一種定點修飾n-末端的聚乙二醇化生長激素拮抗劑及其製備方法

2023-10-07 23:20:49 1

專利名稱：一種定點修飾n-末端的聚乙二醇化生長激素拮抗劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及一種定點修飾N-末端的聚乙二醇(PEG)化生長激素拮抗劑，以及其製備方法。
背景技術：
生長激素的主要作用在於促進生長，涉及調節身體的生長，以及調節蛋白質、碳水化合物和脂類的代謝。生長激素的代謝作用由胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)介導。垂體生長激素腺瘤是常見的垂體腫瘤之一，由於生長激素(GH)過度分泌、IGF-1濃度增高，導致巨人症和肢端肥大症，其病亡率可高達20%-30%。目前的治療方法主要是減少或抑制生長激素的分泌，以降低生長激素的水平，防止生長激素的過度分泌，但是治療效果不佳。生長激素拮抗劑(GHA)可通過阻止生長激素與其受體(GHR)的結合，阻止後續的信號轉導，降低血漿IGF-1的水平，從而達到治療的目的。GHA是通過置換人生長激素(hGH)的8個胺基酸殘基，並用基因工程的方法表達出來的一種蛋白質。這8個胺基酸殘基在人生長激素第I結合位點內，對生長激素與GHR的結合功能特別重要。其中，第18位天冬氨酸取代組氨酸(H18D)、第21位天冬醯胺取代組氨酸(H21N)、第167位天冬醯胺取代精氨酸(R167N)、第168位丙氨酸取代賴氨酸(K168A)、第171位絲氨酸取代天冬氨酸(D171S)、第172位精氨酸取代賴氨酸(K172R)、第174位絲氨酸取代穀氨酸(E174S)和第179位蘇氨酸取代異亮氨酸(I179T)。通過 胺基酸的置換，使第I結合位點與GHR的親和力大為增加。此外，B2036是一種人生長激素的9個胺基酸殘基被置換的蛋白質。除了置換上述8個胺基酸殘基以外，還有第I結合位點的第120位甘氨酸取代賴氨酸(G120K)。然而，B2036分子與GHR 二聚體的親和力卻與人生長激素相當。這是由於儘管B2036的第I結合位點與GHR的親和力有所增加，但第2結合位點幾乎失去了與GHR的結合能力，從而能夠抑制生長激素的生物學功能。由於B2036在體內的血漿半衰期短，僅為15-20分鐘，所以不能持續阻斷生長激素的功能。在臨床使用時需要加大給藥量和給藥次數，並帶來一定的毒副作用，增加了病人的痛苦與經濟負擔。聚乙二醇(PEG)修飾被認為是一種能有效克服蛋白質藥物血漿半衰期短的方法之一。這是因為PEG自身有著巨大的優勢，它是一種線性的、在溶液中可自由捲曲且不帶電荷的聚合物，具有無毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性，已被美國FDA批准用於人體。目前已有多種PEG修飾的蛋白質藥物被美國FDA批准上市，如PEG修飾的幹擾素a 2a(Pegasys, Roche公司)等。使用PEG共價修飾蛋白質,可以延長蛋白質的體內循環半衰期，降低蛋白質的免疫原性，增加蛋白質的溶解性以及改變蛋白質在人體內的生物學分布。PEG修飾蛋白質和多肽主要是氨基修飾(包括N端氨基的醯化修飾、賴氨酸側鏈氨基的醯化修飾、N端氨基的烷基化修飾)、羧基修飾以及巰基修飾等。其中，定點修飾主要包括N-末端修飾和半胱氨酸殘基修飾。N-末端修飾是通過PEG醛與一定量的還原劑如氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)在偏酸的環境下進行的還原烷基化反應。
Kopchick 等(Endocr.Rev.2002，23:623-646)將 B2036 分子共價修飾上 4 6個分子量為5kDa的PEG分子，得到的生長激素類似物稱為PEG-B2036，即培維索孟(Pegvisomant)。由於Pegvisomant第168位和172位都不是賴氨酸殘基,所以PEG化對Pegvisomant的第I結合位點的影響小於PEG_hGH(G120K)。而Pegvisomant第120位為賴氨酸殘基，可被PEG化,進一步降低了它與第2結合位點的親和力。Pegvisomant於2003年獲得美國FDA的批准上市，用於治療垂體生長激素腺瘤引起的肢端肥大症，商品名索馬沃(Somavert)0目前,歐洲也已將其用於肢端肥大症的臨床治療。但是，由於Pegvisomant是在B2036分子上接上4飛個分子量為5kDa的PEG分子。