於或低於室溫、更優選等於或低於體溫的類脂相的類脂來改善類脂的流動性。
主要相變溫度約為2-80℃的可成囊類脂適於用作本發明組合物的脂質體基本成分。在一個優選實施方案中，採用主要相變溫度高於37℃的可成囊類脂作為脂質體的基本類脂成分。在另一優選實施方案中，採用了相變溫度37-70℃的類脂。作為示例，類脂二硬脂醯卵磷脂(DSPC)的主要相變溫度為55.1℃，類脂氫化大豆卵磷脂(HSPC)的相變溫度為58℃。許多類脂的相變溫度數據在多種出版物中均有列表說明，例如在Avanti極性類脂目錄和類脂熱至相變數據(Lipid,Nist標準參考數據34)中。
脂質體也包括用親水聚合物衍生化的可成囊類脂。如在US5013556和WO98/07409中所描述的，在此引入作為參考。該親水聚合物為脂質體的脂質雙層膜內外表面提供了一種親水聚合物鍊表麵包衣。最外層的親水聚合物鏈包衣使脂質體在體內具有較長血液循環時間。內層的親水聚合物鏈包衣則伸向脂質體的水相室即脂質雙層之間和中央核心室內部，並且於通過遙控載藥負載化合物之後與所包封化合物接觸。如下面將要說明的，親水聚合物鏈包衣分布於脂質體表面內外的脂質體製劑，將用於提供化合物被保留在脂質體中的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑組合物以提高治療活性。
適於用親水性聚合物衍生化的可成囊類脂包括任何上述所列的類脂，具體為磷脂如二油醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)。
適於對可成囊類脂衍生化的親水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑烷、聚乙基噁唑烷、聚羥丙基噁唑烷、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸羥丙酯、聚丙烯酸羥乙酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇和聚天冬醯胺。上述聚合物可用作均聚物或嵌段或無規則聚合物。
一種優選的親水性聚合物鏈是聚乙二醇(PEG)，優選PEG鏈分子量為500-10,000道爾頓、更優選500-5,000道爾頓、最優選1,000-2,000道爾頓。也優選可市售購得的具有多種聚合物大小的以甲氧基或乙氧基封端的PEG類似物作為親水性聚合物，例如120-20,000道爾頓。
有關用親水性聚合物衍生化可成囊類脂的製備方法已有描述，例如US5395619。製備含有此種衍生化類脂的脂質體的方法也已有描述，其中脂質體製劑中典型地包括1-20摩耳％的衍生化類脂。容易理解，親水性聚合物可穩定地與類脂偶聯或以一種不穩定的鍵結合到類脂上，這種鍵使得被包衣的脂質體在血流中或應激反應中使聚合物鏈包衣從脂質體上脫落下來。
B．拓撲異構酶抑制劑本發明脂質體包括一種包封於脂質體中的拓撲異構酶抑制劑。包封是試圖將藥物包封在脂質體的水相核心和水相空間中。容易理解，具有一定疏水性的化合物也可被包封於脂質體的脂質雙層中。
拓撲異構酶催化DNA超螺旋的引入(introduction)和鬆弛。已知幾種類型的具有不同特異性的酶對於DNA的複製、修復、基因重組和轉錄十分重要。名為拓撲異構酶Ⅰ的最簡單的拓撲異構酶能鬆弛超螺旋的DNA，這是一個在能量方面自發的過程。已知為拓撲異構酶Ⅱ的促旋酶可催化DNA負超螺旋扭轉的引入，該過程需要能量並且是ATP依賴的。在DNA複製過程中，拓撲異構酶Ⅰ和Ⅱ均具有鬆弛由解旋酶在複製叉前方引入的正超螺旋的功能。另外，促旋酶能在單鏈DNA出現的片段處引入負扭轉。
拓撲異構酶抑制劑是能抑制拓撲異構酶活性的化合物。已知可抑制拓撲異構酶Ⅰ活性的化合物被用作拓撲異構酶Ⅰ抑制劑，而可抑制拓撲異構酶Ⅱ活性的化合物被用作拓撲異構酶Ⅱ抑制劑。一些已知同時具有抑制拓撲異構酶Ⅰ和拓撲異構酶Ⅱ活性的化合物被用作拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑。
優選用於本發明的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑為喜樹鹼及其類似物。喜樹鹼是最初從中國植物喜樹的木和樹皮中分離出來的五元環生物鹼(Wall,M,E.等。J.Am.Chem.Soc.,94:388(1996))。喜樹鹼由於不可逆轉地抑制拓撲異構酶Ⅰ活性而表現出藥理學作用。喜樹鹼及其類似物或衍生物的合成方法已屬已知，並被總結和羅列於US5244903中，在此引入作為參考。
喜樹鹼的類似物包括SN-38((+)-(4S)-4,11-二乙基-4,9-二羥基-1H-吡喃並[3＇,4＇:6,7]-中氮茚並[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮)；9-氨基喜樹鹼；拓撲替康(hycamtin,9-二甲基-氨基甲基-10-羥基喜樹鹼)；伊立替康(CPT-11,7-乙基-10-[4-(1-哌啶)-1-哌啶]-羰基氧基-喜樹鹼)，在體內水解為SN-38)；7-乙基喜樹鹼及其衍生物(Sawada,S.等Chem.Pham.Bull,41(2):310-313(1993))；7-氯甲基-10,11-亞甲基-二氧基-喜樹鹼；及其他(SN-22,Kunimoto,T.等。J.Pharmacobiodyn.,10(3):148-151(1987)；N-甲醯氨基-12,13，二氫-1,-11二羥基-13-(β-D-吡喃葡糖)-H-吲哚[2,3-a]吡咯並[3,4-c]咔唑-5,7(6H)-二酮(NB-506,Kanzawa,F.等。Cancer Res.,55(13):2806-2813(1995)；DX-8951f和lurtotecan(GG-211或7-(4-甲基哌嗪-亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼)(Rothenberg,M.L.，等。Ann.Oncol,.8(9):837-855(1997))和7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼(CKD602,Chong Kun Dang公司，韓國)。
