聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體的製作方法

2023-10-07 21:53:59 2

專利名稱：：聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及蛋白質聚乙二醇化修飾領域，更具體地說，涉及了一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)的製備和鑑定。
背景技術：
：天然人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)成熟蛋白具有174個胺基酸，分子量為19Kda。重組表達的人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)由於增加了一個起始密碼子(ATG,翻譯後為甲硫氨酸)，因此為175個胺基酸(如序列表所示)。重組人粒細胞集落刺激因子可誘導造血幹細胞的增值和分化，導致血液中的中性粒細胞數增加；另外還能刺激成熟中性粒細胞數從骨髓中釋出，並激活中性粒細胞的功能。因此自1991年起rhG-CSF已經廣泛用於治療因放療、化療等引起的中性粒細胞減少症，可以顯著改善中性粒細胞減少症的嚴重性和持續時間。但是和許多分子量小於30kDa的蛋白質藥物一樣，rhG-CSF在其代謝過程中易由腎小球濾過，在通過腎小管時又被其中的蛋白酵部分降解並從尿中排出，因而半衰期短。rhG-CSF血清半衰期只有2-4小時，為維持一定的療效需要每天注射，持續注射5-7天，不僅增加了病人的痛苦而且易引發一系列副反應(WelteK等，ProcNatAcadSci，82:1526-1530(1985);FramptonJE等，Drugs,48(5):731-60(1994))，這不僅增加了病人的痛苦，也增加了醫療費用。聚乙二醇(PEG)化學修飾是延長蛋白類藥物半衰期的一個有效途徑。聚乙二醇(簡稱PEG)是一種惰性、兩親、不帶電荷的柔性長鏈高分子聚合物，化學式為HO(CH2CH20)nCH2CH200H，n為聚合單元的個數。PEG分子量隨n的增加可由lkDa增至50kDa，有線性和分支兩種構型，已經作為多種藥物的安全載體用於臨床應用。PEG通過共價鍵與蛋白質連接，可與蛋白質分子中的氨基(位於N末端的氨基或賴氨酸殘基)或者巰基(位於半胱氨酸)反應對蛋白質分子進行修飾。該修飾可以有效地改變蛋白類藥物在體內的分布和藥物學特性，延長蛋白質藥物的血藥濃度，同時還可降低免疫原性。目前已經有多種聚乙二醇藥物應用於臨床，如聚乙二醇單修飾重組人幹擾素a2a(PEG-IFNa2a)(BailonP等，BioconjugateChem.，12:195-202(2001))、聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)(HarrisJM等，ClinPharmacokinet，40:539-551(2001))等。聚乙二醇(PEG)分子必須通過一個活化基團活化，才能與蛋白質表面的反應基團反應，以共價鍵形式連接到蛋白質分子上。KinstlerOlafB等(美國專利US5985265,1999年公開)研究重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的PEG修飾時就發現，當採用6KD的mPEG-SCM(N-hydroxysuccinimidylesterofcarboxymethylmethoxypolyethyleneglycol)修飾時，最終製備獲得的單一修飾的PEG-rhG-CSF是由N端，Lys35，Lys41分別結合有一個PEG分子組成的混合物。進一步分析這三種不同的PEG-rhG-CSF分子，發現N端修飾的PEG-rhG-CSF活性最高，保留了原有活性的68%，Lys35和Lys41修飾產物活性分別為56《和21M，而且Lys35修飾產物是不穩定的，在體外很容易被降解。從中我們可以發現，用現有方法對rhG-CSF進行PEG修飾以後，rhG-CSF的生物學活性都會下降，根據不同修飾位點和修飾數目，其體外活性可能下降幾倍到幾十倍。因此，如能製備出一種活性和穩定性更高的PEG化rhG-CSF產物，以降低rhG-CSF的臨床用藥頻率和減少其毒副作用，具有很重要的臨床和經濟意義。
發明內容本發明的一個目的是提供一種具有更高生物學活性和穩定性的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rnihG-CSF)。本發明的另一個目的是改進現有PEG修飾重組人粒細胞集落刺激因子技術，提供高活性的聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體。本發明的另一個目的是提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體的製備方法。本發明的另一目的是提供一種包含上述聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體的藥物製劑及其在製備治療因放療、化療等引起的中性茅立細胞減少症藥物中的應用。本發明是通過如下技術方案實現最終目的通過點突變技術，將重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)18位的半胱氨酸(cys)突變為絲氨酸(ser)，再通過噬菌體展示技術表達N端突變的重組人粒細胞集落刺激因子(其中18位的半胱氨酸已突變為絲氨酸)，然後利用重組人粒細胞集落刺激因子受體篩選出具有高生物學活性的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)。