這種修飾產物不均一，修飾位點隨機性強，每種成分無法定量、也無法進行分離，使得批次間的重複性較差，不同批次間的產物生物活性或有差別，不利於產品的質量控制和臨床應用。Ross等(J.Clin.Endocrinol.Metab.2001, 86:1716-1723)的研究也表明Pegvisomant與GHR 二聚體的親和力要低於人生長激素。Pegvisomant與GHR 二聚體的親和力為PEG-hGH (G120K)的6.6倍，但只有人生長激素的1/40。因此，Pegvisomant的濃度要遠高於人生長激素才能達到拮抗的目的。這可能是因為在B2036分子的8個賴氨酸殘基及N-末端殘基上修飾4 6個5kDa的PEG分子後，降低了 Pegvisomant第I結合位點與GHR的親和力。

發明內容
針對上述問題，本發明提出了一種PEG修飾GHA的方法。分別採用分子量為20kDa和40kDa的PEG醛定點修飾GHA的N-末端的α -氨基，製備分子量均一的定點修飾N-末端的PEG化GHA，即每個GHA分子的N-末端結合I個PEG分子。最終修飾產物成分單一，易於分離純化，產物收率高，預期能減少GHA生物活性的損失。本發明的另一個目的還在於解決PEG修飾後GHA的半衰期增加而其藥效降低的問題。通過比較分子量為20kDa和40kDa的PEG修飾產物對血漿IGF-1的抑制作用，探討不同鏈長PEG對GHA生物活性的影響，尋找PEG修飾GHA的藥代動力學與藥效動力學間的平衡點。在實施方案中發現，20kDa的PEG修飾 產物(M-P20K-GHA)表現出較高的藥效，而40kDa的PEG修飾產物(M-P40K-GHA)的藥效幾乎消失。因此，20kDa的PEG醛為優選的PEG用於修飾GHA。本發明製備N-末端PEG單修飾的生長激素拮抗劑的方法，包括以下步驟:(I)確定M-P20K-GHA的製備條件:將GHA置換到50mM NaAc-HAc緩衝液(ρΗ5.5)中。調整GHA濃度為2.2mg/mL (0.1mM)，按GHA:PEG醛(20kDa)=NaCNBH3的不同摩爾比例，於4°C分別反應過夜Γ16小時)。以Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm)檢測PEG修飾產物，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。(2)修飾產物M-P20K-GHA的純化及鑑定:根據步驟I所述，選擇GHA:PEG醛(20kDa) =NaCNBH3 摩爾比 1:8:80 用於製備 M-P20K-GHA。以 Superdex200 凝膠過濾柱(1.6cmX60cm)對修飾產物進行分離純化，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。收集修飾產物的洗脫峰，濃縮後用SDS-PAGE和凝膠過濾色譜對修飾產物進行鑑定。(3)確定M-P40K-GHA的製備條件:將GHA置換到50mM NaAc-HAc緩衝液(ρΗ5.5)中。調整GHA濃度為2.2mg/mL (0.1mM)，按GHA:PEG醛(40kDa):NaCNBH3的不同摩爾比例，於4°C分別反應過夜Γ16小時)。以Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm)檢測PEG修飾產物，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。(4)修飾產物M-P40K-GHA的純化及鑑定:根據步驟3所述，選擇GHA:PEG醛(40kDa) =NaCNBH3 摩爾比 1:4:80 用於製備 M-P40K-GHA。以 Superdex200 凝膠過濾柱(1.6cmX60cm)對修飾產物進行分離純化，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。收集產物的洗脫峰，濃縮後用SDS-PAGE和凝膠過濾色譜進行產物鑑定。(5)M-P20K-GHA 和 M-P40K-GHA 的修飾位點鑑定:將 GHA、M-P20K-GHA 及M-P40K-GHA置換到含2.0M脲的NH4HCO3 (0.05M，pH8.3)溶液中，將蛋白濃度調整為1.0mg/mL。將胰蛋白酶和蛋白以質量比為1:100的比例，於37°C下孵育10小時，酶解產物使用反相HPLC柱(Proteonavi,0.46cmX25cm)進行酶切片段的分離和鑑定。(6)M-P20K-GHA與M-P40K-GHA的藥效動力學:選取250 300克雄性SD大鼠20隻，隨機分為4組。