同時具有抑制拓撲異構酶Ⅰ和拓撲異構酶Ⅱ活性的拓撲異構酶抑制劑包括6-[[2-(二甲基氨基)-乙基]氨基]-3-羥基-7H-茚並[2,1-c]喹啉-7-酮二鹽酸化物，(TAS-103,Utsugi,t.，等。Jpn.J.Cancer Res.,88(10)992-1002))和3-甲氧基-11H-吡啶並[3＇,4＇-4,5]吡咯[3,2-c]喹啉-1,4-二酮(AzalQD,Riou,J.F.，等。Mol.Pharmacol.,40(5):699-706(1991))。
在本發明的一個實施方案中，用於給藥的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑是具有一個手性中心的喜樹鹼類似物的藥理活性對映體。可使用本領域技術人員已知的技術從外消旋混合物中拆分對映體。
C．脂質體組合物的製備方法脂質體可以通過許多技術製備，如Szoka,F.,Jr.，等在Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)中描述的，下面將描述支持本發明脂質體製備的特定實施例。典型地，脂質體為用簡單脂質膜水合技術製備的多室小囊(MLVs)。在這種方法中，形成脂質體的類脂和包括一種親水性聚合物衍生化的可成囊類脂的混合物溶解於適宜的溶劑中，在容器中蒸發溶劑後形成幹薄膜。然後加水性介質將膜覆蓋形成MLVs，典型地大小為0.1-10微米。用於製備衍生化類脂和形成聚合物包衣脂質體的示例方法見共同擁有的US5013556、5631018和5395619，在此引入作為參考。
通過標準方法選擇可以結合到脂質體上的治療藥物，包括(ⅰ)用藥物的水性溶液水合脂質膜被動包封水溶性化合物，(ⅱ)水合含有藥物的脂質膜被動包封親脂性化合物，和(ⅲ)靠脂質體內/外離子梯度負載具電離性質的藥物，術語為「遙控載藥法」。其他製備方法如逆向蒸發相脂質體法也適用。
本發明優選採用遙控載藥法製備脂質體。在為支持本發明而進行的研究中，靠離子濃度梯度採用遙控載藥法將三種示例性的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑負載到預先形成的脂質體中，如先有技術US 5192549中描述和如實施例1描述。與其他負載方法相比，遙控載藥法製得的脂質體中央室積聚的藥物濃度要高。在本發明的一個優選實施方案中，至少約0.10微摩爾藥物/微摩爾類脂、更優選至少約0.15微摩爾藥物/微摩爾類脂、最優選至少約0.20微摩爾藥物/微摩爾類脂的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑負載到脂質體中。支持本發明的脂質體包含MPE-喜樹鹼、拓撲替康或CKD602。如實施例1將要討論的，通過遙控載藥法負載到脂質體中的這些化合物的濃度大於0.20微摩爾藥物/微摩爾類脂(參見實施例1的表)。
用於遙控載藥的具有跨脂質體雙層的離子梯度的脂質體可通過許多技術製備。上面描述了一個典型方法，其中可形成脂質體的類脂混合物溶於適宜的有機溶劑中並在容器中蒸發形成薄膜。然後用含有將在脂質體內部空間形成水相的溶質的水性介質覆蓋形成的薄膜。
脂質體形成後，採用已知技術將囊泡成粒(sizing)(按一定尺寸製造)而獲得所需粒度範圍的脂質體。優選脂質體被均勻地製成粒徑為0.04-0.25微米。採用超聲或均化處理脂質體可製得典型粒徑為0.04-0.08微米的小單層脂質體(SUVs)。採用膜擠壓法即將脂質體通過0.03-0.5微米、典型地0.05、0.08、0.1或0.2微米的聚碳酸酯膜或其他有確定孔徑的膜，可以製得粒徑為約0.08-0.4微米的均勻脂質體。膜的孔徑與通過擠壓過膜生成的脂質體最大粒徑大約相符，特別是當製備物被兩次或多次擠壓過同樣的膜的情況下更是如此。成粒優選在用於脂質水合的原始緩衝液中進行，這樣在製備過程中脂質體的內相始終保留有這種介質。
成粒後，處理脂質體的外部介質以產生跨脂質體膜離子梯度，典型地為內低/外高的濃度梯度。多種方法可達到這個目的，例如(ⅰ)稀釋外部介質，(ⅱ)對所需的最終介質透析，(ⅲ)用所需介質通過分子篩色譜如Sephadex G-50，或(ⅳ)高速離心後再將沉澱的脂質體混懸於所需的最終介質中。目前認識到外部介質的選擇取抉於梯度形成的機理和所需的外部pH值。
在產生離子梯度的最簡單方法中，水合、成粒的脂質體有一個選擇的內部介質pH值。滴定脂質體混懸液，或用具有所需外部pH值的緩衝液按上述方法交換外相緩衝液直至達到所需的最終pH值。例如，象穀氨酸或磷酸緩衝液這樣的所選擇的緩衝液中原始介質的pH值為5.5，而最終外部介質為pH值8.5的相同或不同緩衝液。優選含有大致相同克分子滲透壓濃度的內部和外部介質，例如對緩衝液、鹽或低分子量溶質如蔗糖濃度適當地調節。
