植物抗病性信號基因∶所涉及的材料和方法

2023-10-29 11:23:02

專利名稱：植物抗病性信號基因∶所涉及的材料和方法
技術領域：
本發明涉及植物抗病性信號基因以及所涉及的材料和方法。具體地說，本發明涉及大麥Rar1基因和來自其它物種的其同源體。
已知植物對病原體的抗性與一組防衛相關反應的誘導相關，所述防衛相關反應包括產生抗微生物化合物、激活致病相關(PR)基因、植物細胞壁的交聯和產生活性氧物質(Dixon和Lamb 1990；Hammond-Kosack和Jones1996)。在大多數情況下，抗性與企圖侵染位點上稱為過敏反應(HR)的宿主細胞死亡反應的激活相關。然而，已經證明採用生化和生理學技術難以顯示出在使入侵者生長停滯方面特定反應的顯著性。相比之下，遺傳研究已經確定了在對攜帶相應無毒決定子的微生物病原體反應中起關鍵作用的R基因基因座(Flor1971)。因此，這些抗性基因產物及其信號途徑的認識預示著對植物防衛機制更深入的了解。近幾年來，已經分離出大量的R基因(Martin等，1993；Bent等，1994；Jones等，1994；Mindrinos等，1994；Grant等，1995；Lawrence等，1995；Song等，1995；Anderson等，1997；Cai等，1997；Ori等，1997；Yoshimura等，1998)。從植物中分離出的大多數R基因屬於兩類，即或者編碼一段可變的富含亮氨酸重複序列和推定的核苷酸結合位點，或者編碼富含亮氨酸重複序列結構域但無核苷酸結合位點。第三類和第四類迄今均僅有一個代表，編碼具有富含亮氨酸重複序列和一個絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結構域的蛋白，或僅編碼蛋白激酶。然而，對R基因的精確作用和它們影響的下遊途徑還不大了解。
植物防衛反應的複雜性表明，除R基因以外的其它組分參與抗性反應。通過鑑定R基因Mla-12作用所需的兩個組分Rar1和Rar2(先前命名為Nar-1和Nar-2；Torp和J rgensen,1986；J rgensen 1988；Freialdenhoven等，1994)，在大麥白粉病互作中獲得了在小種特異性抗性中的第一個另外組分的遺傳證據。後來在其它植物病原體互作中的研究揭示了相似的觀察(Hammond-Kosack等，1994；Salmeron等，1994；Century等，1995；Parker等，1996)，並且最近已經在較簡單的雙子葉植物模式物種擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離出這些組分中的兩個組分(未公開的PCT/GB98/01406；Century等，1997)。這些擬南芥基因EDS1和NDR1均是多個R基因對不同病原體(即細茵病原體和真菌病原體)的功能所需的。NDR1編碼推定的生化功能未知的膜內在蛋白，而預測EDS1編碼推定的新植物脂酶。
迄今為止，證據表明大麥Rar1中的突變抑制大多數測試的、在染色體1H的Mla基因座上編碼的白粉病小種特異性抗性的特異性(Mla-6、Mla-9、Mla-12、Mla-13、Mla-14、Mla-22和Mla-23)以及對其它基因座白粉病抗性特異性(Mlat、Mlh、Mlk,、Mlra和Mlg)(J rgensen 1996；Peterhansel等1997)。然而，在某些情況下，即Mla-1、Mla-7和mlo，沒有觀察到對抗性基因功能的抑制(J rgensen,1996；Peterhansel等1997)。已經鑑定出Rar1中的兩個化學誘導的等位基因突變體，命名為rar1-1(突變體M82)和rar1-2(突變體M100)(Freialdenhoven等，1994)。這兩個隱性突變等位基因中的每個使白粉病病原體能夠在上述白粉病R基因存在下完成其生活周期。在rar1-1，或rar1-2存在下Mla-12特異性抗性反應的特徵性早期事件表皮信號細胞HR被消除。然而，在較晚的階段，在rar1-1，或rar1-2存在下可以容易地鑑別感病侵染表型。在前一缺陷型等位基因存在下，觀察到氣生真菌菌絲體較少和孢子形成較少，並且侵染位點通常被壞死宿主組織包圍。相比之下，在rar1-2存在下的侵染表型幾乎不能與全感病大麥基因型區分。本發明人已經解釋了這些發現，使得rar1-1等位基因保留殘餘的基因活性，並且最近已經證明了rar1-2也保留殘餘的基因活性。
上述遺傳信息提供了強有力的證據，表明Rar1代表了許多白粉病R基因觸發的白粉病抗性信號中的趨同點。
在文獻中缺乏任何可靠的使得能夠常規純化Rar1蛋白的生化測試方法。
本發明人已經採用定位克隆成功地從大麥中克隆了Rar1基因，儘管主要由於遺傳距離和物理距離的比率不適當以及由於高百分比的重複非編碼DNA序列，但從非常複雜的大麥基因組(5.3×109bp/單倍體基因組；(Bennett和Smith 1991))基於作圖分離基因的事實提出了很大的實驗挑戰性。迄今為止，僅有一篇報導成功地基於作圖分離出大麥基因(Büschges等1997)。
本發明由克隆Rar1基因和提供其同源體和突變等位基因而產生。
在各個方面，本發明涉及編碼具Rar1功能多肽的核酸。「Rar1功能」是指Rar1基因及其多肽表達產物在信號途徑中起作用、導致植物病原體防衛反應和/或細胞死亡和最好是由R基因產物與病原體Avr蛋白的直接或間接互作而實現的病原體抗性的能力。術語「Rar1功能」可以用來指在植物中決定Rar1表型的序列，術語「Rar1突變體功能」或「rar1功能」可以用來指在植物中抑制或消除Rar1表型的Rar1序列形式。根據降低或消除病原體抗性和/或植物病原體防衛反應，鑑定rar1突變體表型。通過如上所述評價防衛反應和/或植物對病原體的感病性的水平，或通過本領域技術人員已知並且可利用的其它合適替代方法，可以確定Rar1功能和rar1功能。試驗植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。合適的單子葉植物包括大麥、水稻、小麥、玉米或燕麥中的任何一種，特別是大麥。合適的雙子葉植物包括擬南芥屬、菸草、番茄、芸苔屬(Brassicas)、馬鈴薯和葡萄藤。
按照本發明的多核苷酸可以編碼包括

圖1所示胺基酸序列的多肽。所示編碼序列可以是所示的包括在圖1中的序列，或它可以是所示序列的突變體、變異體、衍生物或等位基因。所述序列可以因所示序列的一個或多個核苷酸的添加、插入、缺失和置換中的一種或多種的改變而不同於所示序列。核苷酸序列的改變可能導致在由遺傳密碼決定的蛋白水平上的一個胺基酸改變，或可能不導致改變。因此，按照本發明的核酸可以包括不同於圖1所示序列、但仍編碼具有同一胺基酸序列(即編碼序列可以是「簡併等同序列」)的多肽的序列。
按照本發明的多核苷酸可以包括鑑定為圖4中外顯子的一種或多種序列。
本發明也包括這樣的核酸分子，其包括一段編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括的一段胺基酸序列儘管明顯與功能Rar1多肽相關(例如與決定Rar1功能的Rar1多肽有免疫學交叉反應，或具有與Rar1多肽共有的特徵性序列基序)，但不再具有Rar1功能。因此，本發明提供不促進植物病原體防衛反應或細胞死亡和/或病原體抗性的Rar1的突變體。攜帶這些突變形式的植物和植物細胞對病原體侵染敏感。
因此，產生抗性的類型和降低抗性的類型的Rar1突變體、變異體、片段、衍生物、等位基因和同源體根據情況可能均具有實用價值。在農藝學情況下，主要關注一種產生對病原體的植物抗性。
本發明以這種同源體的突變體、變異體、片段和衍生物提供在本文提供的具體Rar1序列(參見例如圖3)的具體同源體(以及以上作出的與這種突變體等有關的註解也適用於與同源體的突變體等有關方面)。利用本文的公開內容可容易地獲得這類同源體。因此，本發明也延伸至核酸分子，其包括編碼採用衍生自圖1或圖4的胺基酸序列或者圖1或圖4的核苷酸序列可獲得的Rar1同源體的核酸序列。所述Rar1同源體可以在核苷酸水平上與圖1的核苷酸序列具有同源性，或可以編碼與具有圖1所示胺基酸序列的多肽具有同源性的多肽，所述同源性最好至少約50％，或至少約55％，或至少約60％，或至少約65％，或至少約70％，或至少約75％，或至少約80％同源性，或至少約90％同源性。最優選至少約95％或更高的同源性。(以下進一步討論在胺基酸水平上的同源性的測定)。
在某些實施方案中，特定序列的多肽等位基因、變異體、衍生物、突變衍生物、突變體或同源體可以幾乎不顯示總體同源性，亦即與圖1的特定胺基酸序列的同源性為約20％、或約25％、或約30％、或約35％、或約40％或約45％。然而，在功能重要的結構域或區域中，胺基酸同源性可能高得多。採用生物信息方法，包括比較同源體的序列，可以鑑定推定的功能重要的結構域或區域。可以組合不同多肽的功能重要的結構域或區域，以作為融合蛋白由編碼核酸表達。例如，可以將不同同源體的特別有利或特別想要的特性組合在一個雜種蛋白中，以使所產生的具有Rar1或Rar1功能的表達產物可以包括各種親代蛋白的片段。
按照本發明再一方面的片段示於圖5A和圖5C中，其編碼核苷酸序列分別示於圖5B和圖5D中。
本發明的其它結構域和片段示於圖6中，其編碼核苷酸序列示於圖7中。所述結構域和片段可以用於本文公開的本發明的各個方面和實施方案中。
圖7的每個核苷酸序列代表本發明的再一方面，包含所示序列的多核苷酸序列可以用於本文公開的各個方面和實施方案中。
Rar1衍生寡核苷酸引物(作為真正序列或簡併序列)可以用來從許多不同植物中分離Rar1同源體，包括單子葉植物和單子葉植物，諸如大麥、小麥、玉米、燕麥、水稻、番茄、甜瓜、葫蘆科(cucurbitaceae)、十字花科(Brassicaceae)、辣椒、萵苣、葡萄藤、觀賞植物。克隆了相應的基因後，則可以將其作為反義構成物表達，以評價其在對農藝上重要病害抗性方面的重要性，所述病害例如大麥柄鏽菌(Pucciniahordei)(葉銹病)、黑麥喙孢(Rhynchosproium secalis)(褐斑病)、圓核腔菌(Pyrenophera teres)(網斑病)、燕麥異皮線蟲(Heterodera avenae)(大麥穀類孢囊線蟲)、Drechslera teres、白粉病和黃矮病病毒(例如大麥黃矮病病毒)。
以下在本文中討論同源體的獲得，但在此應該簡單地指出，本文提供的核苷酸序列信息或其任何部分可以用於資料庫檢索，以發現同源序列，可以測試所述同源序列的表達產物的Rar1(或rar1)功能。這些序列可能在植物中具有互補Rar1(或rar1)表型，或在植物中表達時可以賦予這種表型。因此，Rar1 cDNA或其部分可以作為誘餌用於互作誘捕測定(interaction trap assay)，諸如用於酵母雙雜種系統中，以分離迄今未知的其它抗病性信號組分。這些目前進一步靶向針對提高抗病性的操作途徑。
通過對同源體測序、研究其表達模式並檢查改變其表達的影響，可獲得執行與Rar1相似功能的基因。當然，這些序列的突變體、變異體和等位基因包括本發明上述討論的大麥Rar1基因相同方面的範圍內，儘管應該注意到，在資料庫中已經存在的同源體序列(例如包括在圖3中的本文鑑定的任何同源體序列)當包括在一個或多個其它方面中時，可以把將其從本發明的一個或多個方面或實施方案中排除。
將本文公開的同源體之間的同源性可以用於鑑定其它同源體，例如採用在序列保守或PCR引物基礎上設計的寡核苷酸(例如簡併庫)。
可用於本發明各方面的引物包括「AtRar1 5』」和「AtRar1 3』」，其序列在下面給出。
按照再一方面，本發明提供例如從非大麥的物種中鑑定Rar1同源體的方法或克隆Rar1同源體的方法，所述方法利用衍生自圖1或圖4所示序列的核苷酸序列。例如，這種方法可以包括提供植物細胞核酸的製備物、提供其核苷酸序列基本上如本文所示或基本上與本文所示核苷酸序列互補的核酸分子，所述核苷酸序列最好是得自所示編碼序列內(例如編碼圖1所示胺基酸序列的序列)，使所述製備物中的核酸與所述核酸分子在所述核酸分子與所述製備物中的任何所述基因或同源體雜交的條件下接觸，並根據其與所述核酸分子的雜交鑑定所述基因或同源體(如果有的話)。
靶核酸或候選核酸可以例如包括可從已知含有或懷疑含有這種核酸的生物得到的基因組DNA、cDNA或RNA(或這些中任何核酸的組合，最好是作為文庫)，所述生物或者為單子葉植物或者為雙子葉植物。在將進行的任何PCR之前，可以通過例如用RT-PCR或採用酚乳液復性技術(phenol emulsion reassociation technique)(Clarke等(1992)NAR20,1289-1292)在基因組文庫上產生cDNA文庫，降低核酸文庫的複雜性。可以鑑定成功的雜交，並分離靶核酸/候選核酸用於進一步研究和/或應用。
可以確定核酸分子與Rar1基因或同源體的雜交，或例如採用核酸擴增反應、特別是聚合酶鏈式反應(PCR)間接鑑定所述雜交。PCR需要應用特異性擴增靶核酸的兩種引物，因此最好是使用具有Rar1特徵的序列的兩種核酸分子。然而，如果僅使用RACE，則可能需要一種這種引物。也可以通過用核酸探測並在合適的嚴格條件下(按照已知技術)鑑定陽性雜交確定雜交(可選地結合增技術例如RCR)。關於探測，優選條件是其嚴格性足以有具有少量雜交鑑定為陽性的簡單圖式的條件，可以對所述陽性進行進一步研究。本領域眾所周知逐漸提高雜交嚴格性，直至僅保留少量陽性克隆。