其中，第I組為對照組，皮下注射0.15M的NaCl (500 μ I);第2_4組分別為 GHA、M-P20K-GHA 及 M-P40K-GHA 組。注射劑量為 2mg GHA/kg SD 大鼠，共注射 500 μ I。經皮下注射後，於第1、4、24、48、72、96、120和144小時進行眼眶採血，離心收集血漿。用ELISA試劑盒測定血漿中IGF-1的含量。與傳統的GHA修飾策略相比，本發明的優勢在於提供了一種將不同分子量的PEG醛修飾在GHA的N-末端的方法，從而得到均一且定點的PEG單修飾產物，使GHA的活性中心不被PEG修飾，減少GHA生物活性的損失。以M-P20K-GHA及M-P40K-GHA為例，通過比較不同分子量的PEG醛單修飾產物，考察其對血漿IGF-1的抑制作用，探討不同鏈長PEG對GHA生物活性的影響，確定修飾GHA的最佳PEG鏈長。


圖1分子量為20kDa的PEG醛修飾GHA的凝膠過濾色譜圖。使用的是Superdex200凝膠過濾柱(lcmX30cm), 洗脫液流速為0.5ml/min,洗脫緩衝液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。樣品為不同反應比例下製備的PEG修飾產物。圖2分子量為40kDa的PEG醛修飾GHA的凝膠過濾色譜圖。使用的是Superdex200凝膠過濾柱(lcmX30cm),洗脫液流速為0.5ml/min,洗脫緩衝液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。樣品為不同反應比例下製備的PEG修飾產物。圖3凝膠過濾柱分離純化PEG修飾產物。使用的是Superdex200凝膠過濾柱(1.6cmX 60cm)，洗脫液流速為1.0ml/min，洗脫緩衝液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。收集箭頭所示的洗脫峰，即對應於純化的M-P20K-GHA和M-P40K-GHA。圖4PEG修飾產物的純度鑑定。凝膠過濾色譜圖使用的是Superdex200凝膠過濾柱(lcmX 30cm)，洗脫液流速為0.5ml/min，洗脫緩衝液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。插圖是SDS-PAGE分析結果。第I泳道是標準蛋白，第2泳道是GHA，第3泳道是M-P20K-GHA，第4 泳道是 M-P40K-GHA。圖5PEG修飾位點的鑑定圖譜。使用反相HPLC柱(Proteonavi,0.46cmX25cm)進行酶切肽段分離。圖6SD大鼠血漿中IGF-1的濃度變化曲線。SD大鼠經皮下注射PEG修飾產物，血漿中IGF-1的含量由IGF-1 ELISA定量試劑盒測定。
具體實施例方式實施例1M-P20K-GHA製備條件的確定將GHA 置換到 50mM NaAc-HAc 緩衝液(ρΗ5.5)中。調整 GHA 濃度為 2.2mg/mL(即 0.1mM),按 GHA:PEG 醛(20kDa):NaCNBH3 摩爾比為 1:4:40、1:4:80、1:6:80、1:6:60、1:6:120、1:8:40、1:8:80 以及 1:8:160，4°C分別反應過夜Γ16 小時)。以 Superdex200 凝膠過濾柱(lcmX30cm)對修飾產物進行檢測，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。20kDaPEG醛修飾GHA的結果如圖1所示，以M-P20K-GHA的峰面積與總的峰面積比值大小來衡量產率。隨著20kDa PEG醛和NaCNBH3反應比例的提高，M-P20K-GHA的產率也隨之提高。但是，隨著反應比例的增加，出現了多修飾的GHA，即D-P20K-GHA，並隨著反應比例的增加而增力卩。此外，隨著反應比例的增加，GHA的殘留量顯著下降；當6撤:PEG醛=NaCNBH3W摩爾比為1:8:160時，GHA基本反應完全。雖然GHA:PEG醛:NaCNBH3的摩爾比為1:8:160時，能夠得到較多的GHA修飾產物，但是由於D-P20K-GHA的產率較多，因而GHA =PEG醛=NaCNBH3的摩爾比為1:8:160時，M-P20K-GHA的產率要低於摩爾比為1:8:8θΓ75%)。因此，選擇GHA:PEG 醛(20kDa) =NaCNBH3 摩爾比 1:8:80 用於製備 M-P20K-GHA。