另一個方法中，通過在脂質體中包含一種所選擇的離子載體來產生梯度。為了說明，在鉀緩衝液中製備在脂質體雙層中含有纈氨黴素的脂質體，成粒，然後用鈉緩衝液交換，產生一個內部鉀/外部鈉的梯度。鉀離子由內向外的移動相應地產生了一個內部低/外部高pH的梯度，推測這是對應於淨負電荷穿過脂質膜而產生的質子向脂質體移動(Deamer，等。1972)。
在另一個更優選的方法中，是通過建立一個跨脂質體膜的銨離子梯度以產生用於藥物負載的質子梯度，如US5192549中所述。這裡的脂質體在含有銨鹽的水性緩衝液中製備，典型地為0.1-0.3M的銨鹽如硫酸銨，合適的pH值如5.5-7.5。可用硫酸化的聚合物來產生梯度，如右旋糖酐硫酸銨或硫酸肝素。脂質體形成和成粒後，用不含銨離子的介質交換外部介質，例如同樣的緩衝液，但是其中的硫酸銨被能使脂質體保持相同內外克分子滲透壓濃度的氯化鈉或糖代替。
脂質體形成後，脂質體內部的銨離子與氨和質子達到平衡。氨能夠滲透脂質雙層並從脂質體內部逸出。氨的不斷逸出使脂質體內的平衡向產生質子的正平衡移動。
通過將藥物加入到具離子梯度的脂質體混懸液中使拓撲異構酶抑制劑負載到脂質體中，在確保化合物能有效地由外部介質進入脂質體中的條件下處理混懸液。適合藥物負載的溫育條件如下(ⅰ)允許衍生的化合物以一種不帶電的形式擴散至脂質體，和(ⅱ)優選達到較高的藥物負載濃度，如包封藥物5-500mM、更優選20-200mM、最優選50-300mM。
優選在高於脂質體類脂相變溫度的溫度下進行負載。因此，對於主要由飽和磷脂形成的脂質體，負載溫度可在60℃或更高。典型地負載時間為15-200分鐘，這取決於藥物對脂質體雙層膜的滲透性、溫度和脂質體類脂與藥物的相對濃度。
通過對脂質體濃度、所加化合物的外部濃度和離子梯度的適當選擇，基本上所有的化合物均可負載入脂質體。例如，3個pH單位的梯度(或採用銨離子梯度的這樣的梯度強度)即可使藥物的最終內外濃度比約為1000∶1。已知計算的內部脂質體體積和所負載藥物的最大濃度，就可對外部介質中藥物的量加以選擇，這樣藥物基本能完全被負載到脂質體中。
另外，如果藥物負載不能有效地消耗游離藥物的外部介質，可以在藥物負載後處理脂質體混懸液直至除去未包封的藥物。游離藥物也可通過如分子篩色譜、滲析或離心方法除去。
在其他實施方案中，拓撲異構酶抑制劑負載到預先形成的脂質體中，該脂質體內部含有能與拓撲異構酶抑制劑有效混合併提高化合物在脂質體中保留的截留劑(trapping agent)。在優選的實施方案中，截留劑是一種多陰離子聚合物，例如優選含有相似化學結構和電離基團的重複單元的分子，即可電離產生離子電荷、優選為負電荷的化學官能團。分子量400-2,000,000道爾頓的聚合物均適宜。
多陰離子聚合物在脂質囊泡形成過程中被包封到脂質體中。在將藥物負載到預先形成的脂質體中的過程中，聚合物用來將藥物截留或保留在脂質體內。在此描述的研究中，右旋糖酐硫酸鹽用作典型的多陰離子聚合物。右旋糖酐硫酸鹽是大約2.3個硫酸根基團/葡糖殘基的葡糖酐聚合物。它含有大約95％的α-D-(1-6)鍵和使右旋糖酐分支的剩餘(1-3)鍵。容易獲得分子量為5,000-500,000道爾頓的聚合物。然而，其他合適的聚合物還包括硫酸化、磺酸化、羧基化或磷酸化的親水聚合物。例如，硫酸蛋白多糖如硫酸肝素，硫酸多糖如硫酸纖維素或纖維素衍生物、角叉菜膠、粘蛋白，硫酸化多肽如帶硫酸化氨基的多溶素、帶有磺酸衍生化糖或肽亞單位的糖肽、和透明質酸。也包括硫酸軟骨素A、B和C、硫酸角蛋白、硫酸皮膚素。聚合物也可以是修飾成包括陰離子官能團的中性聚合物。例如，直鏈澱粉、果膠、支鏈澱粉、纖維素和修飾成包括陰離子亞單位的右旋糖酐。帶有磺基的聚合物如聚乙烯硫酸、聚乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸和硫酸松香樹膠也是合適的。
製備含有截留劑的脂質體在實施例4中有所描述。在該實施例中，通過將脂質體類脂溶於乙醇後加到右旋糖酐硫酸銨鹽溶液中，混合形成包封有右旋糖酐硫酸銨鹽的脂質體，這樣多陰離子聚合物硫酸右旋糖酐就被包封在脂質體中。通過交換外部介質形成用於遙控載藥的跨脂質體銨離子梯度。Ⅲ．組合物體內給藥如實施例1所示製備支持本發明的脂質體。在硫酸銨鹽離子濃度梯度下，將拓撲異構酶Ⅰ抑制劑(7-(4-甲基哌嗪)-亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼)，在此指「MPE-喜樹鹼」；拓撲替康；和7-(2-(N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼，在此指「CKD-602」負載到脂質體中。脂質體由摩爾比為55.4∶39∶5.6的氫化大豆卵磷脂、膽固醇和聚乙二醇衍生化的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE)組成。實施例1中的表總結了製備脂質體製劑的藥物與類脂之比。根據擠出脂質體的捕獲容積為0.9微升/微摩爾類脂，計算出脂質體中三種化合物的濃度MPE-喜樹鹼為284mM，拓撲替康為264mM和CKD-602為298mM。根據擠出脂質體的捕獲容積為1.5微升/微摩爾類脂，計算出脂質體中藥物的濃度MPE-喜樹鹼為189mM，拓撲替康為174mM和CKD-602為198mM。下面將描述每種藥物的體內研究。