可以採用供本領域技術人員使用的多種技術中的任一種，測定探針與靶核酸(例如DNA)的結合。例如，可以將探針進行放射標記、螢光標記或酶標記。不使用探針標記的其它方法包括限制片段長度多態性的檢查、用PCR擴增、RNA酶切割和等位基因特異性寡核苷酸探測。
探測可以使用標準DNA印跡技術。例如，可以從細胞提取DNA，用不同的限制酶消化。然後通過瓊脂糖凝膠電泳分離限制性片段，然後變性並轉移至硝化纖維素濾膜上。可以使標記探針雜交於濾膜上的DNA片段並檢測結合。可以用諸如反轉錄酶-PCR的技術，從細胞的RNA製備物製備用於探測的DNA。
通過在低嚴格條件下使各種探針雜交於用限制酶消化的DNA的DNA印跡上，進行初步實驗。關於探測，優選的條件是其嚴格性足以有具有少量雜交鑑定為陽性的簡單圖式的條件，可以對所述陽性進行進一步研究。本領域眾所周知逐漸提高雜交嚴格性，直至僅保留少量陽性克隆。如果獲得大量雜交片段，而同時背景雜交低時，則達到合適的條件。採用這些條件，可以檢索核酸文庫，例如代表表達序列的cDNA文庫。本領域技術人員能夠考慮到例如寡核苷酸長度和鹼基組成、溫度等等因素，很好地運用所需嚴格性的合適條件以進行選擇性雜交。
例如，最初可以在以下條件下進行篩選溫度約37℃或更高，甲醯胺濃度低於約50％以及中等至低鹽(例如標準檸檬酸鹽溶液(「SSC」)=0.15M氯化鈉；0.15M檸檬酸鈉；pH7)濃度。
或者，溫度約50℃或更高和高鹽(例如「SSPE」=0.180mM氯化鈉；9mM磷酸氫二鈉；9mM磷酸二氫鈉；1mM EDTA鈉；pH7.4)。最好在約37℃、甲醯胺濃度約20％和鹽濃度約5×SSC下，或溫度約50℃和鹽濃度約2×SSPE下進行篩選。這些條件將使得可以鑑定出與探針序列具有相當大同源性(相似性、同一性)的序列，而不需要完全同源來鑑定穩定的雜交。
例如用於檢測同一性約80-90％的序列的合適條件包括於42℃、在0.25M Na2HPO4,pH7.2、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖下雜交過夜；最後於55℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌。對於檢測同一性高於約90％的序列，合適的條件包括於65℃、在0.25M Na2HPO4,pH7.2、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖下雜交過夜；最後於60℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌。
一般而言，可以按照Sambrook等的方法(下文)，用包含以下物質的雜交溶液進行雜交5×SSC(其中「SSC」=0.15M氯化鈉；0.15M檸檬酸鈉；pH7)、5×Denhardt試劑、0.5-1.0％SDS、100μg/ml變性片段化鮭精DNA、0.05％焦磷酸鈉和至多50％甲醯胺。於37-42℃雜交至少6小時。雜交後，如下洗滌濾膜(1)於室溫下在2×SSC和1％SDS中5分鐘；(2)於室溫下在2×SSC和0.1％SDS中15分鐘；(3)於37℃下在1×SSC和1％SDS中30分鐘-1小時；(4)於42-65℃下在1×SSC和1％SDS中2小時，每30分鐘更換溶液。
計算在特定序列同源性的核酸分子之間達到雜交所需的嚴格性條件的一個通用公式是(Sambrook等(1989))Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲醯胺)-600/雙鏈體中的bp數。
如以上公式所述，用[Na+]=
和50-％甲醯胺，GC含量為42％和平均探針大小為200個鹼基，則Tm為57℃。同源性每降低1％，DNA雙鏈體的Tm降低1-1.5℃。因此，用42℃的雜交溫度可以觀察到序列同一性高於約75％的靶。這種序列被認為是與本發明的核酸序列基本上同源。
本領域眾所周知逐漸提高雜交嚴格性，直至僅保留少量陽性克隆。其它合適的條件包括例如用於檢測同一性約80-90％的序列的條件於42℃、在0.25M Na2HPO4,pH7.2、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖下雜交過夜；最後於55℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌。對於檢測同一性高於約90％的序列，合適的條件包括於65℃、在0.25M Na2HPO4,pH7.2、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖下雜交過夜；最後於60℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌。
或者，可能特別適合於植物核酸製備物的條件是5×SSPE(最終0.9M氯化鈉；0.05M磷酸鈉；0.005M EDTA pH7.7)溶液、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、於65℃過夜(對於高嚴格性，高度相似的序列)或50℃(對於低嚴格性，相似程度較低的序列)。對於高嚴格性在0.2×SSC/0.1％SDS、於65℃下洗滌，或者對於低嚴格性於50-60℃、在1×SSC/0.1％SDS下洗滌。
本發明延伸至在高嚴格性下可與本文鑑定的核酸選擇性雜交的核酸，所述本文鑑定的核酸例如為圖1的編碼序列、圖4的序列或圖5C或圖5D的序列。
在美國專利第4,683,195號中和Saiki等Science 239:487-491 (1988)中描述了用於擴增核酸的PCR技術。PCR包括步驟為將模板核酸變性(如果是雙鏈)，將引物退火至靶並且聚合。在擴增反應中探測的核酸或用作模板的核酸可以是基因組DNA、cDNA或RNA。可以用PCR從基因組DNA、特定RNA序列和由mRNA轉錄的cDNA中擴增特定的序列。關於PCR技術一般應用的文獻包括Mullis等，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.,51:263,(1987),Ehrlich(編輯)，PCRtechnology,Stockton Press,NY,1989,Ehrlich等，Science,252:1643-1650,(1991),「PCR protocols；A Guide to Methods and Applications」,Innis等編輯，Academic Press,New York,(1990)。
可以如討論的各種方式，評價PCR產物是否相應於能夠改變植物對病原體抗性的基因，並且PCR條帶可以含有複雜的產物混合物。可以克隆各種產物，並根據與在用該探針顯示多態性的子代中分離的這種已知基因的連鎖性篩選每種產物。或者，在克隆之前可以處理所述PCR產物，其處理方式使得該產物能夠在變性聚丙烯醯胺DNA測序凝膠上顯示多態性，所述凝膠具有與預選擇的基因連鎖的特定條帶。將候選PCR條帶克隆並表明與已知抗病基因連鎖後，則可以用其分離克隆，可以研究所述克隆的其它特徵以及與Rar1/Rar1或其它相關基因的同源性。隨後可以通過轉化評估其引入目的植物感病品種時的功能，對其進行分析。或者，所述PCR條帶或通過分析其而衍生的序列可以用來幫助育種者監測有用抗病基因的分離。
這些技術具有一般應用性，用於鑑定能夠改變植物對病原體抗性的基因。
適用於探針或PCR引物設計的優選胺基酸序列是在至少兩種Rar1肽或由參與植物防衛反應信號的基因編碼的多肽之間保守(完全、基本上或部分)的序列。採用本文包含的信息，例如圖3中的信息，可以鑑定保守序列。
在胺基酸序列信息或核苷酸序列信息的基礎上，可以設計寡核苷酸探針或引物(當根據胺基酸序列信息工作時，考慮遺傳密碼的簡併性，並且如果合適，考慮所述生物的密碼子選擇)。
鑑定為所述核酸分子與其雜交的基因或其片段可以是擴增的PCR產物，可以將其分離和/或純化，並可以隨後研究其改變植物對病原體抗性的能力。如果所鑑定的核酸是基因片段，則可以將所述片段用於(例如通過探針和/或PCR)隨後克隆全長基因，它可以是全長編碼序列。
可以由部分cDNA克隆製備插入片段，並用其篩選cDNA文庫。分離的全長克隆可以亞克隆到表達載體中，並通過引入合適的宿主細胞中進行活性分析和/或測序。將一個或多個基因片段連接產生全長編碼序列可能是必不可少的。
發現操作具有改變植物對侵染抗性能力的基因的分子可以使用其本身，以改變植物對病原體的抗性。在本發明的各個方面提供獲得的核酸或採用本文公開的方法可獲得的核酸。
本發明也提供基於本文提供的Rar1核苷酸序列或按照本文公開內容或建議可獲得的Rar1核苷酸序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸的長度可以適合用作擴增反應中的引物，或它們可以適用作雜交釣取探針。例如用於核酸擴增的按照本發明的寡核苷酸最好具有約10個和更少的密碼子(例如6、7或8個)，即長度約30個或更少的核苷酸(例如18、21或24)。探針或引物的長度可以為約20-30個核苷酸。
按照本發明的核酸分子和載體可以以由其天然環境中，以基本上純或均質的分離和/或純化的方式提供，或者沒有或者基本上沒有目的物種或者非相關序列來源的核酸和基因。按照本發明的核酸可以包括cDNA、RNA、基因組DNA，並可以是全合成的或是部分合成的。所使用的術語「分離」可以包括這些可能性中的任一種。
本文提供的或利用本文公開內容可獲得的核酸可以是通過核苷酸的添加、插入、缺失或置換中的一種或多種而改變、且改變或未改變所編碼胺基酸序列(由於遺傳密碼的簡併性)的核酸。可以按照標準技術，根據Rar1功能和Rar1功能容易地並且常規地測試本文提供的或利用本文公開內容可獲得的這種改性形式的Rar1核苷酸序列，所述標準技術為基本檢查攜帶該突變體、衍生物或變異體的植物或植物細胞對合適病原體的改變的防衛反應。
所述核酸分子可以為重組體形式，最好是複製型載體，例如質粒、粘粒、噬菌體或雙元載體，例如適用於農桿菌的雙元載體。所述核酸可以處於用於在宿主細胞例如微生物(例如細菌)或在植物細胞中表達的合適啟動子和調節元件的控制之下。在基因組DNA的情況下，這可以含有其自身啟動子和調節元件，而在cDNA的情況下，這可以處於用於在宿主細胞中表達的合適啟動子和調節元件的控制之下。因此，可以將圖1的核苷酸序列(例如)置於非大麥Rar1基因啟動子的啟動子控制之下。同樣，可以將得自另一物種的Rar1同源序列有效連接於其天然連接的啟動子之外的啟動子上。然而，包含按照本發明的核酸的載體不必包括啟動子，特別是如果該載體將用於將所述核酸引入細胞以重組到基因組中時。
可以將本發明提供的核酸置於誘導型基因啟動子控制之下，因此將表達置於使用者控制之下。
在再一方面，本發明提供基因構成物，所述構成物包含有效連接於本發明提供的核苷酸序列的誘導型啟動子。正如所討論的，這使得能夠控制該基因的表達。
本發明也提供用所述基因構成物轉化的植物和方法，所述方法包括將這種構成物引入植物細胞中和/或例如通過應用合適的刺激(例如有效外源誘導物)誘導構成物在植物細胞中表達。
術語「誘導型」當用於啟動子時是為本領域技術人員眾所周知的。本質上，處於誘導型啟動子控制之下的表達是對應用的刺激(其可以在細胞內產生或由外源提供)應答而「打開」或增加。刺激的性質在啟動子之間是不同的。某些誘導型啟動子在缺乏合適刺激時幾乎不引起表達或引起不可檢測水平的表達(或無表達)。其它誘導型啟動子在缺乏所述刺激時引起可檢測的組成型表達。無論在缺乏所述刺激時表達水平如何，來自任何誘導型啟動子的表達在存在正確的刺激時均增加。優選的情況是當應用相關刺激時表達水平增加的量有效改變表型特徵。因此，可以使用在缺乏刺激時引起基礎表達水平的誘導型(或「可開關」)啟動子，所述表達水平太低以致不能產生所需表型(並且實際上可能是零)。當應用刺激時，表達增加(或打開)至產生所需表型的水平。誘導型啟動子的一個實例是Caddick等(1998)Nature Biotechnology16:177-180中公開的乙醇誘導型基因開關。許多其它實例是本領域技術人員已知的。
其它合適的啟動子可以包括花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)基因啟動子，其在實際上所有植物組織中以高水平表達(Benfey等，(1990)EMBO J9:1677-1684)；花椰菜meri5啟動子，其在營養頂端分生組織以及在植物體中幾個很好定位的位置表達，所述位置例如內生韌皮部、花原基、根和莖的分枝點(Medford,J.I.(1992)Plant Cell 4,1029-1039；Medford等，(1991)Plant Cell 3,359-370)；和擬南芥(Arabidopsisthaliana)LEAFY啟動子，其在花發育中非常早的時期表達(Weigel等，(1992)Cell 69,843-859)。