實施例2M-P40K-GHA製備條件的確定將GHA 置換到 50mM NaAc-HAc 緩衝液(ρΗ5.5)中。調整 GHA 濃度為 2.2mg/mL (BP0.1mM)，按 GHA:PEG 醛(40kDa):NaCNBH3 摩爾比為 1:4:40、1:4:80、1:6:60、1:6:120、1:8:40以及1:8:80,4°C分別反應過夜( 16小時)。以Superdex200凝膠過濾柱(IcmX 30cm)對得到的結合產物進行檢測，洗脫液為20mM磷酸緩衝液(pH7.2)。如圖2所示，與20kDa的PEG醛修飾GHA的情況基本相同，採用40kDa的PEG醛修飾GHA，隨著GHA =PEG醛(40kDa):NaCNBH3摩爾比例的增加，M-P40K-GHA的產率增加，GHA殘量逐漸減少。雖然GHA:PEG醛(40kDa):NaCNBH3的摩爾比為1:8:80時，能夠得到較多的GHA修飾產物，但是由於D-P40K-GHA的產率較多，因而GHA:PEG醛:NaCNBH3的摩爾比為1:8:80時，M-P40K-GHA的產率要低於摩爾比為 1:4:80( 71%)。因此，選擇 GHA:PEG 醛:NaCNBH3 摩爾比 1:4:80 用於製備 M-P40K-GHA。實施例3M-P20K-GHA與M-P40K-GHA的分離純化及鑑定根據實施例1所述，選擇GHA:PEG醛(20kDa):NaCNBH3摩爾比1:8:80用於製備M-P20K-GHA。根據實施例2所述，選擇GHA =PEG醛(40kDa):NaCNBH3摩爾比1:4:80用於製備M-P40K-GHA。以Superdex200凝膠過濾柱(1.6cmX60cm)對修飾產物進行分離純化,洗脫液為20mM磷酸鹽緩衝液(pH7.2)。如圖3所示，經洗脫後出現了三個洗脫峰，分別對應於PEG的二修飾產物(每個GHA結合2個PEG)、PEG的單修飾產物(每個GHA結合I個PEG)和未修飾的GHA。分別收集兩種PEG修飾的單修飾產物，濃縮後用SDS-PAGE和凝膠過濾色譜鑑定。收集修飾產物的洗脫液，濃縮後用於後續的產品鑑定。實施例4M-P20K-GHA 與 M-P40K-GHA 的鑑定用SDS-PAGE和凝膠過濾色譜鑑定M-P20K-GHA與M-P40K-GHA。如圖4插圖所示，M-P20K-GHA與M-P40K-GHA在SDS-PAGE電泳圖上均表現出一條帶，這表明這兩種PEG修飾產物具有較高的純度。M-P40K-GHA電泳帶的遷移速率要慢於M-P20K-GHA，而M-P20K-GHA要慢於GHA。這表明PEG修飾能增加GHA的分子量 ，且M-P40K-GHA的分子量要高於M-P20K-GHA。如圖4所示，經緩衝液洗脫後，M-P20K-GHA與M-P40K-GHA分別在Superdex200凝膠過濾柱(1.0cmX30cm)出現I個單一的洗脫峰。其中，M-P20K-GHA的出峰時間要快於M-P40K-GHA,而要慢於GHA。這表明M-P20K-GHA與M-P40K-GHA具有較高的純度，且分子量要大於GHA。 實施例5PEG修飾位點的鑑定將GHA、M-P20K-GHA 與 M-P40K-GHA 經含 2.0M 脲的 NH4HCO3 (0.05M, ρΗ8.3)的緩衝液中充分透析，而後調節濃度至1.0mg/mL。取胰蛋白酶,用超純水配置濃度為1.0mg/mL的儲液。按照胰蛋白酶和蛋白的質量比為1:100的比例，分別加入胰蛋白酶儲液，於37°C孵育10小時。使用反相HPLC柱(Proteonavi,0.46cmX25cm)進行酶切肽段分離。反相HPLC柱使用95%的溶液A (含0.1 %三氟乙酸的超純水)和5%的溶液B (含0.1 %三氟乙酸的乙腈)充分平衡，流速為0.5mL/min。採用線性洗脫方式於IOOmin從5%溶液B升至50%溶液B，檢測流出液在214nm的吸收值。結果如圖5所示，胰蛋白酶可以將GHA及其PEG修飾產物切成不同的肽段。其中以T2肽段作為對照，M-P20K-GHA和M-P40K-GHA與未修飾的GHA相比，由8個胺基酸殘基組成且N-末端所在的Tl肽段(FPTIPLSR)消失，這是因為Tl段經PEG修飾後，出峰位置發生改變，這說明了 M-P20K-GHA和M-P40K-GHA的修飾位點均在N-末端的α -氨基。除此之夕卜，其它酶切片段與GHA相比無顯著變化。這表明PEG能特異性地修飾GHA的N末端。實施例6M-P20K-GHA和M-P40K-GHA的藥效動力學評價選取25(Γ300克雄性SD大鼠20隻，隨機分為4組。