1．MPE-喜樹鹼的體內給藥長循環即PEG包衣的含有MPE-喜樹鹼的脂質體給予大鼠，並測定脂質體包封形式的藥物的血液循環時間。脂質體包封的藥物和游離藥物的藥代動力學曲線見圖1A，以注射劑量的百分比為時間的函數。可以看出，脂質體包封形式的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑(實心圓)的血液循環時間明顯長於游離形式的藥物(實心方形)。對於MPE-喜樹鹼來說，脂質體包封藥物的血液循環半衰期為14小時，而游離藥物的半衰期為50分鐘。與游離藥物相比，脂質體包封藥物的大鼠血液清除率大約低35倍，曲線下的面積大約高1250倍。分析結果顯示，在血流中基本上所有的藥物均保留在脂質體中。
圖1B顯示給予大鼠脂質體製劑(實心圓)和游離藥物後全血中MPE-喜樹鹼的濃度。長循環時間導致血液中的藥物濃度高。
採用異種移植腫瘤模型測定了MPE-喜樹鹼脂質體製劑的抗腫瘤效率，其中純種裸鼠被接種人結腸腫瘤細胞HT29。驚奇的是，毒性和抗腫瘤效果的研究表明與同等劑量的游離藥物相比，MPE-喜樹鹼脂質體毒性明顯要高。下面將描述實驗及其結果。
如實施例1製備脂質體包封的MPE-喜樹鹼。給予攜帶HT-29結腸異種移植的裸鼠24mg/kg、15mg/kg和6mg/kg劑量的脂質體包封的MPE-喜樹鹼或相同劑量的游離藥物。腫瘤接種10天後開始治療並在第10、16和23天給藥。測量治療期間和之後每隻動物的腫瘤體積，如實施例2所述。
每隻實驗動物的體重和腫瘤體積分別見圖2A和2B，其中治療時給予脂質體包封的MPE-喜樹鹼24mg/kg(實心圓)、15mg/kg(實心三角)和6mg/kg(實心方形)及游離MPE-喜樹鹼24mg/kg(空心圓)、15mg/kg(空心三角)和6mg/kg(空心方形)。
給予脂質體包封的MPE-喜樹鹼治療的動物中，15mg/kg和24mg/kg劑量組的所有動物均在兩次劑量之後死於與藥物相關的毒性，大部分在第一次給藥5天後死亡。6mg/kg劑量組的動物在第23天的第三次給藥之後依然存活，在以後的幾天內十隻中有五隻死亡。脂質體包封的MPE-喜樹鹼毒性表現為動物體重的嚴重下降，如圖2A所示。
作為對照，給予游離藥物治療的所有動物均存活，只有24mg/kg劑量組中的一隻在第23天的第三次給藥幾天後死亡。
表1
至於製劑的抗腫瘤活性，若不考慮其較大毒性，脂質體包封的MPE-喜樹鹼與游離藥物相比能更有效地抑制腫瘤生長。由圖2B可見，在抑制腫瘤生長方面，6mg/kg劑量的脂質體包封的MPE-喜樹鹼(對數生長率為-0.026)比最大劑量的游離MPE-喜樹鹼(24mg/kg，對數生長率為0.0048)明顯有效。
監測實驗動物腫瘤的全部或部分緩解狀況，結果見表2。腫瘤的完全緩解定義為在實驗結束時腫塊消失。部分緩解定義為動物個體腫瘤體積小於最大腫瘤體積的50％。
表2
1全部緩解表示實驗結束時腫塊消失。2部分緩解表示個體動物腫瘤體積小於最大腫瘤體積的50％。3實驗組的十隻動物全部在第16天的第二次給藥後死亡。4na=不適用如表2所示，6mg/kg劑量的脂質體包封的MPE-喜樹鹼能有效地使實驗組十隻動物的腫瘤全部緩解。在第16天的第二次給藥後的五天內可觀察到這個效果。如上述提到的，6mg/kg劑量脂質體包封藥物的給藥組中的五隻動物在第三次給藥後很快死亡。直至實驗結束之後(大約在第23天最後一次治療後的30天)，五隻存活動物的腫瘤未復發。15mg/kg和24mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼給藥組的動物數據未提供，因為所有的動物均死於與藥物有關的毒性，如上所示。
如表2所示，24mg/kg游離MPE-喜樹鹼給藥組中有3隻動物的腫瘤全部緩解，1隻部分緩解。
比較藥物以游離形式和脂質體形式給藥的結果顯示以脂質體包封的形式給藥更有效。實際上，通過比較給予6mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼和24mg/kg游離MPE-喜樹鹼的結果可見(圖2B，表2)，脂質體包封藥物的效力至少是游離藥物的四倍。結果也清晰表明有效抗腫瘤治療所需的劑量，脂質體包封的MPE-喜樹鹼要比游離藥物低四倍。
實施例2詳細描述了用以確定脂質體包封的MPE-喜樹鹼的最大耐受劑量和最小有效劑量的另一個研究。在這個研究裡，按實施例1所述製備脂質體，按0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、3mg/ml和5mg/ml的劑量給予實驗動物脂質體製劑。游離藥物以20mg/ml劑量給藥作為對照。
表3總結了每組的實驗動物數，詳細說明了在每個劑量不同階段動物的存活數。從表中可見，所有給予生理鹽水治療的對照組和所有給予游離MPE-喜樹鹼治療的動物在研究期間均存活。5mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼給藥組的十隻動物中有四隻死於與藥物相關的毒性，一隻在第三次給藥後死因不詳。3mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼給藥組的十隻動物中有一隻在第二次給藥後死亡，由於缺少任何相應的毒性跡象而未歸因於藥物所致。其他組給予脂質體包封MPE-喜樹鹼治療的動物在整個實驗期間均存活。
表3
研究結果見圖3A-3B，其中3A顯示了鼠的體重(g)隨接種HT-29結腸腫瘤後天數的變化。在接種後的第9、16和23天給予動物5mg/kg(空心三角)、3mg/kg(空心的倒三角)、1mg/kg(空心菱形)、0.5mg/kg(空心圓形)和0.1mg/kg(空心方形)脂質體包封的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑和20mg/kg(實心方形)游離藥物。如圖3A所示，體重的變化與劑量有關，並且這些變化與觀察到的毒性相關。