本領域技術人員能夠很好地構建載體並設計方案用於重組基因表達。可以選擇或構建含有合適的調節序列的合適載體，所述調節序列包括啟動子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和合適的其它序列。關於進一步的細節請參見例如MolecularCloning:a Laboratory Manual第2版，Sambrook等，1989,Cold SpringHarbor Laboratory Press。在Current Protocols in Molecular Biology,第2版，Ausubel等編輯，John Wiley Sons,1992中描述了許多已知技術和方案，用於操作核酸，例如製備核酸構成物、誘變、測序、將DNA引入細胞和基因表達以及分析蛋白，Sambrook等和Ausabel等的公開內容都通過引用結合到本文中。Bevan(Nucl.Acids Res.12,8711-8721(1984))以及Guerineau和Mullineau(1993)(植物轉化和表達載體。PlantMolecular Biology Labfax(Croy RRD編輯)Oxford,BIOS ScientificPublishers，第121-148頁)描述了先前廣泛成功用於植物的具體方法和載體。
可以使用可選擇的遺傳標記，包括賦予可選擇表型的嵌合基因，所述表型例如對抗生素的抗性，所述抗生素為卡那黴素、潮黴素、膦絲菌素、氯磺隆、氨甲蝶呤、慶大黴素、壯觀黴素、咪唑啉酮和草甘膦。
如果將選擇的基因構成物引入細胞中，則必須考慮某些因素，這是本領域技術人員眾所周知的。待插入的核酸應該裝配在含有將驅動轉錄的有效調節元件的構成物中。必須有可利用的將所述構成物運送到所述細胞中的方法。一旦所述構成物在所述細胞膜內，則或者發生或者不發生於內源染色體物質中的整合。最後，只要涉及植物，則靶細胞類型必須使得細胞可以再生為全株。
採用已經已知用於植物基因操作的標準技術，可以產生用含所述序列的DNA區段轉化的植物。可以採用任何合適的技術將DNA轉化到植物細胞中，所述技術例如由農桿菌攜帶的解除武裝的Ti質粒載體，利用其天然的基因轉移能力(EP-A-270355、EP-A-0116718、NAR12(22)8711-87215 1984)；粒子或微粒轟擊(US 5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)；微注射(WO 92/09696、WO 94/00583、EP331083、EP 175966、Green等(1987)Plant Tissue and Cell Culture,Academic Press)；電穿孔(EP-290395、WO 8706614)；其它形式的直接DNA攝入(DE 4005152、WO 9012096、US 4684611)、脂質體介導的DNA攝入(例如Freeman等Plant Cll Physiol.29:1353(1984))；或渦旋混合法(例如Kindle,PNAS U.S.A.87:1228(1990d)；Oard,1991,Biotech.Adv.9:1-11中對用於轉化植物細胞的物理方法進行的綜述。
因此，一旦鑑定出基因，則可以採用本領域技術人員眾所周知的技術將其再引入植物細胞中，產生合適表型的轉基因植物。
農桿菌轉化為本領域技術人員所廣泛使用，以轉化雙子葉植物種。在幾乎所有經濟上有關的單子葉植物中產生穩定的可育轉基因植物現在也是常規方法(Toriyama等(1988)Bio/Technology 6,1072-1074；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.7,379-384；Zhang等(1988)Theor ApplGenet 76,835-840；Shimamoto等(1989)Nature 338,274-276；Datta等(1990)Bio/Technology 8,736-740；Christou等(1991)Bio/Technology 9,957-962；Peng等(1991)International Rice Research Institute,Manila,Philippines 563-574；Cao等(1992)Plant Cell Rep.11,585-591；Li等(1993)Plant Cell Rep.12,250-255；Rathore等(1993)Plant Molecular Biology 21,871-884；Fromm等(1990)Bio/Technology 8,833-839；Gordon-Kamm等(1990)Plaant Cell 2,603-618；D』Halluin等(1992)Plant Cell 4,1495-1505；Walters等(1992)Plant Molecular Biology 18,189-200；Koziel等(1993)Biotechnology 11,194-200；Vasil,I.K.(1994)Plant Molecular Biology 25,925-937；Weeks等(1993)Plant Physiology 102,1077-1084；Somers等(1992)Bio/Technology 10,1589-1594；WO92/14828)。特別是，現在農桿菌介導的轉化在單子葉植物中是一種非常有效的可選擇的轉化方法(Hiei等(1994)The Plant Journal 6,271-282)。
在穀類作物水稻、玉米、小麥、燕麥和大麥中已經達到的產生可育轉基因植物(在Shimamoto,K.(1994)Current Opinion inBiotechnology 5,158-162；Vasil等(1992)Bio/Technology 10,667-674；Vain等，1995,Biotechnology Advances 13(4):653-671；Vasil,1996,Nature Biotechnology 14第702頁的綜述)。Wan和Lemaux(1994)PlantPhysiol.104:37-48描述了產生大量獨立轉化的可育大麥植株的技術。
在農桿菌無效或效率低時，優選微粒轟擊、電穿孔和直接DNA攝入。或者，可以採用不同技術的組合增強轉化法的效率，例如用農桿菌包被的微粒轟擊(EP-A-486234)，或微粒轟擊以誘導產生傷口，然後與農桿菌共培養(EP-A-486233)。
在轉化後，按照本領域標準的方法，可以例如由單細胞、愈傷組織或葉圓片再生植株。幾乎任何植物均可以由細胞、組織和植物器官完全再生。可利用的技術綜述於Vasil等，Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants，第Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ卷，Laboratory Procedures and TheirApplications,Academic Press,1984，和Weissbach和Weissbach,Methodsfor Plant Molecular Biology,Academic Press,1989。
根據轉化技術轉化某些植物種的效率以及實施本發明的個人對選擇的特定方法的經驗和喜好，確定轉化技術的具體選擇。對於本領域技術人員顯而易見的是，將核酸引入植物細胞的轉化系統的特定選擇對於本發明不是關鍵或不限制本發明，植物再生技術的選擇也是如此。
本發明還包括用上述載體轉化的宿主細胞，尤其是植物細胞或微生物細胞。因此，提供包含本文所示核苷酸序列的宿主細胞，例如植物細胞。在該細胞內，所述核苷酸序列可以摻入染色體中。
按照本發明也提供核苷酸序列整合到基因組中的植物細胞，所述核苷酸序列特別是異源核苷酸序列，如本發明提供的在控制表達的調節序列有效的控制下的核苷酸序列。所述編碼序列可以有效連接於一個或多個調節序列，所述調節序列對於所述基因可以是異源的或是外來的，例如不是與所述基因天然連接以用於表達的。按照本發明的核苷酸序列可以置於外部誘導型基因啟動子的控制之下，以將表達置於使用者的控制之下。本發明的再一方面提供製備這種植物細胞的方法，包括將核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的合適載體引入植物細胞中，並使所述載體和所述植物細胞基因組之間進行重組，以將所述核苷酸序列引入基因組中。本發明延伸至由於將所述核苷酸序列引入祖細胞中而含按照本發明的核苷酸序列的植物細胞。
術語「異源的」可以用來表示採用基因工程即人類幹涉而已經將所述基因/核苷酸序列引入所述植物細胞或其祖細胞中。可以提供轉基因植物細胞，即所述核苷酸序列的轉基因植物細胞。所述轉基因可以在基因組外載體上，或最好穩定地摻入到基因組中。可以將異源基因取代內源等同的基因，即正常執行相同或相似功能的基因，或者所述插入的序列對於所述內源基因或其它序列可以是另外基因。引入異源基因的優點是能夠將序列表達置於選擇的啟動子控制之下，以便能夠根據選擇影響表達。此外，可以用野生型基因的突變體、變異體和衍生物(例如比野生型具有較高或較低活性)取代內源基因。對於植物細胞為異源、外源或外來的核苷酸序列在該類型細胞、品種或物種中可以是非天然存在的。因此，核苷酸序列可以包括或得自特定類型植物細胞或物種或植物品種的編碼序列，可以將其置於植物的不同類型或物種或品種的植物細胞背景中。再一可能性是將核苷酸序列置於天然所述核苷酸或其同源體的細胞中，但其中所述核苷酸序列連接於和/或鄰接在所述細胞中或該類型或植物物種或品種的細胞中天然不存在的核酸，例如有效連接於一個或多個調節序列例如啟動子序列以控制表達。植物或其它宿主細胞中的序列可以被鑑定為異源的、外源的或外來的。
也提供包括按照本發明的植物細胞的植物及其任何部分或繁殖體、種子、自交或雜交子代和後代。特別提供轉基因作物，所述轉基因作物已經工程改造以攜帶如上所述鑑定的基因。合適植物的實例包括菸草、葫蘆、胡蘿蔔、芸苔屬蔬菜、甜瓜、辣椒、葡萄藤、萵苣、草莓、芸苔屬油料種子、甜菜、小麥、大麥、玉米、水稻、大豆、豌豆、高粱、向日葵、番茄、馬鈴薯、胡椒、菊花、康乃馨、楊樹、桉樹和松樹。
按照本發明的植物可以是在一種或多種特性方面不是純育的植物。植物品種排除特別是按照Plant Breeder’s Right可註冊的植物品種。人們注意到，植物不一定僅僅因為它在基因組中穩定地含有被引入所述植物細胞或祖細胞中的轉基因而被簡單地認為是「植物品種」。
除植物外，本發明提供這種植物的任何克隆、種子、自交或雜交子代和後代、以及這些的任何部分，例如插條、種子。本發明提供任何植物繁殖體，亦即可以用於有性或無性生殖或繁殖的任何部分，包括插條、種子等等。本發明也包括這種植物的有性或無性繁殖的苗種、克隆或後代、或所述植物的任何部分或繁殖體、苗種、克隆或後代。
本發明也包括本文公開的或按照本文的信息和建議可獲得的按照本發明的核酸分子的多肽表達產物。因此也提供一種方法，通過在合適的宿主細胞(例如大腸桿菌)中在合適條件下由編碼核苷酸序列表達，製備這種表達產物。本領域技術人員也能夠很好地構建載體和設計方案和系統，以表達和回收重組基因表達的產物。
優選的多肽包括圖1所示的胺基酸序列。按照本發明的多肽可以是圖1所示多肽的等位基因、變異體、片段、衍生物、突變體或同源體。所述等位基因、變異體、片段、衍生物、突變體或同源體可以基本上具有圖1所示胺基酸序列的Rar1功能，或可以是rar1突變體。
本發明也包括儘管明顯與功能性Rat1多肽相關(例如它們與證明有Rar1功能的Rar1多肽有免疫學交叉反應，或它們具有與Rar1多肽共有的特徵性序列基序)、但不再具有Rar1功能的多肽。因此，本發明提供變異體形式的Rar1多肽，諸如由本文鑑定的rar1-1和rar1-2突變產生的多肽。攜帶這些突變形式的植物和植物細胞對病原體侵染易感。
在胺基酸序列方面的「同源性」可以用來指同一性或相似性，最好是同一性。如上所述，高水平的胺基酸同一性可能限於功能上重要的結構域或區域，例如本文鑑定的任一結構域(例如參見圖6)。
特別是，本發明提供本文提供的特定Rar1多肽序列的同源體，也提供這種同源體的突變體、變異體、片段和衍生物。利用本文公開的內容，可容易地獲得這種同源體。因此，本發明也延伸至包含採用本文提供的序列信息可獲得的、具有Rar1功能的胺基酸序列的多肽。Rar1同源體在胺基酸水平上可能與圖1的胺基酸序列具有同源性，優選同源性約至少50％，或至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％同源性，或至少85％，或至少88％同源性，或至少90％同源性。最優選至少約95％同源性或更高同源性。
在某些實施方案中，特定序列的等位基因、變異體、衍生物、突變體衍生物、突變體或同源體可能顯示出與所述特定序列的總體同源性少，亦即同源性約為20％，或約25％、或約30％、或約35％、或約40％或約45％。然而，在功能重要的結構域或區域中，所述胺基酸同源性可能高得多。採用生物信息方法，包括比較同源體的序列，可以鑑定推定的功能重要的結構域或區域。可以組合不同多肽的功能重要的結構域或區域，以作為融合蛋白由編碼核酸表達。例如，可以將不同同源體的特別有利或特別想要的特性組合在一個雜種蛋白中，以使所產生的具有Rar1或Rar1功能的表達產物可以包括各種親代蛋白的片段。
Rar1多肽的各個結構域和片段示於圖6，這些、以及所述衍生物、變異體和同源體可用於本發明的各個方面和實施方案中，例如用於激活細胞死亡和/或下遊抗性反應。