突變後的nnhG-CSF與帶有氨基反應基團的聚乙二醇(PEG)反應，經分離純化，獲得了活性更高的聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一個由4個a-螺旋組成的結構(Hill等，PNAS.，5167-5171(1993))，共有兩對半二硫鍵，其中37位和43位的半胱氨酸，65和75位的半胱氨酸分別組成二硫鍵，只剩下18位的半胱氨酸未成對；此外N端並不在G-CSF的結構區內，並且根據文獻報導(Schrader等，PNAS.，2458-2462(1986))，造血細胞因子具有N端結構同源性。因此，通過定點突變技術先將18位的半胱氨酸突變成絲氨酸，可以增加蛋白復性收率和穩定性。然後通過基因突變技術獲得N端突變的rmhG-CSF。為了得到高活性的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，需要利用噬菌體展示技術對突變後的rmhG-CSF進行篩選。噬菌體展示技術是目前一種廣泛使用的高親和力和高活性蛋白質篩選技術，該技術能夠在絲狀噬菌體表面上表達多種隨機的蛋白質，再經過與特定配基結合、洗脫和重複篩選，最後得到與受體或者配體有髙親和力蛋白質。本發明中，為了構建具有高生物活性和穩定性的rmhG-CSF，首先我們利用點突變技術將rhG-CSF18位的半胱氨酸突變為絲氨酸，再用PCR法創建一編碼N端序列被隨機替代的rmhG-CSFcDNA文庫(具體方法見實例1)，然後通過噬菌體展示技術，用重組人粒細胞集落刺激因子受體作為配體，通過多輪篩選後得到了21個活性基本保留的rmhG-CSF，其胺基酸序列見表1(其中克隆編號0為未突變的rhG-CSF)，其體外活性高於rhG-CSF(見表2)。生物學活性的測定可參照2005年版《中國藥典》第三部附錄58所示的方法。表121個高活性rmhG-CSF的N端胺基酸序列克隆編號N端17個胺基酸序列0MTPLGPASSLPQSF"K7MAPKRGTSSPFAELFLK13MT"ASPTGRAFSMLKL619MPKRTSTPFTEQLMRK26MFKPNDQEIHPSTWVYD31MYSSKARNDFSTWNIQE37MVGAGSHDNRSKRVA56MAPTYRASSPQSF匕LK63MRSKFQSVIWRAQEVD65MSFTKMPSTRRASSPTY70MAKYFNDQIKFSVRAS101MTPSQWSFIHEQFGATS112MAFKYSFGTYRTKRSYW140MLQALFAYRDNQKNEN151MTDAKTSKENAPSRKES169MAYTPRSTKSNGFDA170MFVASKTVRNQTDGTNP172MEAASTYWMDVEQDNQ173MPKSAYRVWIWYIHAE177MKVYSTAVSDTLPRDSK189MAMTAPSPYFRIPKGA195MEPKRRTTRTKDHYHTT表2G-CSF和rmhG-CSF的體外生物學活性比較SpecificbioactivityRelative克隆編號(X108IU/mg)bioactivity(%)00.8210071.28156131.17143191.25152261.16141311.31160371.16142561.53186631.09133651.27155701.371671011.301581121.121371401.341631511.051281691.351651701.401711721.391701731.211481771.071301891.161411951.11135篩選到的rmhG-CSF蛋白可以通過原核生物或真核生物宿主基因重組技術表達外源性DNA序列而得到，合適的原核生物宿主包括各種細菌(如Ecoli.);合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞)。依據所用的宿主的不同，rmhG-CSF表達產物可能會被哺乳動物或其它真核細胞中的碳水化合物所糖基化修飾。對於本發明所用的人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，優選的採用原核表達系統或酵母表達系統的產物，例如￡coW或甲醇酵母表達系統。通過原核生物或真核生物宿主基因重組技術表達外源性DNA序列而得到的rmhG-CSF，其中小部分為有活性的可溶表達的rmhG-CSF(可用於測活)，絕大部分為無活性的包涵體，需要通過合適的破菌、復性和分離純化方法，才能得到合格的rmhG-CSF。如中國專利96106418.8所示，原核表達rmhG-CSF通過中空纖維超濾透析方式復性，再經過離子交換層析、疏水柱層析和分子篩層析順序組合，最終獲得的製品含有至少95%以上的rmhG-CSF。通過控制合適的反應條件，帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子可與這些改構的高活性的rmhG-CSF蛋白序列中存在的a-氨基或e-氨基發生定點修飾反應，例如可與N末端甲硫氨酸殘基上的a-氨基或第35或第41位賴氨酸殘基上的e-氨基反應。聚乙二醇分子詳細可參考StevenM(ModificationofCD4ImmunoadhesinwithMonomethoxypoly(ethyleneglycol)aldehydeviaReductiveAlkylation,Bioconjugate.Chem,1994，5:133-140)論文中第134頁表1中列舉的PEG種類以及姜忠義等(蛋白質和肽類分子的聚乙二醇化化學，《有機化學》2003年第23巻12期1340-1347)論文中所描述的那些PEG衍生物，包括但不局限於PEG琥珀醯亞胺碳酸酯，PEG對硝基苯碳酸酯，PEG琥珀醯亞胺琥珀酸酯，PEG碳醯咪唑，PEG苯並三唑碳酸酯(BTC-PEG),PEG苯基琥珀醯亞胺碳酸酯，甲氧聚乙二醇羥琥珀醯酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate,mPEG-SC)，甲氧聚乙二醇醛如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)、甲氧聚乙二醇丁醛等，以及將兩個線性的BTC-PEG或mPEG-SC鏈連到賴氨酸的a-氨基和e-氨基形成的分支狀的PEG衍生物等。