圖3B顯示腫瘤體積(mm3)隨接種腫瘤後天數變化的曲線，其中劑量符號與圖3A中一致。圖3B顯示與20mg/kg游離藥物相比，5mg/kg和3mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼均能更有效地抑制腫瘤生長。給予20mg/kg游離MPE-喜樹鹼(0.011的對數生長率)進行治療的抗腫瘤活性與1mg/kg脂質體包封的藥物形式(0.017對數生長率)大致相同。
表4概述了實驗動物的全部和部分腫瘤的緩解。
表4
1全部緩解表示實驗結束後腫瘤消失。2部分緩解表示個體動物腫瘤體積小於最大腫瘤體積的50％。3na=不適用給予20mg/kg游離MPE-喜樹鹼治療的動物的腫瘤沒有達到全部緩解。相反地，5mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼給藥組的十隻動物均表現全部緩解，3mg/kg劑量給藥組的十隻動物中的七隻出現全部緩解。
實施例3的研究結果表明脂質體包封的拓撲異構酶抑制劑MPE-喜樹鹼的抗腫瘤活性明顯好於對比的游離藥物組，由於20mg/kg游離藥物的抗腫瘤活性與1mg/kg脂質體包封的藥物相當，這表明脂質體包封的藥物的抗腫瘤效力是游離藥物的約20倍。3mg/kg和5mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼在腫瘤治療中比20mg/kg游離藥物明顯更有效，這表明脂質體包封藥物的治療指數比游離藥物大約高出4-5倍。
2．拓撲替康的體內給藥在支持本發明的另一個研究中，按實施例4將拓撲替康包封到由95∶5摩爾比的DSPC和mPEG-DSPC組成的脂質體中。這裡沒有提及的早期研究表明拓撲替康不易保留在脂質體中。脂質雙層選用單組分磷脂，該磷脂的醯基鏈長度接近於mPEG-DSPC組分中的DSPC。該雙層具有最小的排列缺陷，排列缺陷可引起固相雙層中最相鄰接觸的不完善，所述固相雙層的側向和旋轉流動性比液態雙層低。另外，可採用荷電的右旋糖苷硫酸鹽使拓撲替康沉積於脂質體內部。其他的聚合物，尤其是多陰離子聚合物如硫酸軟骨素A，聚乙烯硫酸和多磷酸也適用於此。
按實施例4所述，將拓撲替康負載到預先形成的中央間室包含右旋糖苷硫酸銨的脂質體中。負載之後，過濾除去未包封的藥物並定性脂質體。負載脂質體至藥物/類脂比為0.238，脂質體平均粒徑為87nm。
靜脈給予大鼠含有拓撲替康的脂質體以確定血液循環時間。圖4A-4B顯示給藥後鼠血漿中拓撲替康的濃度隨時間的變化。圖4A比較了給予相同的2mg/kg劑量後包封拓撲替康脂質體(實心三角形)和游離拓撲替康(實心方形)的濃度。圖4B比較了給予5mg/kg劑量的兩種形式藥物。計算的藥動學參數見表5。
表5
表5的數據顯示，脂質體包封藥物的循環時間明顯長於游離藥物。
在另一研究中測定了脂質體的效力。如實施例4描述，向皮下異種移植腫瘤的鼠施用脂質體。荷瘤鼠隨機分為六個治療組，每組十二隻，每隻治療如下生理鹽水，4mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼；25mg/kg游離拓撲替康；2mg/kg、5mg/kg和8mg/kg脂質體包封的拓撲替康。所有治療均每周一次進行三次靜脈濃注給藥，具體為第9、16和23天。
在評估治療有效性的研究期間每周兩次測定每隻動物的腫瘤大小。每周兩次檢測動物體重以評估製劑的毒性。結果見表6和7並見圖5A-5B。
表6
1全部緩解表示實驗結束時腫瘤消失。
2部分緩解表示個體動物腫瘤體積小於最大腫瘤體積的50％。
3無效應表示腫瘤與最初腫瘤體積相同。
如圖5A和表6所示，未經治療的腫瘤在實驗期間每天以17.8mm3的速率增長。給予脂質體包封的MPE-喜樹鹼的動物(陽性對照組)的腫瘤在實驗期間增長速率為-1.2mm3/天。以低於40mg/kg最大耐受量(MTD)的25mg/kg的劑量給予未包封的拓撲替康，動物的腫瘤增長速率為14.1mm3/天。給予脂質體包封的拓撲替康治療的動物，其中2mg/kg劑量組在實驗期間腫瘤增長速率為0.9mm3/天，5mg/kg劑量組的腫瘤增長速率為-1.9mm3/天，8mg/kg劑量組的增長速率為-0.8mm3/天。負增長速率表示腫瘤大小退化至低於初始的腫瘤體積。
計算所有治療組的治療腫瘤與對照組腫瘤的大小比例(％T/C)，結果見表6。國家癌症研究院定義％T/C低於42時有顯著的抗腫瘤活性。
表7
1％T/C定義為所顯示各天的平均腫瘤體積與生理鹽水處理的對照組動物的平均腫瘤體積的比值。
3．CKD-602的體內給藥實施例5描述了採用拓撲異構酶抑制劑CKD-602的旨在支持本發明的另一研究。採用以右旋糖酐為截留劑的硫酸銨鹽梯度將藥物遙控載藥入脂質體中。與採用拓撲替康所進行的研究一樣，脂質體類脂組合物HSPC和mPEG-DSPE的摩爾比率為95/5。
圖6圖顯示給予大鼠1mg/kg CKD-602後CKD-602血漿濃度隨時間的變化曲線。計算出脂質體包封形式藥物(實心圓)的半衰期為9.8小時並且AUC為274μg/mL/小時。而計算的游離形式藥物半衰期為0.2小時、AUC為0.37μg/mL/小時。
用荷有HT-20結腸癌異種移植物的小鼠評估CKD-602製劑的治療效力。72隻接種了HT-20腫瘤細胞的小鼠隨機分為六個治療組。每組動物給予下述一種製劑治療生理鹽水，4mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼；20mg/kg游離的CKD-602；1mg/kg、2mg/kg和4mg/kg脂質體包封的CKD-602。所有治療均每周一次進行三次靜脈濃注，具體在第11、18和25天。