可以用Altschul等的TBLASTN程序((1990)J.Mol.Biol.215:403-10)限定和確定胺基酸序列的相似性，這是本領域的標準用法。特別是，TBLASTN 2.0可以與Matrix BLOSUM62和GAP補償一起使用存在(existence):11，延伸(extension):1。可以使用的另一種標準程序是BestFit，它是Wisconsin軟體包8版本(1994年9月)(GeneticsComputer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA,Wisconsin 53711)的一部分。BestFit製作兩個序列之間最佳相似性區段的最佳序列對比。通過插入間隙(gap)，以採用Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.(1981)2:482-489)使匹配數最大化，可發現最佳對比。其它算法包括GAP，它採用Needleman和Wunsch算法以將兩個完全序列序列對比，使匹配數最大而使間隙數最小。關於任何算法，一般使用默認參數，這對於GAP是間隙產生補償=12，間隙延伸補償=4。或者，採用間隙產生補償可以為3，而間隙延伸補償可以為0.1。算法FASTA(其採用Pearson和Lipman的方法(1988)PNASUSA 85:2444-2448)是再一選擇方法。
本文的術語「同源性」和「同源的」中任一種的應用不是暗示在比較的序列之間有任何必然的進化關係，例如應遵照例如「同源重組」的術語的標準用法，這僅僅需要兩個核苷酸序列足夠相似，以在合適的條件下重組。以下可找到按照發明的多肽的進一步的討論，其中所述多肽由按照本發明的核酸編碼。
利用本領域的標準技術，可以用純化的Rar1多肽及其突變體、變異體、片段、衍生物、等位基因和同源體(例如通過由其編碼核酸表達重組產生的)來產生抗體。抗體和包含抗體的抗原結合片段的多肽可以用於鑑定本文具體提供的序列的同源體，如以下進一步討論的。
產生抗體的方法包括用所述蛋白或其片段免疫哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、兔子、馬、山羊、綿羊或猴子)。可以用本領域已知的多種技術中的任一種由免疫動物獲得抗體，並可以進行篩選，最好用抗體與目的抗原的結合進行篩選。例如，可以使用蛋白質印跡技術或免疫沉澱(Armitage等，1992,Nature 357:80-82)。抗體可以是多克隆抗體或是單克隆抗體。
作為另一種選擇方法或對將哺乳動物免疫的補充，可以例如採用λ噬菌體或表面呈現功能性免疫球蛋白結合結構域的絲狀噬菌體，由表達的免疫球蛋白可變區的重組產生的文庫，獲得具有合適結合特異性的抗體；例如參見WO92/01047。
針對一種多肽或肽產生的抗體可以用於鑑定和/或分離同源多肽，然後鑑定所述編碼基因。因此，本發明提供鑑定或分離具有Rar1功能或Rar1功能(按照本文公開的實施方案)的多肽的方法，包括用包含抗體的抗原結合結構域的多肽(例如完整抗體或其片段)篩選候選肽或多肽，其中所述抗原結合結構域能夠結合Rar1或Rar1肽、多肽或片段、變異體或其變異體，或最好對這種肽或多肽具有結合特異性，例如具有本文鑑定的胺基酸序列。特定結合成員，例如抗體或包含抗體的抗原結合結構域、結合併最好對Rar1或Rar1肽或多肽或其突變體、變異體或衍生物具有特異性的多肽，代表本發明的其它方面，其應用和其用法也代表本發明的其它方面。
用於篩選的候選肽或多肽可以例如是用衍生自目的植物的核酸產生的表達文庫的產物，或可以是來自天然來源的純化過程的產物。
可以分離發現結合所述抗體的肽或多肽，然後可以對其進行胺基酸測序。任何合適的技術均可以用來對所述肽或多肽進行完全或部分測序(例如可以對多肽片段進行測序)。如以下進一步討論的，可以用胺基酸序列信息，例如通過設計一種或多種寡核苷酸(例如寡核苷酸的簡併庫)用作與候選核酸雜交的探針或引物，或通過檢索計算機序列資料庫，來獲得編碼所述肽或多肽的核酸。
本發明還提供在植物中促進細胞死亡和/或植物病原體防衛反應的方法，所述方法包括在所述植物的細胞中表達具有所述Rar1功能的異源核酸序列。
本發明還提供在植物中產生病原體抗性的方法，所述方法包括在所述植物的細胞中表達具有所述Rar1功能的異源核酸序列。
通過在早期將編碼賦予Rar1功能的胺基酸序列的核苷酸序列引入植物細胞或其祖先中的步驟後，在植物細胞中由所述核苷酸序列進行表達，可以完成所述方法。這種方法可以產生植物對病原體的抗性。
對所述Rar1轉錄物或Rar1蛋白表達的操作，可以用來在不同植物中增強對病原體的廣譜抗性。這可以通過採用高活性植物啟動子(例如CaMV-35S啟動子)進行過量表達而達到。或者，可以將Rar1連接於病原體誘導型啟動子(參見以下的討論)，使得在受攻擊的細胞中可以更高的表達。可以在沒有過敏反應(HR)的情況下存在增強的抗病性，而過敏反應有可能在一般的活力和產量方面對所述植物具有有害效應。
穩定摻入植物基因組中的基因可一代一代傳遞至所述植物的後代，所述後代的細胞可以表達所編碼的多肽，並因此可能具有增強的病原體抗性或病原體易感性。可以通過如上所述評價病原體的親和性，確定病原體抗性。
本發明還提供一種方法，所述方法包括在早期將編碼圖1胺基酸序列或所述序列的突變體、等位基因或衍生物(它們可能具有Rar1功能)的核酸引入植物細胞或其祖先中的步驟後，在植物細胞中由所述核酸進行表達。這種方法可以產生植物對一種或多種病原體的抗性。可以結合按照WO91/15585(Mogen)或更優選PCT/GB95/01075(以WO95/31564公開)中所述方法的任一種的avr基因或參與賦予病原體抗性的任何其它基因，使用本方法。
在本發明中，通過將所述核苷酸序列以有義方面引入，可以達到抗性的改變。因此，本發明提供調節植物中防衛反應的方法，所述方法包括使按照本發明的核酸在所述植物的細胞中表達。一般而言，最理想的是促進所述防衛反應，並且這可以通過提供Rar1基因功能而實現。
為了向下調節由Rar1產生信號的抗性，可以採用反義技術或「反義調節」達到使內源Rar1基因表達不足。
現在很好地建立了應用反義基因或部分基因序列以向下調節基因表達。將雙鏈DNA以「反向」置於啟動子控制之下，以使所述DNA的「反義鏈」轉錄，產生與由所述靶基因「有義」鏈轉錄的正常mRNA互補的RNA。人們認為所述互補反義RNA序列然後與mRNA結合形成雙鏈體，抑制由來自所述靶基因的內源mRNA翻譯出蛋白質。仍不確定這是否是實際的作用模式。然而，確定了該技術有效的事實。參見例如Rothstein等，1987；Smith等，(1988)Nature 334,724-726；Zhang等，(1992)The Plant Cell 4,1575-1588,English等，(1996)The Plant Cell8,179-188。在Bourque,1995和F1avell,1994中也對反義技術進行了綜述。反義構成物可以包括Rar1的3』端或5』端序列或同源體。在一種植物種中存在幾種Rar1同源體的情況下，在反義構成物中包括5』端和3』端非翻譯序列將增強沉默的特異性。可以採用天然啟動子，通過組成型表達的啟動子例如CaMV 35S啟動子，通過組織特異性或細胞類型特異性啟動子，或通過可以被外部信號或因子激活的啟動子，表達構成物。已經表明，CaMV 35S啟動子以及水稻actin1和玉米遍在蛋白啟動子在水稻中產生高水平的報導基因表達(Fujimoto等，(1993)Bio/Technology 11,1151-1155；Zhang等，(1991)Plant Cell 3,1155-1165；Cornejo等，(1993)Plant Molecular Biology 23,567-581)。
不必使用反向的對應於所述編碼序列的完整序列。例如，可以使用足夠長度的片段。這對於本領域技術人員而言，篩選各種大小且來自所述編碼序列不同部分的片段以使反義抑制的水平最佳化是一種常規方法。可能最好包括起始甲硫氨酸ATG密碼子，也許也最好包括所述起始密碼子上遊的一個或多個核苷酸。合適的片段可以具有約14-23個核苷酸，例如約15、16或17個核苷酸。
因此，本發明也提供在植物中向下調節Rar1表達的方法，所述方法包括使得在所述植物的細胞中從按照本發明的核酸進行反義轉錄。Rar1的向下調節可能減小防衛反應。這可能適合於某些情況，例如作為分析方法或實驗方法。
為了用於反義調節，提供包含與Rar1基因(即包含同源體)編碼序列互補的核苷酸序列的核酸，或提供適用於反義調節表達的所述編碼序列的片段。這可以是DNA，並且處於合適的調節序列控制之下，以在目的細胞中反義轉錄。
當以有義方向(亦即與所述靶基因方向相同)插入所述靶基因的額外拷貝時產生多種表型，包括發生過量表達的個體和某些發生來自所述靶基因的蛋白表達不足的個體。當所插入的基因僅為所述內源基因的一部分時，在轉基因群體中表達不足的個體數增加。對於有義調節發生的機制、特別是向下調節(或「沉默」)的機制尚不太了解。然而，在科學文獻和專利文獻中已經廣泛報導了該技術，並且常規用於基因控制。參見例如van der Krol等，(1990)The Plant Cell 2,291-299；Napoli等，(1990)The Plant Cell 2,279-289；Zhang等，(1992)The Plant Cell 4,1575-1588。在WO95/34668(Biosource)；Angell和Baulcombe(1997)TheEMBO Journal 16,12:3675-3684；和Voinnet和Baulcombe(1997)Nature 389第553頁中可以找到關於基因沉默或共抑制技術的進一步改進。
合適的片段的長度可以為約50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700個核苷酸。
因此，本發明也提供在植物中向下調節Rar1功能的方法，所述方法包括使按照本發明的核酸在所述植物的細胞中表達，以抑制內源Rar1表達。
可以用修飾形式的Rar1來向下調節內源Rar1功能。可以使用例如突變體、變異體、衍生物等。
通過採用核酶，諸如複製核酶，例如錘頭狀核酶，可以達到降低Rar1野生型活性(Haseloff和Gerlach,1988,Nature 334:585-591；Feyter等，Mol.,1996,Gen.Genet.250:329-338)。
在植物中降低Rar1功能的另一方法是利用轉座子誘變(由Osborne等綜述，(1995)Current Opinion in Cell Biology 7,406-413)。已經證明，通過「定向標記」方法，採用或者內源轉座因子或在相異基因組中保留其移動性的異源克隆的轉座子將基因失活。採用對插入序列和Rar1同源體具有結合特異性的PCR引物，可以鑑定出攜帶任何已知序列插入體的Rar1等位基因。可以採用「雙組分系統」使失活等位基因內的轉座子穩定化。在所述雙組分途徑中，構建帶有非自主轉座子的T-DNA，所述非自主轉座子含有在移除標記(excision marker)中插入可選擇或可篩選標記基因。使帶有這些T-DNA的植株與帶有表達轉座酶功能的第二T-DNA的植株雜交。雜種對於移除和所述轉座子中的標記是雙選擇，產生具有轉座的因子的F2植株。
現在參考後面的附圖，僅作為實例描述涉及本發明的實施方案和實施例。
附圖簡述圖1顯示大麥Rar1 cDNA的核苷酸序列和推定的胺基酸序列。所述核苷酸序列和推定的胺基酸序列基於得自栽培品種Ingrid Rar1的RNA的實驗獲得的RT-PCR和RACE的綜合數據。終止密碼子用星號標記，檢測的RACE產物的末端用序列上的箭頭標明。
圖2圖解說明所述Rar1基因的結構。以示意圖給出大麥Rar1基因的結構。以黑框突出外顯子。通過比較RT-PCR產物與基因組序列鑑定出內含子和外顯子的位置。顯示出突變體rar1-1和rar1-2的突變事件的位置。
圖3顯示了來自顯示與大麥Rar1相關性的不同物種基因中的推定肽序列的序列對比。同源區以黑色(同一性)、暗灰色(高度保守的交換)或淺灰色(保守交換)突出。用Genetics Computer Group,Wisconsin程序8版本(GCG；Devereux,1984)分析序列數據。用延伸的GCG軟體中的「prettybox」選項進行序列對比的推定胺基酸序列的顯示。左邊的數字表示每種肽序列的GenBank登錄號。
圖4顯示了Rar1基因組基因序列的10,000個核苷酸，包括編碼外顯子和內含子。標出了rar1-1和rar1-2突變(均為G-＞A)。下劃線的序列代表Rar1外顯子序列，粗體的核苷酸代表5』和3』共有剪接序列。
圖5A顯示了圖1的Rar1多肽N末端片段的胺基酸序列。
圖5B顯示了編碼圖5A的Rar1多肽片段的核苷酸序列。
圖5C顯示了圖1的Rar1多肽C末端片段的胺基酸序列。
圖5D顯示了編碼圖5C的Rar1多肽片段的核苷酸序列。
圖6顯示大麥Rar1蛋白的片段和結構域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的胺基酸序列。
圖7顯示編碼圖6的片段和結構域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的核苷酸序列，具有這些序列的多核苷酸以及包含這些序列的多核苷酸代表本發明另外的方面。
圖8A顯示AtRar1 cDNA序列，包括編碼序列。
圖8B顯示AtRar1蛋白序列(也作為ab010074示於圖3中)。
圖8C顯示AtRar1蛋白N末端片段的編碼核苷酸序列。
圖8D顯示由圖8D的核苷酸序列編碼的ArRar1蛋白N末端片段。
圖8E顯示AtRar1蛋白內部片段的編碼核苷酸序列。
圖8F顯示由圖8E的核苷酸序列編碼的ArRar1蛋白內部片段。