其中，第I組為對照組，皮下注射 0.15mol/L 的 NaCl (500 μ I);第 2-4 組分別為 GHA、M-P20K-GHA 及 M-P40K-GHA 組。注射劑量為2mg GHA/kg 30大鼠，注射50(^1，經皮下注射後，於1、4、24、48、72、96、120和144小時進行眼眶採血，離心收集血 漿。以IGF-1濃度高低作為評價GHA藥效的指標。血漿中IGF-1的含量由IGF-1 ELISA定量試劑盒(R&D Systems, Inc.，USA)測定。如圖6所示，對照組、GHA組和M-P40K-GHA組的IGF-1水平相差不大，而M-P20K-GHA的IGF-1水平比對照組約低30 43%。這說明M-P20K-GHA抑制了 IGF-1的水平，即M-P20K-GHA的藥效要顯著優於M-P40K-GHA。GHA組的IGF-1的水平與對照組差異不大，這是由於GHA在體內被快速消除，體內的循環半衰期為15 20分鐘，未能有效降低IGF-1水平。對於M-P20K-GHA而言，PEG的鏈長較短，會部分屏蔽GHA分子上與GHR的結合位點，降低GHA的活性。然而M-P20K-GHA的半衰期延長能夠抵消GHA生物活性的降低，從而能夠顯著降低IGF-1水平。對於M-P40K-GHA而言，由於將40kDa的PEG修飾在GHA的N-末端，高分子量的PEG能完全屏蔽GHA與GHR的結合位點，使GHA的活性幾乎完全喪失。儘管M-P40K-GHA的半衰期顯著延長，卻無法彌補GHA的生物活性喪失。因此，M-P20K-GHA在延長GHA的半衰期的同時，能最大程度地保留GHA的生物活性。分子量為20kDa的PEG醛可作為優化的PEG用於修飾GHA。
權利要求
1.一種定點修飾N-末端的聚乙二醇(PEG)化生長激素拮抗劑(GHA)，其特徵在於PEG化生長激素拮抗劑是由PEG共價修飾到生長激素拮抗劑的N-末端。
2.根據權利要求1所述的PEG化生長激素拮抗劑，其特徵在於每個生長激素拮抗劑分子僅結合I個PEG分子。
3.根據權利要求1所述的PEG化生長激素拮抗劑，其中PEG是單甲氧基聚乙二醇(mPEG),包括單甲氧基聚乙二醇醛、單甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基碳酸酯，其分子量在5kDa 40kDa之間。
4.根據權利要求3所述的PEG化生長激素拮抗劑，所述mPEG分子量是20kDa，所述的mPEG是單甲氧基聚乙二醇醛，結構為mPEG-R-CHO，其中R是碳數為1_10的烷基。
5.根據權利要求4所述的PEG化生長激素拮抗劑，所述單甲氧基聚乙二醇醛是單甲氧基聚乙二醇丙醛。
6.根據權利要求1所述的PEG化生長激素拮抗劑，其特徵在於PEG與生長激素拮抗劑發生修飾反應的摩爾比為1-20。
7.根據權利要求1所述的PEG化生長激素拮抗劑，其特徵在於PEG與生長激素拮抗劑發生修飾反應的摩爾比為4-8。
8.權利要求1所述的PEG化生長激素拮抗劑的製備方法，其特徵在於PEG與生長激素拮抗劑發生修飾反應的反應時間為6-48小時，反應溫度在4-37° C，反應pH為4.0-7.0,緩衝體系為20mM的磷酸緩衝液,用氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)作為還原劑。
9.根據權利要求8所述的PEG化生長激素拮抗劑的製備方法，其分離純化條件為使用凝膠過濾色譜，其中 優選Superdex200凝膠過濾柱。
10.根據權利要求8所述的PEG化生長激素拮抗劑的製備方法，其特徵在於發生修飾反應時NaCNBH3與生長激素拮抗劑的摩爾比為10-200，優選的摩爾比在80-160之間。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及一種定點修飾N-末端的聚乙二醇(PEG)化生長激素拮抗劑(GHA)，以及其製備方法。所述方法包括以下(1)以分子量為20kDa和40kDa的PEG醛分別定點修飾GHA的N末端；(2)用凝膠過濾色譜分離純化上述兩種PEG修飾產物；(3)兩種PEG修飾產物的藥效動力學的初步評價。其中，分子量為20kDa的PEG醛為優化的PEG，修飾產物具有較高的藥效。
文檔編號C07K14/61GK103087182SQ20131004704
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月6日 優先權日2013年2月6日
發明者胡濤, 吳玲, 蘇志國, 馬光輝 申請人:中國科學院過程工程研究所