在研究評估治療效力期間每周兩次測定每隻動物的腫瘤大小。每周兩次檢測動物體重以評估製劑的毒性。結果見表8和9及圖7A-7B。
表8
1全部緩解表示實驗結束後腫瘤消失。
2部分緩解表示個體動物腫瘤體積小於最大腫瘤體積的50％。
3無效應表示腫瘤大小等於或大於最初腫瘤體積。
如表8和圖7B所示在研究期間，生理鹽水組動物的腫瘤以15.45mm3/天的速率持續增長。脂質體包封的MPE-喜樹鹼治療的動物陽性對照組腫瘤以-0.63mm3/天的速率增長。游離的未包封的CKD 602組動物腫瘤以15.21mm3/天的速率增長。脂質體包封的CKD 602治療的動物中劑量為1mg/kg的組腫瘤以-2.21mm3/天的速率增長，劑量為2mg/kg的組腫瘤以-0.96mm3/天的速率增長，劑量為4mg/kg的組腫瘤以-2.37mm3/天的速率增長。負增長速率表示腫瘤大小退化至低於初始的腫瘤體積。
計算所有治療組的治療腫瘤與對照組腫瘤的大小比例(％T/C)，結果見表9。國家癌症研究院定義％T/C低於42時有顯著的抗腫瘤活性。
表9
1％T/C定義為所顯示各天的平均腫瘤體積與生理鹽水對照組的動物的平均腫瘤體積的比值。
Ⅳ．實施例下述實施例用以說明本發明組合物的製備、特徵化和使用方法，但不以任何方式限制本發明的範圍。材料拓撲異構酶抑制劑(7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼三氟乙酸鹽(GI147211)(MPE-喜樹鹼)，由Glaxo研究所，Research Triangle Park,NC提供。CKD602(7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼)由Chong Kun Dang公司，韓國提供。拓撲替康(Hycamtin)由市售購得。
脂質體的製備材料和其他試劑均由市售獲得。方法動物研究Homozygous裸鼠來自Taconic Farms(Germantown,NY)並在實驗之前用7天適應環境。動物放在配有無菌嚙齒類動物食物和酸化水及12:12晝/夜循環的隔離籠中。動物在接種腫瘤之前根據體重隨機分組。
腫瘤採用片段套針植入技術(trachar placement)將供體動物體內快速生長的腫瘤接種。用人結腸癌細胞系HT-29引發皮下異種移植腫瘤。培養的細胞經胰蛋白酶處理、洗滌、計數並再混懸於5×107細胞/ml的正常培養基中。腫瘤接種通過在頸背部注射0.1ml(5×106細胞)來完成。在開始治療前讓腫瘤長到平均100mm3大小。
監測每天都要觀察所有動物的生長狀況。動物在腫瘤接種前和以後每周要稱重。接種後5-10天開始，在整個實驗過程中每周測量兩次腫瘤大小。任何與開始體重相比下降15％或以上的和腫瘤體積大於4000mm3的動物均不能用於研究。
實施例1包封拓撲異構酶抑制劑的脂質體的製備脂質體的製備及所選拓撲異構酶的負載如下所述。
A．脂質體製備類脂氫化大豆卵磷脂(HEPC)、膽固醇(Chol)和mPEG-DSPE(比例為56.4∶38.3∶5.3摩爾/摩爾)於65℃溶於在250ml圓底燒瓶中的乙醇中。於65℃連續攪拌至少30分鐘。乙醇中類脂的總濃度為3.7g總類脂/10ml乙醇。
溶解的類脂溶液轉移到含100ml濃度為250mM的硫酸銨溶液(平衡至65℃)的250ml圓底燒瓶中。於65℃水浴中連續混合乙醇類脂硫酸銨的水合混合物至少1小時形成乙醇水合的寡層(oligolamellar)脂質體。
採用Lipex熱筒擠出機使水合混合物通過已知孔徑的聚碳酸酯膜以降低寡層脂質體的粒徑。混合物通過0.20μm孔徑的膜5次，通過0.10μm孔徑的膜10次。擠出的脂質體的內部含水間室(一或多個)含硫酸銨，它們混懸於其中的外部含水體相介質中也有。經過成粒的脂質體貯存在冰箱中直到遙控載藥前的滲濾處理。
100mg所選的拓撲異構酶抑制劑MPE-喜樹鹼、CKD-602或拓撲替康溶於40ml 10％的蔗糖溶液中形成一個2.5mg/ml的濃度。溶解後，溶液通過0.20μm的膜除去不溶性顆粒。
B．脂質體的遙控載藥硫酸銨和乙醇在遙控載藥之前用標示分子量為100Kda的截留筒通過中空纖維切流滲濾法從外部含水體相中除去。維持恆定進樣體積，並且至少採用七個交換體積使脂質體混懸在含10％蔗糖的外部水相中。
滲濾後，脂質體與藥物以(藥物溶液脂質體)1∶4(v/v)的比率混合併迅速用預平衡的含水夾套式容器加溫至65℃。使混合物在65℃的溫度保持40-60分鐘後用冰水浴迅速降溫。遙控載藥後，取樣檢查脂質體樣品中存在的晶體以確定包封百分比及平均粒徑。
採用可截留標示分子量為100K道爾頓的截留筒，通過中空纖維切流滲濾法從體相介質中除去未包封的藥物。採用至少八次交換體積，才能使脂質體包封的藥物混懸在含10％蔗糖10毫摩爾組氨酸pH6.5的外部水相中。
最終的脂質體製劑用0.22μm的醋酸纖維素酯注射濾器無菌過濾並避光冷藏直至使用。
C．脂質體的特徵化包封百分比採用體積排阻色譜法測定，即用空體積(脂質體包封的)中的藥物和藥物總量(空體積加上included體積)之比來確定。柱子級分中的藥物濃度用吸收度測定。平均粒徑用準電性雷射散射法測定(QELS)。在無菌過濾後測定總脂質濃度以確定藥/脂比。製備並特徵化負載有MPE-喜樹鹼、拓撲替康和7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼(CKD-602)的脂質體。結果見下表。