圖8G顯示AtRar1蛋白C末端片段的編碼核苷酸序列。
圖8H顯示由圖8G的核苷酸序列編碼的ArRar1蛋白C末端片段。
圖9顯示各種「CHORD」序列(「富含半胱氨酸和組氨酸結構域」)和一個共有序列的序列對比。
本文引用的所有文獻均通過引用結合到本文中。實施例1來自大麥的Rar1和來自其它物種的同源體的克隆和鑑定Rar1的高解析度遺傳作圖先前低解析度的間隔作圖方法將Rar1定位於大麥染色體2上，側翼在5cM間隔內為RFLP基因座cMWG694和MWG503(Freialdenhoven等，1994)。因為大麥中1cM相當於約3Mb，所以我們決定第一步是分離Rar1，以建立一個局部高解析度的遺傳圖譜。我們的目的是約0.01cM的解析度，這相當於30kb的平均物理距離。
由於DNA多態性尤其在春型大麥中的頻率低(Russel等，1997)，我們斷定有效地交替雜交可能是有利的，因為它增加用給定探針發現多態性的可能性。因此，將兩種突變體與代表春型大麥不同遺傳背景的三種Mla-12回交(BC)系(Mla-12 BC Ingrid,Mla-12 BC Pallas,Mla-12BC Siri；Freialdenhoven等1994；K lstet等1986；K lster和St len 1987)雜交。
高解析度作圖的階段概括如下採用基於50株植株的初始RFLP圖譜(Freialdenhoven等1994)，將CAPS標記MWG876、MWG892和MWG2123整合到遺傳圖譜中。用表型篩選分析1040株植株在Ant2和Rar1之間的重組事件。用所觀察的重組體揭示，MWG892作圖至Rar1的遠側。隨後在標記間隔MWG892-cMWG694內進行對另外1063株植株的基於CAPS重組體篩選。對所觀察的重組體的分析將MWG876定位於Rar1附近。最後，在標記間隔MWG892-MWG876內研究了另外2207株植株。鑑定出兩個AFLP R25/48和A25/43並在混合個體的DNA上對其進行測試。在抗病混合分離子中鑑定出R25/48。在4.5％變性聚丙烯醯胺凝膠上分析PCR產物。在所述感病混合個體之一中發現存在所述連鎖的AFLP信號，表明在AFLP基因座R25/48和Rar1之間有一次重組事件，這在感病庫(Bs)中沒有顯示出。用R25/48和A25/43鑑定的兩個重組體揭示出Rar1和MWG876共分離，因此，AFLP基因座必定位於MWG876遠側。在兩點估計的基礎上計算遺傳距離(cM)。
更詳細地講對限定含Rar1的約5cM間隔的RFLP標記MWG503和cMWG694(Freialdenhoven等，1994)進行測序，得到用於擴增相應基因座的寡核苷酸，並測定感病親本(rar1-1,rar1-2)和抗病親本(Mla-12 BCIngrid,Mla-12 BC Pallas,Mla-12 BC Siri)之間的多態性。該涉及用M82、M100、Mla-12 BC Ingrid、Mla-12 BC Pallas和Mla-12 BC Siri作為模板DNA，在溴化乙錠染色的2.5％瓊脂糖凝膠上顯示用限制酶消化的擴增產物。如以下表2所述進行擴增和消化。所顯示的CAPS標記相應於RFLP基因座MWG87、MWG503、cMWG694、MWG876和MWG2123。用於基因座MWG892的PCR引物使得可以不用隨後進行限制性消化而對PCR產物進行等位基因特異性鑑別。次要條帶因PCR擴增子的不完全BclⅠ消化而產生。
為了增加Rar1附近的標記密度，我們選擇了另外三種RFLP標記，這三種標記圖譜位置靠近得自一般RFLP圖譜的上述RFLP基因座(MWG876、MWG892和MWG2123[Graner,1991])。將這三種RFLP分別轉變為可切割可擴增多態序列(CAPS)，並在50個分離子群體的基礎上相對於Rar1作圖。在該群體中，MWG876和MWG892顯示出與Rar1共分離，而MWG2123位於cMWG694遠側。
重組體篩選衍生Rar1突變體(rar1-1,rar1-2)的栽培品種Sultan-5(Mla-12,Rar1)含有一個花色素苷色素形成缺陷(ant2)，而用於作圖的三種抗病Mla-12 BC系(Mla-12 BC Ingrid,Mla-12 BC Pallas,Mla-12 BC Siri)攜帶Ant2野生型等位基因。先前表明Ant2基因座作圖於Rar1遠側約0.5cM距離處(Freialdenhoven等1994)。為了鑑定Rar1和Ant2之間小間隔中罕有的重組體，我們選擇了1,040株感病F2單株(rar1/rar1)並根據花色素苷野生型等位基因Ant2的存在進行篩選。發現總共14個重組體，測試這些重組體中MWG87、MWG876和MWG892的等位基因。對這14個重組體的分析表明Rar1、MWG87和MWG876共分離。標記MWG892位於Ant2和Rar1之間，由於兩個重組事件而與前者分離。這兩種等位Rar1突變體和三個Mla-12BC系之間的不同雜交未顯示出顯著不同的重組頻率。因此，我們將對其它重組體的檢索限制於僅一次雜交(M100×Mla-12 BC Ingrid)。這使得我們也能夠使用鑑定的鄰近Rar1的重組體來進行下述的基於定向AFLP的標記篩選。
為了提高靶基因座附近的遺傳解析度，通過利用CAPS標記MWG892和cMWG694對於Rar1側翼的重組事件篩選了另外1,063株F2植株。隨後對MWG87和MWG876等位基因的研究表明MWG87和Rar1完全連鎖，但MWG876和所述靶基因之間的一個重組事件將該RFLP定位至Rar1遠側。
我們嘗試通過用CAPS分析測試另外2,207株F2植株在標記間隔MWG876-MWG892中的重組事件，在遺傳上將MWG87與Rar1分離。然而，對所觀察的重組植株的研究仍顯示Rar1和MWG87共分離。MWG87、MWG876和Rar1緊密的遺傳連鎖可以表明在這些基因座之間的物理距離小，但也可以是在基因組區段中重組頻率低的結果。為了研究這些可能性並用另外的DNA標記強化(enrich)所述間隔，我們開始了基於AFLP的標記檢索。如果Rar1、MWG87和MWG876的緊密遺傳連鎖是因對重組抑制而引起，則可以預期所述大的物理間隔可揭示出該靶區域中大量的連鎖AFLP標記。定向AFLP標記檢索我們使用AFLP技術(Vos等1995)以及採用雜交rar1-2×Mla-12BC Ingrid的選定F2子代進行的混合分離子分析(Giovannoni,1991；Michelmore等1991)。為了使與Rar1不緊密連鎖的AFLP標記的檢測最小化，我們使用DNA標記選擇的重組體用於構建我們在上述基於CAPS的重組體篩選中鑑定的DNA庫。這兩個DNA庫各包括10株F2植株。在我們開始AFLP標記篩選時，我們在標記間隔MWG892-cMWG694之間僅分析了500株F2植株，尚未鑑定出MWG876和Rar1之間的重組體。因此，不可能用MWG876選擇合適的重組體。感病庫(rar1-2/rar1-2)含有三個cMWG694和Rar1之間重組的單株、四個MWG892和Rar1之間重組的單株和三個在所研究的標記間隔中無重組事件的感病單株。僅根據DNA標記選擇用於抗病庫的重組體。通過採用顯示出cMWG694和MWG892抗病親本等位基因模式的植株，我們可以確保在所述對應的遺傳間隔中的純合性。因此期待反式和順式的連鎖AFLP標記。為了縮小抗病庫的靶間隔，我們使用攜帶MWG503和MWG892之間(兩株植株)或cMWG694和MWG2123之間(兩株植株)有一次重組事件的植株。除所述重組單株外，我們使用在所研究的標記間隔中沒有可檢測的重組事件的6株植株。
發現M100和Mla-12 BC Ingrid之間AFLP多態性的基因組-寬頻率(genome-wide frequency)為7％。每種AFLP引物組合平均顯示出100種DNA片段。因此，在392的組合中採用7種PstI+2-引物和56種MseI+3-引物調查了約40,000個基因座。僅兩種引物組合在所述DNA庫中鑑定出與Rar1連鎖的AFLP標記。這些引物組合對每個庫單株的分析表明，它們由於一個(R25/45)和兩個(A25/46)重組事件而與靶基因分離，將其作圖至Rar1遠側。
鑑定的與Rar1連鎖的AFLP標記的量少肯定受我們裝配所述DNA庫的方式的影響。也可能表明我們檢索DNA標記的小遺傳間隔在物理上不過分大。為了獲得對遺傳距離和物理距離的更精確的評估，我們結合罕有切割的限制酶和與Rar1連鎖的RFLP探針進行了PFGE DNA印跡分析。
遠程物理作圖採用共分離探針MWG87和側翼探針MWG892和MWG876，測定用7種不同的罕有切割的限制性內切核酸酶進行限制性消化後的片段大小。該分析揭示出一個與MWG87和MWG876雜交的共遷移MluI限制性片段(表1)。這可能表明MWG876和MWG87之間的物理距離最大為550kb。用探針/限制酶組合MWG876/NotI、SalI[和SmaI(90kb)和MWG87/SfiI和SmaI(100kb)也檢測出一般大小的片段。這些採用一種探針和不同內切核酸酶產生的一般大小的片段可能是由成簇的限制位點引起的，這種成簇的限制位點先前在脊椎動物中報導過(Bickmore等1992；Larsen等1992)。
在大麥酵母人工染色體(YAC)上對Rar1進行物理描繪大麥YAC文庫的篩選在Rar1的高解析度遺傳作圖中重要的是鑑定出鄰接基因座MWG892和MWG876、包含所述靶基因座的0.7cM間隔。在超過8,000次減數分裂的基礎上發現基因座MWG87與所述靶共分離。這提供了一種理論以起動對大麥YAC文庫的篩選，以分離含MWG87的大的插入片段基因組克隆。用切割、擴增的多肽序列(CAPS)MWG87進行基於PCR的篩選，導致鑑定出5個酵母克隆，每個克隆產生預期的PCR產物。為了證實所獲得的擴增子代表MWG87基因座，我們對每種PCR產物測序，發現在所有YAC衍生片段中的相同序列。5個YAC中的兩個YAC也含有CAPS標記MWG876，後者作圖至遠離Rar1 0.015釐摩(cM)。通過PFGE和反向PCR(IPCR)進行YAC插入片段分析我們在PFGE DNA印跡分析中使用探針MWG87，以確定分離的YAC的插入片段大小；分別為680kb(Y18)、340kb(Y30)、1,100kb(Y31)、720kb(Y73)和300kb(Y113)。兩個獨立的DNA印跡分析顯示出YAC Y113的信號強度明顯降低，表明該酵母人工染色體的遺傳中斷。為了用鑑定的YAC建立局部重疊群，我們通過IPCR分離了其左末端(L)和右末端(R)，並測定了其核苷酸序列。那些YAC末端的序列分析揭示出，YAC末端Y31L與大麥BARE-1反轉錄轉座子的同一性約為95％，所述反轉錄轉座子是包含約6.7％大麥基因組的高度重複序列(Suoniemi等1996)。在Y18R、Y18L和Y73L中發現與BARE-1反轉錄轉座子高度相關的其它序列段。另外，所述YAC末端Y31R揭示出與玉米反轉錄轉座子Opie-2的序列同一性約為64％(SanMiguel等1996)，表明是迄今在大麥中尚未描述過的一種新元件。
YAC插入片段的重疊分析針對所有YAC測試的來自每個酵母克隆的末端探針，以確定其相關性。根據該核苷酸blast的結果，在代表推測的非重複DNA的序列段中設計了YAC末端特異性寡核苷酸。YAC末端Y31L不可能僅包含多拷貝DNA。隨後，用PCR分析測定這些序列在所述各個酵母克隆中是否存在(表2)。包括兩個無名的YAC(Y1、Y2)以揭示仍識別重複DNA的引物對。相應於酵母克隆Y1和Y2中的YAC末端Y31L的擴增產物證實該YAC的多拷貝特徵。YAC末端Y113L在YAC Y73和Y113中產生擴增產物。然而，Y73中的PCR產物的長度不同於在Y113中檢測到的預期的大小。因此，我們推斷相對於Y113L的基因座在YAC Y73中不存在。所有其它YAC末端特異性引物均清楚地檢測出不同YAC克隆多態性的不存在/存在，並且在Y1或Y2中不擴增片段，表明它們對於YAC重疊群分析的適用性。
如果所有YAC插入片段均與源DNA共線性，則每種末端探針應該檢測到衍生所述探針的酵母克隆以及覆蓋該區的任何YAC。對於標記所述重疊群末端的兩個YAC末端，應該僅檢測到衍生所述末端的酵母克隆。這些末端探針現在限定所述YAC重疊群的末端。由於我們測定了在任何YAC中、但不是在衍生所述末端的YAC中未擴增到的四個YAC末端，因此這四個YAC末端中的至少兩個末端必須得自嵌合YAC。然而，根據該信息，仍不清楚這四個YAC中哪兩個是嵌合的。所述YAC末端的遺傳作圖可能解決這種闡述不清的問題，但僅在所述末端探針不是單拷貝標記就是低拷貝標記的情況下才有可能。
YAC末端的拷貝數除Y31L外，所有YAC末端特異性標記均證明適用於基於YACDNA建立重疊群。接下來，我們確定了所述YAC末端衍生寡核苷酸是否從大麥基因組DNA擴增單基因座，這是遺傳作圖的先決條件。我們採用所述YAC文庫源DNA-栽培品種Ingrid的基因組DNA，用所述各個YAC末端特異性引物對進行了PCR分析。對應於Y113L的引物揭示出與在YAC Y73中也觀察到的非特異性PCR產物匹配的不同長度的多個擴增子。相比之下，對應於YAC末端Y18L、Y18R、Y30L、Y30R、Y31R、Y73R和Y113R的寡核苷酸(表3)導致擴增大小不均一的片段。然而，對所述PCR產物(每個YAC末端三個獨立的克降)的克隆和測序表明，對應於Y30L和Y73L的寡核苷酸產生至少三種不同的擴增子，它們顯示出約5％的序列差異百分率。這表明對應於Y30L和Y73L的引物識別多個具有高度序列相似性的基因座。用序列分析以進行識別三個所鑑定的亞克隆和所述YAC末端衍生序列之間多態性的核苷酸段的內切核酸酶的選擇。用這些診斷性內切核酸酶限制消化所述PCR產物，產生的帶型比預期衍生自單基因座已知序列的擴增子的帶型更複雜。因此，對於來自基因組DNA的PCR產物的基於內切核酸酶的分析，證實對應於Y30L和Y73L的擴增產物的異質性，並且總的來講可能是確定某一標記是否檢測出單拷貝基因座的有用工具。對對應於YAC末端Y18L、Y18R、Y30R、Y31R和Y113的亞克隆的序列分析表明這些擴增子是同質的。