聚乙二醇氨基反應試劑可以和rrahG-CSF的氨基基團特異性的結合,分離純化獲得聚乙二醇定點單修飾的產物。這些活性聚乙二醇可以是分子量大於5kDa的任意大小的PEG，其形狀可以是單鏈或者分支狀，其中優選分子量在5kDa到40kDa之間的線性或分枝PEGs,更優選分子量為20kDa的單鏈聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD2,)。本發明還提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的製備方法，其包括如下步驟(1)在含水介質中，帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子與重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)中的氨基反應；(2)任選地從反應混合物中分離聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的產物。較合適的修飾反應條件是rmhG-CSF濃度為0.5-20毫克/毫升，優選3-6毫克/毫升。蛋白質:PEG分子的比例在1:1-1:20之間，優選1:3-l:5之間。pH條件為酸性、中性或鹼性，優選為酸性或鹼性，更優選為pH4.5-6.0或pH7.5-9.5。帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子可選用上述的那些PEG衍生物，優選甲氧聚乙二醇羥琥珀醯酯(例如甲氧聚乙二醇羥琥珀醯酯乙酸酯(mPEG-succiru阻dy1carbonate,mPEG-SC)或甲氧聚乙二醇醛，例如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)或甲氧聚乙二醇丁酵等。在酸性條件下(優選pH4.5-6.0),由於賴氨酸殘基上e-氨基和N-末端a-氨基的pKa差異，在反應溶液中未質子化的N-末端a-氨基的分子數相對要比賴氨酸殘基上e-氨基多，因而帶有未共用電子對的N-末端a-氨基更容易對上述優選的聚乙二醇衍生物(例如聚乙二醇丙醛)的羰基發生親核進攻，通過西佛鹼的形成聚乙二醇丙醛可以偶聯到a-氨基上，在還原劑如氰基硼酸鈉的催化下形成穩定的胺鍵(其反應原理如下所示)因此，在足夠酸性的條件下我們可以得到比較均一的rmhG-CSF的N-末端a-氨基被聚乙二醇單修飾的產物。如果提高反應的pH值(例如pH7.5-9.5)，則發生在非N端的(例如在lys35或lys41殘基e-氨基位點單修飾形成穩定的胺鍵)聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體的比例會比較大，可以通過合適的分離純化方法分離得到單修飾的產物。經修飾反應後獲得的為含有PEG-rmhG-CSF的混合物，其中含有PEG-rmhG-CSF、未反應的活性PEG分子和rmhG-CSF等。需要通過合適的分離純化方法，例如通過離子交換層析和分子篩層析的組合來純化上述混合物體系，最終獲得的製品含有至少90%以上的PEG-mihG-CSF和至多10%的未發生聚乙二醇化的rmhG-CSF，優選製品含有至少95%以上的PEG-rmhG-CSF和至多5%的未發生聚乙二醇化的rmhG-CSF，更優選製品含有至少99%以上的PEG-rmhG-CSF和至多1%的未發生聚乙二醇化的rmhG-CSF。so=另外，在分離純化聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體中，發現聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體中(N端修飾)的活性不如某些聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體中(非N端修飾)，具體例子見實例2。因此，我們可以適當提高反應的pH條件，例如鹼性，優選pH7.5_9.5，以增加反應產物中發生在非N端的(例如在lys35或lys41殘基e-氨基位點單修飾)聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體的比例，然後通過分離純化得到這些聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體本發明所製備的PEG-rmhG-CSF，與以前的方法相比，由於採用了點突變技術、N端隨機突變技術和噬菌體展示技術，得到了高活性和高穩定性的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，再通過和聚乙二醇氨基反應試劑相結合的技術方案，因而在提高經聚乙二醇單修飾的蛋白質活性和穩定性方面獲得了顯著的有益效果。對採用上述方法形成的蛋白分子進行檢驗，得到如下結果(1)提高了體外生物學活性，PEG-rmhG-CSF的活性與rhG-CSF活性相當，高於PEG-rhG-CSF的活性；而且其體外穩定性更高，在pH4.0和4'C條件下可存放3個月而不發生降解。(2)體內活性實驗明顯長效，動物實驗證實，其體內半衰期延長到了14.6小時，比未修飾的G-CSF(T1/2=2.2小時)提高了7倍，達到了長效、減少給藥次數的目的。本發明還提供了一種含有聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)的藥用組合物，該藥物製劑含有上述的有效量的生物製品和藥用稀釋劑、佐劑或載體等。