實施例2脂質體包封的MPE-喜樹鹼的體內效力如實施例1所述製備脂質體包封的MPE-喜樹鹼。脂質體包封的藥物和游離藥物均用5％的右旋糖酐水溶液稀釋至所需濃度。
如上面方法部分所述給裸鼠接種人結腸癌細胞系HT-29。七十隻鼠隨機分為七組如下24mg/kg、15mg/kg和6mg/kg游離藥物組；24mg/kg、15mg/kg和6mg/kg脂質體包封的藥物組；生理鹽水組。於接種後第10天腫瘤體積接近75mm3時開始治療。所有治療均靜脈濃注給藥，每周一次，共三次，具體在第10、16和23天。
用每次實驗期間和之後的腫瘤大小作為治療效力的基本評估標準。測定體重以評估毒性。中止治療後直至按以上標準處死期間觀察荷瘤動物。當大多數對照腫瘤達到最大允許體積(4000mm3)時結束實驗。
在不同的時間重複測定每隻動物的腫瘤大小並作為相關的信息。因為腫瘤大小與給藥後的時間有關，反覆測定分析建立每次數據。通過處理數據表明對數轉換相對合理。以Y表示腫瘤的原始測定值，設Z=log(Y+1)。轉換數據之後，對轉換的數據Z進行重複分析。採用SAS程序PROC MIXED。評估每組的對數增長速率並比較不同治療組間的差異。統計學上的顯著性差異為0.05，但由於是多組比較，需調整Ⅰ型誤差並且P值小於0.0033表明在任一對照之間均有顯著性差異。
結果總結於表1和2和圖2A-2B。
實施例3脂質體包封MPE-喜樹鹼劑量的研究如實施例1所述製備包封有MPE-喜樹鹼的脂質體。脂質體包封的藥物和游離藥物均用5％的右旋糖酐水溶液稀釋至所需濃度。
如上面方法部分所述給裸鼠接種人結腸癌細胞系HT-29。七十隻鼠隨機分為如下七組0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg或20mg/kg脂質體包封的藥物；生理鹽水。於接種後第9天腫瘤體積接近75mm3時開始治療。所有治療均靜脈濃注給藥，每周一次，共三次，具體為第10、16和23天。
腫瘤大小的評估和分析如實施例2所述，結果見表3和4和圖3A-3B。
實施例4脂質體包封的拓撲替康的體內效力A．脂質體製備如下製備包封拓撲替康的脂質體類脂為摩爾比95∶5的二硬脂醯卵磷脂(DSPC)和(N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)(mPEG-DSPE)，於70℃持續攪拌溶於乙醇中。乙醇液中類脂濃度為8.9g/10mL。
以右旋糖酐硫酸鈉鹽為原材料經離子交換色譜製得右旋糖酐硫酸銨鹽。將右旋糖酐硫酸鈉鹽溶於水中並用氨水調節pH至5製備100mg/mL的右旋糖酐硫酸銨鹽溶液。
將100mL右旋糖酐硫酸鹽溶液加熱至70℃並與類脂的乙醇液合併，混合形成寡層脂質體。連續攪拌一小時保持乙醇水合的寡層脂質體分散體的溫度為70℃。
水合後混合物加熱至70℃，用Lipex熱筒擠出機通過一系列聚碳酸酯膜成粒使其平均粒徑降低至約100nm。典型地，依次通過孔徑0.2μm的膜5次，再通過孔徑0.1μm的膜10次。
在負載活性藥物之前，通過用350mM氯化鈉溶液進行八個體積交換從外部水性體相中除去未包封的右旋糖酐硫酸鹽聚合物和剩餘乙醇，再用10％蔗糖溶液進行8個體積交換。採用的滲濾筒可截留標示分子量為100,000道爾頓的物質。
在10％蔗糖中製備2.5mg/mL的拓撲替康溶液。藥物溶液和滲濾脂質體按4∶1的體積比合併，所得混合物的溫度升至70℃並連續攪拌一小時。然後用冰水浴迅速冷卻負載後混合物以中止活性藥物的負載。
用可截留標示分子量為100,000道爾頓的截留筒滲濾除去未包封的藥物。典型地，用10％蔗糖10mM組氨酸pH6.5作為交換緩衝溶液進行8-10個體積的交換。
通過測定紫外-可見吸收來確定藥物的濃度並將其稀釋至最終濃度。裝瓶前的最後步驟包括用0.22μm的濾器無菌分級過濾。
B．脂質體的特徵化採用體積排阻色譜法測定包封百分比，即空體積中的藥物(「脂質體藥物」)與從inclued和空體積中回收的總藥量的比值。用紫外-可見分光光度計測定藥物濃度。用準電性雷射散射法測定平均粒徑。用磷測定法確定總類脂量。結果見下表。
C．體內藥動學及效力按上述的方法部分中所述，給72隻小鼠接種癌細胞HT-29。腫瘤接種九天後，每周一次對動物進行下述方法中的一種的靜脈給藥治療生理鹽水；4mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼；25mg/kg游離拓撲替康；2mg/kg、5mg/kg和8mg/kg脂質體包封的拓撲替康。所有治療均每周一次靜脈濃注，共三次，具體為第9、16和23天。
如實施例2所述評估和檢測腫瘤大小，結果見表6和7及圖5A-5B。
實施例5脂質體包封的CKD-602的體內效力A．脂質體的製備和特徵化除了用CKD-602的藥物溶液外，其他按實施例4所述製備含有CKD-602的脂質體。如實施例4所述測定脂質體特徵，結果如下。
B．體內藥動學及效力按上述的方法部分中所述，給72隻鼠接種癌細胞HT-29。腫瘤接種11天後，每周對動物進行下述方法中的一種的靜脈給藥治療生理鹽水；4mg/kg脂質體包封的MPE-喜樹鹼；20mg/kg CKD-602；1mg/kg、2mg/kg和4mg/kg脂質體包封的CKD-602。所有治療均每周一次靜脈濃注，共三次，具體為第11、18和25天。
在實驗期間每周兩次檢測每隻動物的腫瘤大小以評估治療有效量。每周兩次監測每隻動物的體重以評估製劑的毒性。結果見表8和9及圖7A-7B。
儘管對本發明的具體實施方案作了描述，但是本領域技術人員容易理解那些針對本發明所做的變化和修改並不偏離本發明範疇。