將YAC末端確定至大麥染色體上為了確定分離的YAC末端的染色體位置，我們使用小麥/大麥雙端體附加系，每個系含有大麥栽培品種Betzes的已知染色體臂(Shepherd和Islam 1981；Islam 1983)。如果可以將大麥特異性信號與小麥特異性信號區分，則所述雙端體小麥/大麥附加系有利於將給定的大麥序列快速確定至其相應的染色體臂上。我們使用衍生自大麥栽培品種Ingrid的PCR引物，將Y18R和Y18L確定至大麥染色體2HL上，將Y31R確定至染色體5HS上，而將Y73R確定至染色體6HS上。這表明YAC Y31和Y73的嵌合狀態。不能對YAC末端Y113R作圖，因為衍生自栽培品種Ingrid的所述引物不從所述附加系的大麥DNA供體-栽培品種Betzes擴增片段。同樣，不能確定YAC末端Y30R，因為它在小麥和大麥中產生同樣大小的片段。
YAC末端的高解析度遺傳作圖所述小麥/大麥雙端體附加系有利於鑑定嵌合YAC，但必需高解析度遺傳作圖來限定所述YAC末端相對於靶基因座的位置。對所述YAC末端遺傳作圖的先決條件是作圖群體親本基因型之間的序列多態性。我們使用基於PCR的方法檢索可能的序列多態性。對應於Y30R的寡核苷酸在抗病(Rar1)親本和感病(rar1)親本中導致擴增不同大小的產物，而對應於Y113R的引物對僅在每個抗病親本中擴增DNA片段。通過直接測序，分析衍生自所述抗病親本和感病親本的標記基因座Y18L和Y18R的PCR產物的DNA多態性。比較序列分析在Y18R的情況下揭示出一個多態HinfⅠ位點，而在Y18L中在約2.7kb內沒有檢測到DNA多態性。在Y18L序列內一個拷貝的BARE-1反轉錄轉座子使得不可能通過IPCR進一步延伸該序列，以檢索多態性。多態YAC末端的遺傳作圖將Y30R和Y113R定位於Rar1附近，與靶基因座分別間隔11個和3個重組體。發現標記Y18R與Rar1共分離。
位於Rar1的YAC重疊群根據(ⅰ)有/沒有對所述YAC作圖，(ⅱ)通過小麥/大麥附加系進行染色體確定和(ⅲ)高解析度遺傳作圖、而獲得的信息，我們推定出一個YAC重疊群。YAC Y18可能是含有與源DNA共線性的非嵌合插入片段的唯一YAC，因為兩個末端均作圖至染色體2HL。相比之下，YACY30有可能經過一次重排，導致包括標記Y113R的內部缺失。這一結論基於(ⅰ)MWG87和Y30R之間Y113R的遺傳作圖，和(ⅱ)在YAC Y30中缺乏標記Y113R(表2)。先前通過PFGE DNA印跡分析對所述YAC文庫的詳細表徵揭示出由於約30％的所述克隆不穩定性而產生的多個得自YAC的片段(Simons等1997)。然而，通常不可能回收僅含最大插入片段的單個克隆。為了確定該文庫是否仍含有對應於也含Y113基因座的克隆的Y30，我們分析了最初用來鑑定所述YAC克隆的酵母DNA庫。在對應於YAC Y30的DNA庫中我們不能發現Y113R特異性擴增子，表明可能在構建該文庫早期已經發生YAC Y30中的內部缺失。
總結出YAC插入片段YAC Y31、Y73和Y113的嵌合狀態。在YAC Y31和Y73的情況下，這種假定基於將Y31R和Y73R分別確定至染色體5HS和6HS。相反，YAC Y113嵌合狀態的證據基於不存在遠離MWG87的所有遠側標記，還基於僅在YAC Y113中檢測到Y113L(表2)。另一方面，YAC末端Y113L可能位於YAC末端Y31L遠側，暗示在克隆繁殖期間在YAC Y113中已經缺失了基因座Y18R和Y30L之間的區域。
總之，含有Rar1的基因組區在遺傳上由Y113R(近側)和MWG876(遠側)定界。因為由YAC克隆Y18和Y113在近側方向(兩倍豐餘性)以及由YAC克隆Y30和Y31在遠側方向(兩倍豐餘性)在物理圖譜上呈現的YAC重疊群覆蓋該間隔，我們已經在物理圖譜上將Rar1基因座定界。
於Rar1的BAC重疊群的構建接著我們在載體pBelo BAC11中由YAC克隆Y18和YAC克隆Y30建立了兩個HindⅢ BAC亞文庫。我們的目的是平均插入片段大小為50kb，每個亞文庫約5倍豐餘性。
最初用與Rar1共分離的CAPS MWG87分離出5個衍生自YACY30和Y18的BAC(BAC12、BAC1J6、BAC4C20、BAClG12和BAC3H6)。將標記Y113R的PCR引物用來分離BAC 1H1。通過PFGE測定所鑑定的BAC的插入片段大小。通過反向PCR分離每個BAC插入片段的末端片段並隨後對其測序。根據BAC 4C20的末端序列，我們衍生了一種新的共顯性DNA標記，命名為EDDA(表4)，檢測作圖群體親本基因型之間的序列多態性。對間隔MWG876-Y113R內的4個重組體的分析將EDDA定位於Rar1近側。因為BAC 4C20含有三個基因座MWG87、Y18R和EDDA各1個，所以我們在物理圖譜上將Rar1限定在單個BAC克隆上著絲粒方向。
隨後，用BAC12、BAC3H6和BAC1B2的末端序列分別衍生標記OK1114、OK3236和OK5558(表3)。通過研究衍生自靶間隔MWG876-Y113R內4個重組體的基因組DNA，發現共顯性標記OK1114與Rar1共分離。標記OK3236和OK5558檢測出親本基因型Sultan5/Mla-12 BC Pallas和Sultan5/Mla-12 BC Ingrid之間的多態性，但我們不能檢測出Sultan5/Mla-12 BC Siri之間該基因座的多態性。因此，僅可以測試靶MWG876-Y113R中所述4個重組體中的3個重組體，以將所述重組事件定位。對這3個重組體的DNA的分析揭示出標記OK3236和OK5558與Rar1共分離。所述BAC插入片段的大小、每個上述標記的存在與否以及它們相對於Rar1的遺傳定向，是推導Rar1基因座上高解析度遺傳作圖的基礎。在BAC水平將Rar1在物理圖譜上限定在著絲點方向，並且鑑定出鄰接標記Y18R和OK5558的最小共分離間隔。
Rar1基因座上的連續66kb DNA序列段我們決定裝配邊界為標記MWG87和OK5558的DNA間隔的連續基因組DNA序列。利用隨機選擇的得自每種BAC在載體pBluescriptⅡ Ks+中的質粒亞文庫的克隆，對將覆蓋該區的BAC1B2和BAC12的插入片段進行DNA測序。通過採用對BAC3H6模板DNA上每種BAC末端序列特異性的引物封閉BACB2和BAC12之間49bp的缺口，並且隨後對擴增子直接測序。
對候選基因的檢索接著我們採用BLAST算法和所有可利用的資料庫，包括無名EST和基因組序列以及已知基因序列和蛋白序列，開始在所述連續66kbDNA序列段中檢索候選基因。我們在所述資料庫中鑑定出3個與各種實體有高度顯著同源性序列的獨特區(表5)。我們已經將這3個間隔命名為I1、I2和I3(在所述66kd序列重疊群中對應於位置43,500-45,000、45,001-46,500、56,000-61,000)。間隔I1和I2是相互相關的序列(59％核苷酸同一性)，並由所述資料庫中的同一類EST鑑定(表5)，每個間隔顯示出與aquaporin基因的相似性[Maurel,1997]。因此，間隔I1和I2代表以頭-尾方向排列的兩個推定的大麥aquaporin基因。間隔I3表現出與水稻EST C28356的高度序列相似性，可能代表所述66kb序列段中的另一編碼區。
鑑定Rar1候選基因中的突變事件接著我們比較了基因型Rar1 Sultan5、rar1-1 Sultan5和rar1-2Sultan5的基因組擴增子的DNA序列，每種基因型覆蓋間隔I1、I2和I3。我們不能檢測到在間隔I1和I2中三種基因型之間的任何序列多態性。然而，在間隔I3的位置56,764bp和58,562bp發現了兩個單核苷酸置換。G-＞A置換分別對應於基因型rar1-1和rar1-2中的特有序列改變。在I3中發現突變事件則促使我們採用根據I3序列推導的一系列引物，用衍生自栽培品種Ingrid的總葉片RNA進行反向反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)(YAC和BAC重組克隆均含有得自栽培品種Ingrid的基因組DNA)。
對最大的RT-PCR產物測序揭示出一個696bp的單一擴展的可讀框(single extensive open reading frame)(圖1)。採用快速擴增cDNA末端(RACE)技術，鑑定該基因轉錄物的5』端和3』端。
推定的232個胺基酸的蛋白的分子量約25.5kDa。沒有發現與各個資料庫中任何其它表徵的蛋白有顯著同源性。
基因組序列與得自RT-PCR的序列的比較揭示出6個外顯子，每個外顯子的側翼為共有剪接位點序列(圖2和表6)。值得注意的是外顯子2僅由3bp組成，側翼為共有剪接位點序列，編碼一個甘氨酸殘基。
在基因型rar1-1 Sultan5中鑑定的G-＞A DNA置換導致推定的25.5kDa蛋白中Cys24-＞Tyr置換(Cys24代表Rar1同源蛋白中少數不變胺基酸之一；參見下文)。相比之下，基因型中rar1-2 Sultan5所鑑定的G-＞A DNA置換破壞了內含子2中的3』剪接位點共有序列。已知該剪接位點共有序列的G核苷酸是植物和哺乳動物物種中初級mRNA轉錄物有效剪接所必需的[Goodall,1991]。對rar1-2基因型的RT-PCR分析揭示，該突變導致利用外顯子3中的隱蔽剪接位點，這是大量文獻中記載的由許多點突變引起的人類遺傳病的現象[Krawczak,1992][Brown,1996]。利用該隱蔽剪接位點導致讀框移碼，產生一個新的終止密碼子，並因此產生所述推定的25.5kDa蛋白的截短物。
基因型rar1-1和rar1-2中單鹼基置換的發現與所提出的疊氮鈉的作用方式一致，疊氮鈉是最初用來誘變栽培品種Sultan5的誘變劑。化學誘變的用來鑑定rar1-1和rar1-2的群體揭示出在單基因中具有功能缺陷的突變體的頻率為0.5×lO-3(Torp和J rgensen 1986)，與大麥中化學誘變的平均效率相當。因此在兩個獨立突變體中鑑定出單基因中兩個點突變且均包含其功能的概率約為0.25×10-6。總之，在基因型rar1-1和rar1-2中的兩個突變事件在物理上定界的靶間隔中或者導致一個不變單胺基酸置換，或者導致候選基因剪接位點缺損，這一發現提供了良好的跡象表明，我們已經分離出Rar1。
大麥Rar1的同源體對無名水稻EST C28356的DNA測序揭示出一個699bp的單一擴展可讀框，編碼233個胺基酸的推定的Rar1同源蛋白，顯示與大麥Rar1有75％DNA相似性和86％的胺基酸相似性(圖3)(GCG程序GAP，間隙產生補償(gap creation penalty)=3，而間隙延伸補償(gapextension penalty)=0.1)。此外，對擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組資料庫的檢索揭示出，染色體5上的一個基因組間隔表現出與大麥和水稻Rar1有顯著的序列相關性。序列同源序列段限於大麥Rar1中鑑定的外顯子，並且在擬南芥屬基因組中的其順序與在大麥中鑑定的順序相當。擬南芥屬中每個序列同源序列段的側翼均為共有剪接位點序列。這使得我們能夠推導出推定的同源擬南芥屬Rar1蛋白有226個胺基酸，與大麥Rar1有67％同一性和75％的相似性(GCG程序GAP，間隙產生補償=3，而間隙延伸補償=0.1)。我們將相應的水稻和擬南芥屬基因分別命名為OsRar1-h1和AtRar1-h1。
對應於AtRar1-h1的引物AtRar1 5』-ACTCCTACCTTCTCAATTCGTCCG-和AtRar1 3』-TATCAGACCGCCGGATCAGG-使得我們可以分離證實具預測內含子-外顯子結構的同源cDNA。
最後，我們鑑定出許多代表EST實體，所述EST實體代表來自人、小鼠、果蠅屬(Drosophila)、Caenorabditis elegans、麴黴屬(Aspergillus)等的已知功能的已表達基因，表明僅在推導的胺基酸水平上有顯著同源性。在對應於這些EST和大麥Rar1的推導蛋白之間發現的相關性列於表7中，推導的序列的序列對比示於圖3。顯然，大麥Rar1揭示了一種在多細胞生物中享有的新的蛋白結構域。
有趣的是，在突變體rar1-1中置換為Tyr的大麥Rar1的Cys24代表少數在所有已鑑定序列的相關蛋白中嚴格保守的胺基酸之一。討論我們已經描述了通過基於作圖克隆法的大麥Rar1的分子分離。預測該基因編碼一種新的22.5kDa胞內蛋白。這一發現需要在遺傳數據中解釋，所述遺傳數據表明Rar1是許多由不同小種專化性抗病基因(R基因)觸發的白粉病抗性反應必不可少的。現在普遍認為，植物對特定病原體的抗性涉及由宿主中相應R基因和病原體中無毒基因(Avr)觸發的特異性的識別事件。許多效應組分涉及病原體的病原體抑制(pathogen arrest)，包括活性氧物質、植物毒素的產生、宿主細胞死亡的激活、致病相關蛋白的累積和植物細胞壁的交聯。這些反應中的大多數也表明出在大麥/白粉病相互作用中被激活。幾個R基因觸發的抗病反應和抗病反應中被激活的多數效應組分需要Rar1，這使得我們提出Rar1蛋白作為R基因識別的「下遊」，但為完成該反應的「上遊」。因此，Rar1很可能代表R基因觸發的抗性的信號中的趨同點。