該藥劑可用於治療因放療、化療等引起的中性粒細胞減少症，由於半衰期延長，因此可實現每周只給藥l次。優選製劑為注射水針，每毫升含6mgmPEG-rmhG-CSF，0.35mg乙酸鈉，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg的氯化鈉，pH為4.0。以下實例將進一步說明本發明。附圖1SeqIDNo.卜SeqIDNo.21為表1所示21種陽性克隆中重組人粒細胞集落刺激因子突變體的175個胺基酸序列。附圖2圖2為rmhG-CSF的PEG修飾和純化的SDS-PAGE電泳圖.，其中11l為marker,從上到下為97，67，41，33，21，14KDa;2為純化的rmhG-CSF;3為rmhG-CSFPEG修飾反應混合物；4為ResourceS洗脫峰1;5為ResourceS洗脫峰2;6為ResourceS洗脫峰3，附圖3為ReourceS分離純化PEG-rmhG—CSF的層析圖，洗脫峰1為修飾位點在第41位賴氨酸殘基的￡-氨基上的PEG-rmhG-CSF(lys41),洗脫峰2為修飾位點在第35位賴氨酸殘基的e-氨基上的PEG-rmhG-CSF(lys35),洗脫峰3為修飾位點在N-末端甲硫氨酸a-氨基上的PEG-rmhG-CSF(N端)附圖4為小鼠皮下給藥後rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的血藥濃度-時間圖附圖5為小鼠皮下給藥後rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和空白對照的白細胞總數變化情況具體實施例方式實例1高活性重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的獲得(1)突變的重組人粒細胞集落刺激因子基因rmhG-CSF18的獲得為了獲得第18位Cys突變為Ser的重組人粒細胞集落刺激因子基因rmhG-CSF18，首先我們要先獲得重組人粒細胞集落刺激因子基因rhG-CSF。rhG-CSF基因的克隆方法可參考中國專利CN96106418.8實施例1。以獲得的cDNA為模板，設計引物如下上遊引物l:5GMTTCATGACACCATTAGGC-3，下遊引物2:5，-AMGGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3，，用常規PCR方法進行目的基因的擴增。PCR產物經回收、純化，裝到pGEM-T載體，轉化DH5a感受態細胞，經藍白斑篩選，將陽性克隆送測序檢領!l。將測序正確的克隆基因用EcoRI和BaraHI從pGEM-T上切割回收，即成功獲得了rhG-CSF基因。以上述成功獲得的rhG-CSF基因為模板，設計引物如下上遊引物3:5GAATTCATGACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTCCTTAGAGCAAGTGAGG-3，該引物與人G-CSFcDNA負鏈的第169個核苷酸互補，其中突變了編碼第18個胺基酸的密碼子。下遊引物2:5'-AAAGGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3'該引物與人G-CSFcDNA正鏈的第506534個核苷酸互補(上海生工生物工程12技術服務有限公司合成)，用常規PCR方法進行目的基因的擴±曾。PCR產物經回收、純化，裝到pGEM-T載體，轉化DH5a感受態細胞，做藍白斑篩選，將陽性克隆送測序檢測。將測序正確的克隆基因用EcoRI和BamHI從pGEM-T上切割回收，即成功獲得了第18位的Cys突變為Ser的重組人粒細胞集落刺激因子基因rmhG-CSF18。(2)高活性重組人粒細胞集落刺激因子rmhG-CSF的獲得為了獲得高活性的重組人粒細胞集落刺激因子，我們對目前市場上流通的重組人粒細胞集落刺激因子蛋白進行突變篩選。具體操作如下a.展示隨機突變的重組人粒細胞集落刺激因子基因(rmhG-CSF)噬菌體文庫構建據相關文獻報導，重組人粒細胞集落剌激因子的生物活性的關鍵區域是在蛋白的N端，為了獲得具有高生物活性的重組人粒細胞集落刺激因子(rmhG-CSF)，我們用隨機突變的方法來對重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進行突變來獲得rmhG-CSF的cDNA文庫。為了對重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進糹亍隨機突變，設計了一個隨機的引物庫，如下隨機上遊引物5GMTTCATG---------------------TGCTTAGAGCAA-3，；其中"---------------------"代表的是48個鹼基的隨機組合，來編碼隨機的16個20種人體常見的胺基酸，"TGCTTAGAGCAA"是與編碼重組人粒細胞集落刺激因子的第18-21個胺基酸的密碼子互補的鹼基序列。該引物序列在合成過程中形成一個隨機的引物庫。下遊引物2:5，-嵐GGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT—3，。為了對重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進^亍隨機突變，我們重新構建了一個PCR模板，即以實例一中獲得的rmhG-CSF'8基因為模板，以上遊引物4和下遊引物2為引物對進行常規的PCR基因擴增，PCR產物經回收、純化，裝到pGEM-T載體，轉化DH5a感受態細胞，經藍白斑篩選，將陽性克隆送測序檢測。將測序正確的克隆基因用EcoRI和BamHI從pGEM-T上切割回收，即獲得了對重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進行隨t幾突變的前模板基因rtnhG-CSF0。