權利要求
1．一種用於治療患者腫瘤的組合物，包括含有可成囊類脂和1-20摩爾％的用親水聚合物衍生化的可成囊類脂的脂質體，在聚合物能分布於脂質體雙層膜兩側上的條件下形成所述脂質體；和包封於脂質體中的至少0.10微摩爾藥物/微摩爾類脂的拓撲異構酶抑制劑，所述脂質體具有內/外離子梯度，足以使特定濃度的拓撲異構酶抑制劑保留在脂質體中。
2．如權利要求1的組合物，其中拓撲異構酶抑制劑選自包括喜樹鹼和喜樹鹼衍生物的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑。
3．如權利要求2的組合物，其中喜樹鹼衍生物選自於9-氨基喜樹鹼、7-乙基喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、10,11-亞甲二氧基喜樹鹼、9-氨基-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼、9-氯-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼、伊立替康、拓撲替康、(7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼，7-(4-甲基哌嗪亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)-喜樹鹼和7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼。
4．如權利要求1的組合物，其中拓撲異構酶抑制劑是選自6-[[2-(二甲基氨基)-乙基]氨基]-3-羥基-7H-茚並[2,1-c]喹啉-7-酮二鹽酸化物，阿佐特星和3-甲氧基-11H-吡啶[3』,4』-4,5]吡咯[3,2-c]喹啉-1,4-二酮的拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑。
5．如權利要求1的組合物，其中親水聚合物是分子量為500-5,000道爾頓的聚乙二醇。
6．如任一前述權利要求中的組合物，其中脂質體包括相變溫度在37℃以上的可成囊類脂。
7．如權利要求6的組合物，其中可成囊類脂選自氫化大豆卵磷脂、二硬脂醯卵磷脂和鞘磷脂。
8．如權利要求6的組合物，其中脂質體包括20-94摩爾％的氫化大豆卵磷脂、1-20摩爾％的用聚二乙醇衍生化的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺和5-60摩爾％的膽固醇。
9．如權利要求6的組合物，其中脂質體包括30-65摩爾％的氫化大豆卵磷脂、5-20摩爾％的用聚二乙醇衍生化的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺和30-50摩爾％的膽固醇。
10．如權利要求6的組合物，其中脂質體包括20-94摩爾％的二硬脂醯卵磷脂和1-20摩爾％的用聚二乙醇衍生化的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺。
11．如權利要求1-10中任一項的組合物，其中脂質體中包括多陰離子聚合物，所述聚合物能與所述拓撲異構酶抑制劑形成複合物。
12．如權利要求12的組合物，其中所述多陰離子聚合物選自右旋糖酐硫酸鹽、硫酸軟骨素A、聚乙烯磺酸和多磷酸。
13．一種用於拓撲異構酶抑制劑給藥的組合物，包括含有可成囊類脂的脂質體，並且脂質體的內/外離子梯度足以使藥物保留在脂質體中；和包封於脂質體中的濃度至少為0.20微摩爾藥物/微摩爾類脂的拓撲異構酶抑制劑。
14．如權利要求13的組合物，其中拓撲異構酶抑制劑是選自於MPE-喜樹鹼、拓撲替康和(7-(2-N-異丙基氨基)乙基)-(20S)-喜樹鹼的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑。
15．如權利要求13的組合物，其中拓撲異構酶抑制劑是選自於6-[[2-(二甲氨基)-乙基]氨基]-3-羥基-7H-茚並[2,1-c]喹啉-7-酮二鹽酸化物和3-甲氧基-11H-吡啶[3』,4』-4,5]吡咯[3,2-c]喹啉-1,4-二酮的拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑。
16．如權利要求13的組合物，其中脂質體中進一步包括多陰離子聚合物，所述聚合物能和所述拓撲異構酶抑制劑形成複合物。
17．如前述權利要求任一項的組合物用作治療腫瘤的藥物用途。
18．如權利要求1-16任一項的組合物在製備用於治療患者腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
描述了用於給予治療有效量拓撲異構酶Ⅰ抑制劑或拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ抑制劑的組合物。該組合物包括具有確定含水脂質體室的外表面和內表面的脂質體,脂質體含有可成囊類脂和用親水聚合物衍生化的可成囊類脂並且脂質體內外兩個表面為親水聚合物鏈的包衣層。包封於脂質體中的拓撲異構酶抑制劑的濃度至少為0.10微摩爾藥物/微摩爾類脂。
文檔編號A61K31/496GK1323199SQ99812207
公開日2001年11月21日 申請日期1999年10月15日 優先權日1998年9月16日
發明者J·L·司拉特, G·T·科爾波恩, P·K·沃爾金 申請人:阿爾薩公司