對所述Rar1蛋白序列的精細研究和與水稻和擬南芥屬同源體的比較，揭示出一個顯著的三聯結構(命名為結構域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ-圖6)。有趣的是，結構域Ⅰ和Ⅲ長約60aa，分別位於Rar1的氨基末端和羧基末端附近，它們在結構上相互相關。值得注意的是結構域Ⅰ和Ⅲ中嚴格保守的半胱氨酸和組氨酸殘基的模式(pattern)。
所述結構域特徵不僅在植物Rar1同源體中保守，而且也在來自麴黴屬、果蠅屬、Caenorhabditis、小鼠和人的蛋白中鑑定的每種其它相關肽序列段中發現。我們已經將這種新蛋白結構域命名為「CHORD」(Rar1的結構域Ⅰ中的實施例被稱為「CHORD1」，而結構域Ⅲ中的實施例被稱為「CHORD2」)。除半胱氨酸和組氨酸殘基特徵性字符串外，CHORD還含有少數其它不變胺基酸-Gly23、Phe47和Trp54以及位置49中的一個帶負電荷殘基和位置52的一個帶正電荷殘基(編號是指大麥Rar1中的氨基末端CHORD結構域的編號)。CHORD在這樣多樣化的過江藤屬(phyla)中保守是保持相似三維結構的選擇壓力的指示，其中半胱氨酸和組氨酸殘基起主要作用。在胞內蛋白結構域中保守的半胱氨酸和組氨酸殘基字符串通常顯示出涉及結合鋅離子。然而，CHORD中這些殘基的模式不同於先前描述的任何鋅結合結構域，在先前描述的鋅結合結構域中鋅離子具有穩定小的、自主摺疊和功能性蛋白結構域(例如TFⅢa鋅指、GAL4鋅指、雌激素受體中的鋅結合結構域、LIM結構域、RING指結構域和GATA-1指結構域)的結構作用。
CHORD結構域(例如CHORD1和CHORD2)可以表示為C-x4-C-x10-13-C-x2-H-x6-y1-x6-7-C2-x15-C-x4-5-H,也可以是C-x4-C-x13-C-x2-H-x6-H-x7-C2-x15-C-x4-H。
特別是，根據對鋅結合所需的半胱氨酸和組氨酸空間關係的結構限制，按照本發明的CHORD結構域可以符合下式C-x3-G-C-x3-A1-x6-9-C-x2-H-x5-F-y1-A2-x1-2-A3-x1-W-x1-C-C-x15-C-x4-5-H，其中C、G、F和W分別為Cys、Gly、Phe和Trp的單字母代碼，A1為芳族胺基酸，可以選自Phe、Trp和Tyr,A2為帶負電荷殘基，可以選自Glu和Asp,A3為帶正電荷殘基，可以選自Arg、His和Lys,y1為H或任何胺基酸，最好為His或Arg，而X可以是任何胺基酸(其編號顯示胺基酸編號)。
植物Rar1樣蛋白中的結構域Ⅲ看來含有另一組半胱氨酸和組氨酸殘基，提供按照本發明的一個結構域C-x2-C-x5-C-x2-H。
該結構域結合酵母SGTl基因擬南芥屬同源體編碼的蛋白(Kitagawa等(1999)Mol Cell 1:21-34)。
大麥Rar1的分子分離和在水稻和雙子葉植物擬南芥中發現相關基因，使得它有可能是所有高等植物基因組中的一種組分。在植物Rar1同源體中序列保守的程度，使得它們可能也共享相關的功能。在系統獲得性抗性中關鍵的調節基因擬南芥NPR1基因適當的2-3倍的過量表達導致對病原體寄生疫黴和丁香假單胞菌的完全抗性[Cao,1998]，提供了指示，指示可以採用調節穩態水平的Rar1 mRNA或蛋白來改變抗病反應的速度和病原體範圍。通過將該基因融合於來自致病相關基因(PR基因)的啟動子來再指導Rar1表達，也可以用來拓寬Rar1介導的病原體抗性譜。該方法在結合Rar1蛋白衍生物的表達中特別有吸引力。例如，可以鑑定出其激活與R基因去偶聯且保留其激活下遊反應(PR基因激活，HR)的修飾形式的Rar1蛋白。植物Rar1蛋白的已鑑定的三聯結構域可以用於指導這些實驗。
用於高解析度遺傳作圖和物理作圖的其它材料和方法植物材料在Torp和J rgensen 1986中描述了衍生自突變體M82(rar1-1)和M100(rar1-2)的大麥(Hordeum vulgate)雙單倍體系Sultan-5和Sultan-5的種子。Sultan-5和所述突變體含有肉眼可見的標記基因ant2。(葉鞘中花色素苷缺乏)。K lster等1986；K lster和St len 1987中描述了栽培品種Siri和Pallas中的Mla-12回交(BC)系。
通過與大麥栽培品種Ingrid回交7次，然後至少自交7代，產生栽培品種Ingrid中的Mla-12BC系。突變體M82和M100分別用得自Mla-12BC系栽培品種的花粉傳粉，培育每個雜交的F1植株至成熟，提供各種分離F2群體。
一個得自雜交Nipponbare×Kasalath的186株單株的分離F2群體(Kurata等1994)用來在水稻中作圖。在得自雜交IR20×63-83的123株單株的第二個分離F2群體(Quarrie等1997)中，獨立測試基因座MWG876在水稻中的圖譜位置。
抗性試驗如Freialdenhoven等1994中所述進行抗性試驗。在自交和隨後在包含至少25株單株的F3和F4家族中的接種實驗後，測定重組體的表型。通過可切割可擴增多肽序列分析(CAPS)測試F3單株，以鑑定純合重組體。將這些植株再次自交，並在F4家族中進行抗性試驗。在接種後7天記錄植株的抗病性/感病性。
脈衝場凝膠電泳(Pfge)和DNA印跡分析採用按照Siedler和Granner(1990)的方法，從5-7日齡幼苗的葉片材料中分離大麥高分子量DNA。採用Ganal和Tanksley(1989)的方案，用6種罕有切割的限制酶(ClaⅠ、MluⅠ、SalⅠ、NotⅠ、SfiⅠ、SgfⅠ、SmaⅠ)消化DNA。對於大小分級分離，在LKB PulsaphorTM儀(PharmaciaBiotech,Upsala，瑞士)中，以180V、脈衝時間為10-60s(線性內推法)、在0.5×TBE(50mM Tris-HCl,50mM硼酸，1mM EDTA,pH8.3)中於12℃進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳達25小時。如Lahaye等(1996)中所述，進行毛細管轉移和非放射性DNA印跡雜交。
AFLP/CAPS分析按照Stewart和Via(1993)分離用於CAPS和AFLP的基因組DNA。引物PCR條件和用於CAPS標記呈現(isplay)各個限制酶示於表1。在20μl體積(每種引物各100pmole、200μM dNTPs、10mM Tris-HClpH8.3、2mM MgCl2、50mM KCl2、0.5U Taq聚合酶(Boehringer))中，用50ng大麥基因組模板DNA進行CAPS分析。隨後消化的PCR產物在2％瓊脂糖凝膠上進行大小分離。在抗病植株和感病植株的混合DNA樣品(Giovannoni等1991；Michelmore等1991)上，採用PstⅠ和MseⅠ限制酶、PstⅠ和MseⅠ連接物和一組於3』端分別具有兩個或三個選擇性核苷酸的對應於PstⅠ和MseⅠ連接物的引物進行AFLP分析(Vos等1995)。利用7個PstⅠ+2個(2個選擇性鹼基)-和56個MseⅠ+3(3個選擇性鹼基)-引物，總共分析392個組合。
用於分析YAC的其它材料和方法大麥YAC文庫篩選採用CAPS標記MWG87篩選各代表96個酵母克隆的428個YAC庫的DNA(Simons等1997)。通過菌落PCR進一步分析MWG87擴增子陽性的YAC庫，以鑑定單個酵母克隆。所觀察的擴增子在瓊脂糖凝膠上進行大小分離，將其切下並用Quiaquick凝膠提取試劑盒(QuiagenGmbH,Düsseldorf，德國)純化。純化的PCR產物經過染料終止子測序(dye terminator sequencing)(Perkin Elmer Corp.,Norwalk,CT,USA)，以確證產生的擴增子對應於MWG87單拷貝基因座。隨後用CAPS標記MWG876研究所觀察的各個YAC克隆。CAPS標記MWG87和MWG876的循環條件和所用的引物如本文所述。對於菌落PCR分析，將最初的變性步驟從2分鐘延長至4分鐘。
植物材料雙端體小麥/大麥附加系的種子如Shepherd和Islam 1981；Islar1983中所述。
CAPS分析按照(Stewart和Via 1993)提取用於基於PCR分析的植物DNA。YAC末端特異性標記的引物和PCR條件列於表4中。在20μl體積(每種引物各100 pmole、200 μM dNTPs、10 mM Tris-HCl pH 8.3、2 mMMgCl2、50 mM KCl2、0.5 U Taq聚合酶(Boehringer))中，用200/50 ng小麥/大麥基因組模板DNA進行PCR。將對應於所述不同YAC末端的擴增子克隆到pGEM-T載體(Promega,Southampton，英國)中，並對每種PCR產物的3個獨立克隆進行染料終止子循環測序(Perkin Elmer)。
YAC的PFGE DNA印跡分析將各個YAC克隆於30℃在100ml缺乏尿嘧啶和色氨酸的合成葡萄糖(SD)基本培養基(Rose等1990)中培養2天。如Carle等(1985)所述，在低熔點瓊脂糖中製備高分子量酵母DNA。在LKB PulsaphorTM儀(Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞士)中，以180V、脈衝時間為10-80s(線性內推法)、在0.5×TBE(50mM Tris-HCl,50mM硼酸，1mM EDTA,pH8.3)中於12℃用1.2％瓊脂糖凝膠(SeakemTMLE；FMC BioProducts,Rockland,ME，美國)電泳30小時，進行酵母染色體的分離。隨後如Lahaye等所述(1996)，用MWG87作為探針進行DNA印跡雜交，以確定所述YAC插入片段的大小。
YAC末端序列的分離按照Silverman等(1989)所述，通過反向PCR(IPCR)分離YAC插入片段的末端序列。所觀察的擴增子在瓊脂糖凝膠上進行大小分離，將其切下，用Quiaquick凝膠提取試劑盒(Quiagen)純化，並進行染料終止子測序(Perkin Elmer)。為了通過另一次IPCR進一步延長YAC末端，根據相應的YAC末端的測序信息推導出了新的寡核苷酸。
資料庫檢索採用Genetics Computer Group(GCG)的程序和用於Unix用戶的STADEN軟體包(第4版，1994)，進行YAC末端序列的分析。實施例2在大麥中激活不依賴於R基因觸發物、依賴於Rar1的宿主細胞死亡通過傳遞用標準的基因克隆法(Sambrook等1989)獲得的合適構成物，進行側翼為Ubil-內含子1(Wan和Lemaux1994)的已知玉米遍在蛋白啟動子(Ubill啟動子)大麥下遊中全長和截短的Rar1基因衍生物的過量表達。
簡而言之，通過缺失GFP並取而代之插入目的RAR-1基因(例如全RAR-1基因，或編碼例如如分別由圖5B和圖5D序列編碼的圖5A和圖5C中所示序列的N末端部分或C末端部分的序列)，修飾載體pUBI-GFP(Carlsberg Research Laboratory,Copenhagen，丹麥)。克隆所述構成物後，採用合適的瞬時轉化方案給予它們，以由大麥製備7日齡植物葉片切片。
用於瞬時轉化的植物材料通過在70％乙醇中溫育1分鐘，在Milli-Q水中洗滌3次，然後在1.5％次氯酸鈉中溫育10分鐘中，並在無菌Milli-Q水中洗滌5次，將大麥栽培品種Golden Promise的種子消毒。將種子播種在含2cm蛭石的品紅(15粒種子/樣品)，供應補充2％蔗糖的30ml 1/2強度MS基礎培養基(Sigma)，並於22C培育(16h光照/8h黑暗)。
切下7日齡幼苗胚芽鞘上的初生葉，並將其切成兩個3cm的部分。將樣本在培養皿中的3ml 10％蔗糖上溫育3小時，讓植株材料飄浮。此後去除蔗糖溶液並將植物材料風乾5分鐘，然後進行粒子轟擊。
瞬時轉化的方法轉化方法採用粒子流入槍(particle inflow gun)(PIG)(Vain等1992)。按照Klein等1988的方法，將構成物沉澱到金粒子(1μm,Bio Rad)上，每次轟擊引入1μg Quiagen純化的質粒。將植物材料置於粒子出口下9cm，覆蓋孔徑為0.4mm的不鏽鋼柵極。轟擊條件是用2735mbar氦氣於100mbar氣壓下加速粒子。在傳遞所述DNA後，立即將補充3％蔗糖和1mM苯並咪唑的約4ml無菌1/2強度MS基礎培養基加入樣品中，然後在黑暗中於24℃培育24小時。
結果通過錐蟲藍染色證實細胞死亡簇的外觀。通過在酒精乳酚(96％乙醇-乳酚1∶1 [v/v]，含有0.1mg/ml錐蟲藍(Sigma))煮沸8分鐘將葉片樣本染色，並在水合氯醛溶液(2.5mg/ml)中透明過夜。
選擇在瞬時測定中激活宿主細胞死亡的Rar1構成物，用於在轉基因植物中進一步修飾。實施例3通過融合於致病相關基因(Pr基因)的啟動子在大麥中表達激活細胞死亡的Rar-1衍生物已知PR基因在嘗試的病原體攻擊位點周圍以高水平被激活。