上遊引物4:5，-GAATTCTCCTTAGAGCAAGTGAGGAAGATC-3'。然後將獲得的rmhG-CSFe和隨機上遊引物等摩爾混合，利用低溫PCR條件進行退火連接，並以此連接產物作為最終的對重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進行隨機突變的模板基因，在此連接體系中在補加隨機上遊引物和下遊引物2，進行常規PCR進行基因擴增。最終的PCR產物回收後用限制性內切酶EcoRI和BamHI切割，將一部分回收的酶切產物用DNA連接酶和同樣用EcoRI和BamHI切割的噬菌粒載體pUC118連接，將連接產物轉化TG1感受態細胞，轉化後的感受態細胞塗布含有A即和IPTG及X-gal的2XYT平板(配方見分子克隆第2版附錄，冷泉港出版社)，37'C培養過夜，挑取白色的單克隆擴增培養後少量提取質粒，進一步酶切鑑定證實已獲得重組的噬菌粒pUC118-重組人粒細胞集落刺激因子(rmhG-CSF)(具體的操作參見分子克隆)。含重組噬菌粒的大腸桿菌TG1培養液以10niL/L接種於含Amp的2XYT培養基中，37'C搖床培養至A600nm值為0.6，加入輔助噬菌體M13K07繼續培養1h，4000g離心15min，收集的菌體加入到新鮮的含Amp，Kan的2XYT培養基中，30。C搖床培養14~18h。將上述培養物10800g，4'C離心10min，收集上清。加入1/6體積PEG/NaCl(200g/LPEG8000,2.5mol/LNaCl)，充分混勻後4。C靜置lh，10800g，4。C離心30min'TBS溶解，加入1/6體積的PEG/NaCl，充分混勻後(TC放置20min，10800g，4。C離心30min，TBS溶解，10800g，4°C離心10min，吸取上清，即為表面呈現隨即突變的重組人粒細胞集落刺激因子(rmhG-CSF)的重組噬菌體。b.高活性的人粒細胞集落刺激因子(rmhG-CSF)文庫篩選取提前配製好含0.1g/L疊氮鈉的封閉液14mL稀釋PEG沉澱的16ml重組噬菌體，室溫下孵育IO~15min後，取20mL加入G-CSF受體(R&D公司)包被的錐形培養瓶中，37。C孵育2h。PBS，PBST洗培養瓶，然後將10mL培養至對數生長期的TG1細胞加入上述免疫吸附後的培養瓶內，37"孵育lh，讓吸附的重組噬菌體感染TG1細胞，完成第一輪篩選。將10raL感染了重組噬菌體的TGl細胞轉移至50mL細菌培養管中，加氨苄青黴素至100mg/L、葡萄糖至終濃度20g/L，再加入輔助噬菌體M13K07，37°C，250r/min震蕩培養1h，同前述方法一樣進行又一輪篩選.用相同方法完成第3、第4輪篩選，再感染TG1細胞，得到富集的噬菌體克隆。隨機挑選經篩選後的單克隆500個，利用NFS-60細胞的生長對G-CSF的依賴性進行體外生物活性檢測，以天然的G-CSF為對照，MTT色素還原法測定樣品的生物學活性。結果顯示在這些克隆中有21個克隆的生物活性和天然的G-CSF相似或者比天然的G-CSF活性高。選取這21個陽性克隆進行DNA序列分析，結果如下表3表321個高活性rmhG-CSF的N端基因序列克隆編號N端鹼基序列0ATGACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAG7ATGGCACCAAAGCGCGGTACCAGCTCCCCATTCGCAGAACTGTTCCTCAAG13ATGACACTATTAGCCTCCCCGACGGGACGCGCCTTTAGCATGCTGAAGCTC19ATGCTACCAAAGCGCACATCGACCCCCTTCACAGAACAGTTGATGAGMAG26ATGTTCMGCCCAACGACCAAG嵐TCCACCCMGTACCTGGGTATATGAC31ATGTACAGCAGCAAAGCCAGTAACGACTTCAGTACGTGGMTATCCMGAG37ATGGTCGGAGCCGGTAGTCTTCATGACAACCGCAGT組CGCGTCGCTCTA56ATGGCACCAACATACCGTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAG63ATGAGATCCAAATTCCAATCCGTAATATGGCTAAGAGCTCAAGAAGTCGAC65ATGAGCTTCACAAAGATCCCCTCGACTAGMGAGCATCTAGTCCMCATAC70ATGGCCAAATACTTCMCGATCAAATTCTGAAATTCTCGGTCAGAGCCAGT101ATGACACCATCGCAATGGAGTTTTATCCACGMCAGTTCGGCGCMCTTCC112ATGGCATTCMGTATTCCTTCGGGACATACAGAACTAMCGGTCTTACTGG140ATGCTACMGCGTTATTTGCCTATCGGGACAACCAGAAGMTGAGTTGAAC151ATGACCGACGCGAAMCTTCTAMGAGMTGCGCCATCCAGMAGGAGTCA169ATGGCATATACGCCGAGMGTACCAAGTCTTTGAACGGACTGTTCGACGCA170ATGTTCGTCGCGAGTAAAACCGTTAGAAACCMACTGACGGGACTMCCCC172ATGGAAGCCGCAAGTACCTATTGGATGGACGTTGAGCAAGATAACCTGCAA173ATGCCGMAAGTGCCTACAGAGTCTGGATTCTGTGGAACATCCACGCCGM177ATGAAGGTCTATTCCACAGCTGTATCCGATACGCTTCCCAGGGATAGCAAG189ATGGCCATGACAGCACCTTCCCCCTATTTTCTACGCATACCCAAGGGCGCC195ATGGAACCTAAGCGTCGTACAACAAGGACTAAAGACCATTATCACACAACC其相應的胺基酸序列如下表所示表421個高活性rmhG-CSF的N端胺基酸序列克隆編號N端17個胺基酸序列0MTPLGPASsPQSFLK7MAPKRGTSsPFAELFK13MTLLASPTGRAFSMK19MLPKRTSTPFTEQLMRK26MFKPNDQEIHPSTWVYD31MYSSKARNDFSTWNIQE37MVGAGSHDNRSKRVA56MAPTYRASSPQSFK63MRSKFQSVIWRAQEVD65MSFTKMPSTRRASSPTY70MAKYFNDQIKFSVRAS101MTPSQWSFIHEQFGATS112MAFKYSFGTYRTKRSYW140MLQAFAYRDNQKNEN151MTDAKTSKENAPSRKES169MAYTPRSTKSNGFDA170MFVASKTVRNQTDGTNP172MEAASTYWMDVEQDNLQ173MPKSAYRVWIffYIHAE177MKVYSTAVSDTPRDSK189MAMTAPSpYFRIPKGA195MEPKRRTTRTKDHYHTTc.高活性的重組人粒細胞集落刺激因子(rmhG-CSF)在原核系統中的表達、純化和性質鑑定取上述21個包含高活性的突變的人粒細胞集落刺激因子(mihG-CSF)基因的16陽性克隆參照中國專利(96106418.8)進行克隆表達、純化和性質鑑定，最後獲得純度、和活性等都符合要求的rmhG-CSF，其活性測定數據見表2(生物學活性的測定可參照2005年版《中國藥典》第三部附錄58所示的方法)。選取活性最高的56號克隆參照中國專利(96106418.8)進行克隆表達和純化，以用於下一步的PEG修飾實驗。實例2PEG-rmhG-CSF的製備a.rmhG-CSF的PEG修飾rmhG-CSF的PEG修飾準備50ml2mg/ml的rmhG-CSF(陽性克隆56號)，100mMPBS(pH7.5)，然後加入300rag平均分子量為20KDa的MPEG-ALD(聚乙二醇-丙醛，直鏈)和20raMNaCN朋4，在4"下輕輕攪動6h後，SDS-PAGE分析結果表明4個小時後rmhG—CSF的修飾率己經達到85W以上(圖2，泳道3)。b.PEG-rmhG-CSF的製備然後用注射用水把反應液稀釋到1mg/ml，pH以稀鹽酸調至4.0，過Resource30S離子交換柱(16X10)，在0-0.5MNaCl，20mMNaAc(pH4.0)中梯度洗脫，其中三種單修飾的PEG-rmhG-CSF在2%-40%梯度洗脫下，分別為洗脫峰l，2，3。收集和合併峰(圖3)，SDS-PAGE電泳顯示該峰為單條帶(圖2，泳道4，5，6)，純度均在95%以上。c.PEG-rmhG-CSF單修飾異構體的鑑定根據KinstlerOlafB等(美國專利US5985265,1999年公開)專利文獻說明書15-16頁關於PEG蛋白質鑑定的方法，鑑定得到洗脫峰1為PEG-rmhG-CSF(lys41)，洗脫峰2為PEG-rmhG-CSF(lys35),洗脫峰3為PEG-rmhG-CSF(N端)實例3PEG-rmhG"CSF等生物學活性的分析體外生物活性的測定採用MTT方法((WelteK等，ProcNatAcadSci，82:1526-1530(1985))。具體步驟為在96孔細胞培養板中接種一定濃度的細胞懸液(50uL/孔)，將rhG-CSF標準品(中國藥品生物製品檢定所)和修飾rhG-CSF樣品系列對倍稀釋，各取50uL加入培養板相應孔中。設陽性對照、陰性對照(不含rhG-CSF)和空白對照(只含培養液)，37°C，5%C02培養36-48h，加MTT溶解液100wL/孔，次日測定各孔A5;。/AM。值。經生物學活性測定顯示(表5)修飾前的rhG-CSF和rmhG-CSF分別為0.82xl08IU/mg和1.53x108IU/mg，後者活性高出86%，說明我們篩選到高活性的rmhG-CSF;而修飾後的PEG-rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF(N端)、PEG-rmhG-CSF(lys35)PEG-rmhG-CSF(lys41)活性分別為0.58x10sIU/mg、0.71xl08IU/mg、0.80xl08IU/mg、0.83x10sIU/mg，PEG-rmhG-CSF的活性比PEG-rhG-CSF高，說明得到了高活性的PEG-rmhG-CSF。而且PEG-rmhG-CSF(非N端修飾)，包括PEG-rmhG-CSF(lys35)和PEG-rmhG-CSF(lys41)的活性比PEG-rmhG-CSF(N端修飾)的活性高，說明在該rmhG-CSF的PEG修飾過程中，N端修飾由於阻礙了受體和配體的結合，活性反而降低。而且，初步實驗證明，在pH4.0和4。C條件下PEG-rmhG-CSF(N端)、PEG-rmhG-CSF(lys35)和PEG-rmhG-CSF(lys41)放置3個月，SEC-HPLC檢測未發生降解，顯示其在體外比較穩定。表5各種G-CSF體外生物學活性比較SpecificbioactivityRelative(X108IU/mg)bioactivity(%)rhG-CSF0.82100PEG-rhG-CSF0.5871rmhG-CSF1.53186PEG-rmhG-CSF(N端)0.7187PEG-rmhG-CSF(lys35)0.8098PEG-rmhG-CSF(lys41)0.83101實例4PEG^rmhG"CSF體內藥物代謝動力學和藥效動力學的分析藥代動力學的測定採用雙抗體夾心ELISA法檢測樣品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF(PEG-rmhG-CSF(lys41)為例，在這個實驗中也簡稱為PEG-rmhG-CSF)以的血藥濃度。每組三隻18~22g雄性SPF級ICR小鼠，參照表6進行注射和採集血樣後，再將血樣離心30min後分離血清，-20'C保存待測。用雙抗體夾心ELISA法檢測樣品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的血藥濃度，具體操作參見HumanG-CSFDuoSet試劑盒(R&DSystems)的操作手冊。得到標準品的數據用MicroCalOrigin軟體中的四參數邏輯曲線繪製標準曲線，並求回歸方程及相關統計參數；用MicrosoftExcel2003軟體將樣品數據代入標準曲線的回歸方程計算相關數值並作圖；最後用3P87軟體進行曲線擬合併計算主要藥代動力學參數。表6皮下給藥和取樣方法樣品動物數量劑量給藥給藥取樣時間途徑時間39mg/kgSCDl0，0.5,2，4，8，12，24，48，72，96，120h30lmg/kgSCDl0,5，15,30min，1,2，4，8,12，24,48h*SC=subcutaneous;Dl=firstday結果rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF小鼠皮下給藥(subcutaneous,SC)後的血藥濃度-時間數據主要藥動學參數見表7，PEG-rmhG-CSF與rhG-CSF在小鼠體內的血藥濃度-時間曲線比較見圖4。從表7中可看到rhG-CSF和PEG-rnihG-CSF血清中藥物的半衰期(T1/2)分別為2.2h和14.8h,後者是前者的7倍；PEG-rmhG-CSF的AUC值為14489nghml-1，是rhG-CSF的16倍；從圖3的血藥濃度-時間曲線圖可直觀看出，達峰時間PEG-rmhG-CSF明顯大於rhG-CSF，並且在70h後在血液中可以檢測到PEG-rmhG-CSF的血藥濃度，血藥濃度的波動顯著減少。從上述藥代參數對比來看，PEG修飾技術確實可以延長rhG-CSF的半衰期，從而達到長效的目的。表7小鼠皮下給藥後rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的藥代參數valueparameter-—rhG-CSFPEG—rmhG-CSFRouteSCLagtimeH0.032±0.0041.449±0.034Tl/2H2.212±0.02414.845±0.378T(peak)H1.365±0.21420.378±0.81819PEG-rmhG-CSFrhG-CStableseeoriginaldocumentpage20Abbreviations:SC=subcutaneous;T1/2=terminalhalf-life;T(peak)=timeofmaximumconcentration;C(max)=maximumconcentration;AUC=areaunderthecurve;CL/f(s)=clearanceoverbioavailability;V/f=volumeofdistributionusingtheterminalphase.藥效動力學的分析自中科院上海實驗動物中心購入1923glCR小鼠245隻(125隻雄性，120隻為雌性)，除正常對照組注射等量的生理鹽^C外，其餘小鼠注射環磷醯胺lmg/10g體重，連續3天，隨機取正常和造模小鼠5隻，經測試造模成功。將造模成功小鼠隨機分成3組，分組和給藥見下表8，給藥劑型為水針，每毫升含6mg的mPEG-rrahG-CSF，0.35mg乙酸鈉，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20，和0.02mg的氯化鈉，pH為4.0。採集各組給藥後D2、D4、D6、D8天各5隻小鼠血樣進行血細胞計數和白細胞分類計數和評價。表8分組和給藥tableseeoriginaldocumentpage20結果如下表9、圖5分別為小鼠皮下給藥後rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和對照的白細胞總數表和圖。從中可看出PEG-rmhG-CSF對環磷醯胺引起的小鼠白細胞減少症有升白作用，其5天一次注射的效果與每天注射的rhG-CSF效果相當。表9小鼠皮下給藥後rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和對照的的白細胞總數tableseeoriginaldocumentpage20序列表〈110〉杭州九源基因工程有限公司聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體〈160〉1〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉175〈212〉PRT〈213〉智人(Homosapiens)1MetThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeu151015LysCysLeuGluGinValArgLyslieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu202530GinGluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeu354045ValLeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProLeuSerSer505560CysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHis65707580SerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylie859095SerProGluLeuGlyProThrUuAspThrLeuGinLeuAspValAla100105110AspPheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAla115120125ProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAla130135140PheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer145150155160PheLeuGluValSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro16517017權利要求1、一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體，其特徵在於(1)所述的重組人粒細胞集落刺激因子突變體胺基酸序列與SeqIDNo.1-SeqIDNo.21任一項所示的胺基酸序列相同；(2)所述的聚乙二醇為帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子，其定點結合於重組人粒細胞集落刺激因子突變體蛋白序列中的α-氨基或ε-氨基。2、根據權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體，其特徵在於:所述的聚乙二醇分子為PEG琥珀醯亞胺碳酸酯、PEG對硝基苯碳酸酯、PEG琥珀醯亞胺琥珀酸酯、PEG碳醯咪唑、PEG苯並三唑碳酸酯(BTC-PEG)、PEG苯基琥珀醯亞胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羥琥珀醯酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate,mPEG-SC)、甲氧聚乙二醇醛或將兩個線性的BTC-PEG或mPEG-SC鏈連到賴氨酸的a-氨基和e-氨基形成的分支狀的PEG衍生物等。3、根據權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落剌激因子突變體，其特徵在於(1)所述的重組人粒細胞集落刺激因子突變體胺基酸序列與SeqIDNo.7所示的胺基酸序列相同；(2)所述的聚乙二醇為甲氧聚乙二醇丙醛，其與重組人粒細胞集落刺激因子突變體蛋白序列中N末端甲硫氨酸殘基上的a-氨基反應後形成胺鍵相連。4、根據權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體，其特徵在於(1)所述的重組人粒細胞集落剌激因子突變體胺基酸序列與SeqIDNo.7所示的胺基酸序列相同；(2)所述的聚乙二醇為甲氧聚乙二醇丙醛，其與重組人粒細胞集落刺激因子突變體蛋白序列中第35位賴氨酸殘基上的e-氨基反應後形成胺鍵相連。5、根據權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體，其特徵在於(1)所述的重組人粒細胞集落剌激因子突變體胺基酸序列與SeqIDNo.7所示的胺基酸序列相同；(2)所述的聚乙二醇為甲氧聚乙二醇丙醛，其與重組人粒細胞集落刺激因子突變體蛋白序列中第41位賴氨酸殘基上的e-氨基反應後形成胺鍵相連。6、權利要求1-5中任一項所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體在製備治療因放療、化療等引起的中性粒細胞減少症藥物中的應用。7、一種含有如權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體的生物製品，其特徵在於所述製品含有至少90%以上的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體和至多10%的未發生聚乙二醇化的重組人粒細胞集落刺激因子突變體。8、一種製備如權利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體的方法，其包括如下步驟(1)在含水介質中，帶有氨基反應基團的聚乙二醇分子與重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)中的氨基反應；(2)任選地從反應混合物中分離聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的產物。9、根據權利要求8所述的方法，其特徵在於重組人粒細胞集落刺激因子突變體:聚乙二醇分子的比例在1:1-1:20之間。10、重組人粒細胞集落刺激因子突變體，其胺基酸序列與SeqIDNo.1-SeqIDNo.21任一項所示的胺基酸序列相同。，全文摘要本發明涉及一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)的製備和鑑定。通過點突變技術，將重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)18位的半胱氨酸(cys)突變為絲氨酸(ser)，再通過噬菌體展示技術表達N端突變的重組人粒細胞集落刺激因子(其中18位的半胱氨酸已突變為絲氨酸)，然後利用重組人粒細胞集落刺激因子受體篩選出具有高穩定性和生物學活性的重組人粒細胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)。突變後的rmhG-CSF與帶有氨基反應基團的聚乙二醇(PEG)反應，經分離純化，獲得了活性和穩定性更高的聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)。文檔編號C07K1/00GK101602801SQ20081006251公開日2009年12月16日申請日期2008年6月13日優先權日2008年6月13日發明者劉曉妮,單劍峰,徐飛虎,戎亞雯,方井晉,琳朱,汪軍遠,王同映,王昌梅,榮金申請人:杭州九源基因工程有限公司