將激活細胞死亡的Rar-1衍生物融合於大麥基因HvPR1-a和HvPR1-b的2kb啟動子序列(Bryngelsson等1994)。已知這些基因在葉片組織中對不同病原體(包括白粉病、Drechslera teres和大麥柄鏽菌(Puccinia hordei))侵染反應而被激活(Reiss和Bryngelsson1996)。
按照標準克隆法(Sambrook等1989)，通過取代pAHC25的uidA報導基因和玉米遍在蛋白啟動子，將HvPR1-a和HvPR1-b啟動子與本文提供的激活細胞死亡的Rar1衍生物的融合體克隆到載體pAHC25(Wan和Lemaux 1994)中。按照Wan和Lemaux1994中所述的方法，用pAHC25中的選擇標記基因bar產生栽培品種Golden Promise的轉基因大麥植株。
在用白粉病、大麥柄鏽菌和Drechslera teres孢子的不同分離物接種後，測試轉基因系的廣譜抗性。觀察到表現出對所述分離物抗性的植株。
不依賴於R基因觸發物、依賴於Rar1的宿主細胞死亡的激活通過傳遞用標準的基因克隆法(Sambrook等1989)獲得的構成物，進行側翼為Ubil-內含子1(Wan和Lemaux 1994)的已知玉米遍在蛋白啟動子(Ubil啟動子)大麥下遊中全長和截短的Rar1基因衍生物的過量表達。簡而言之，通過缺失Mlo並取而代之插入目的RAR-1基因(例如全RAR-1基因，或例如編碼分別由例如圖5B和圖5D序列編碼的圖5A和圖5C中所示序列的N末端部分或C末端部分的序列)，修飾載體pU-Mlo(通過用1.8kb Mlo cDNA(Büischges等1997；Shirasu K.等，1999,Plant J.,17(3):293-299)取代pUBI-GFP中的GFP而構建)。克隆所述構成物後，採用合適的瞬時轉化方案給予它們，以由大麥製備7日齡植物葉片切片(對此請參見實施例2)。
結果通過錐蟲藍染色證實細胞死亡簇的外觀。通過在酒精乳酚(96％乙醇-乳酚1∶1[v/v]，含有0.1mg/ml錐蟲藍(Sigma))煮沸8分鐘將葉片樣本染色，並在水合氯醛溶液(2.5mg/ml)中透明過夜。
選擇在瞬時測定中激活宿主細胞死亡的Rar1構成物，用於在轉基因植物中進一步修飾。實施例4在雙子葉植物中表達激活細胞死亡的Rar-1衍生物這一點不依賴於R基因觸發物(如實施例2中關於大麥的敘述)而達到，並且通過融合於致病相關基因(Pr基因)的啟動子而完成(如實施例3中關於大麥的敘述)。
如以上關於大麥所述的程序，採用表面消毒的擬南芥屬(生態型Columbia)和番茄種子(栽培品種Moneymaker)製備植物材料。
用含p35S-Rar1構成物的農桿菌菌株C58浸潤4周齡植株的葉片，在所述構成物中Rar1衍生物由T-DNA載體pBIN19(Bevan,1984)中的35S CaMV啟動子驅動。結果通過錐蟲藍染色證實細胞死亡簇的外觀。通過在酒精乳酚(96％乙醇-乳酚1∶1[v/v]，含有0.1mg/ml錐蟲藍(Sigma))煮沸8分鐘將葉片樣本染色，並在水合氯醛溶液(2.5mg/ml)中透明過夜。
選擇在瞬時測定中激活宿主細胞死亡的Rar1構成物，用於在轉基因植物中進一步修飾。實施例5在擬南芥屬中表達激活細胞死亡的At-Rar1衍生物在擬南芥屬中全長和截短的AtRar1基因衍生物的誘導型表達中，採用糖皮質激素介導的轉錄誘導系統(Aoyama和Chua,1997,PlantJournal 11,605-612)。
通過用XhoⅠ和SpeⅠ位點，插入選自圖8A-8H的目的At-Rar1序列，即全長At-Rar1基因、編碼其N末端部分的序列、編碼其內部部分的序列或編碼其C末端部分的序列，修飾載體pTA231(TheRockefeller University,New York,USA)。用來擴增AtRar1基因片段的引物是對於全長AtRar1部分，OK228 5』-CCTCGAGACTCCTACCTTCTCAATTCGTCCG-3』和OK232 5』-AACTAGTATCAGACCGCCGGATCAGG-3』，對於N末端部分，OK228和OK2295』-AACTAGTCAGGCCAGAACTGGTTTCTCAGTTGT-3』對於內部部分，OK230 5』-AACTAGTCAAGCCTTTTGTACTGGAGGCGC-3』和OK231 5』ACTCGAGATGGCCAAATCGGTTCCAAAACATC-3』，而C末端部分，OK233 5』-ACTCGAGATGGCTGTGATAGACATTAATCAACCGC-3』和OK232。
採用標準擬南芥屬轉化方案(Clough和Bent,1998,Plant Journal 16,735-743)，用含上述構成物的農桿菌菌株C58轉化擬南芥屬植物。參考文獻Anderson et al.(1997).The Plant Cell 9,641-651.Bennett,M.D.,and Smith,J.B.(1991).Nuclear DNA amountsin angiosperms.In Philosophical Transactions of the RoyalSociety of London B Biological Sciences(London:RoyalSociety),pp.309-345.Bent et al.(1994).Science 265,1856-1860.Bevan M.Nucleic Acids Research,1984,Vol.12,No.22,pp.8711-8721Bickmore,W.A.,and Bird, A.P.(1992).Methods InEnzymology 216,224-244.Brown,J.W.S.(1996).The Plant Journal 10,771-780.Bryngelsson T.et al.,Molecular Plant-Microbe Interactions,1994,Vol.7,No.2,pp.267-275Büschges et al.(1997).Cell 88,695-705.Cai et al.(1997).Science 275,832-834.Cao et al.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,6531-6536.Carle et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,3756-3760.Century et al.(1995).Proceedings of the National Academy ofSciences, USA 92,6597-6601.Century et al.(1997).Science 278,1963-1965.Devereux et al.(1984).Nucleic Acids Res.12,387-395.Dixon,R.A.,and Lamb,C.J.(1990).Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology 41,339-367.Flor,H.H.(1971).Annual Review of Phytopathology 9,275-296.Freialdenhoven et al.(1994).The Plant Cell6,983-994.Giovannoni et al.(1991).Nucleic Acids Res19,6553-6558.Goodall,G.J.,and Filipowicz,W.(1991).EMBO Journal 10,2635-2644.Graner et al.(1991).Theor Appl Genet 83,250-256.Grant et al.(1995).Science 269,843-846.Hammond-Kosack et al.(1994).The Plant Cell6,361-374.Hammond-Kosack,K.E.,and Jones,J.D.G.(1996).Plant Cell8,1773-1791.Islam,A.K.M.R.(1983).Ditelosomic Additions Of BarleyChromosomes To Wheat.In Proc.6th International WheatGenetics,Kyoto,Japan,pp.233-238.Jones et al.(1994).Science 266,789-793.J rgensen,J.H.(1996).Genome39,492-498.J rgensen,J.H.(1988).Genome30,129-132.Klein T.M.et al.(1988).Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,4305-4309K lster et al.(1986).Crop Science 26,903-907.K lster,P.,and St 1en,o.(1987).Plan Breeding 98,79-B2.Krawczak et al.(1992).Human Genetic 90,41-54.Kurata et al.(1994).Nature Genetics 8,365-372.Lahaye et al.(1996).BioTechniques 21,1067-1072.Larsen et al.(1992).Genetic Analysis Techniques andApplications9,80-85.Lawrence et al.(1995).The Plant Cell7,1195-1206.Martin et al.(1993). Science 262,1432-1436.Maurel,C.(1997).Annual Reviews of Plant Physiology andPlant Molecular Biology 48,399-429.Michelmore et al.(1991).Proceedings of the National Academyof Sciences,USA 88,9828-9832.Mindrinos et al.(1994).Cell 78,1089-1099.Ori et al.(1997).The Plant Cell 9,521-532.Parker et al.(1996).The Plant Cell 8,2033-2046.Peterhansel et al.(1997).Plant Cell 9,1397-1409.Quarrie et al.(1997).Plant Mol Biol 35,155-165.Reiss E. Bryngelsson T.Physiological and Molecular PlantPathology,1996,Vol.49,No.5,pp.331-341.Rose et al.(1990)Methods in Yeast Genetics.Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,USA.Russel et al.(1997).Theoretical and Applied Genetics 95,714-722.Salmeron et al.(1994).The Plant Cell 6,511-520.SanMiguel et al.(1996).Science 274,765-768.Shepherd,K.W.,and Islam,A.K.M.R.(1981).Wheat:BarleyHybrids-The First Eighty Years.In Wheat science-todayand tomorrow,L.T.Evans and W.J.Peacock,eds.(Cambridge:Cambridge University Press),pp.107-128.Silverman et al.(1989).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,7485-7489.Simons et al.(1997).Genomics 44,61-70.Song et al.(1995).Science 270,1804-1806.Suoniemi et al.(1996).Plant Molecular Biology 30,1321-1329.Torp,J.,and J rgensen,J.H.(1986).Canadian Journal ofGenetics and Cytololgy 28,725-731.Vain,P.et al.,(1993).Plant Cell Tissue and Organ Culture33,237-246.Vos et al.(1995). Nucleic Acids Research 23,4407-4414.Yoshimura et al.(1998).Proceedings of the National Academyof Sciences,USA 95,1663-1668.
表1通過在栽培品種Sultan-5中的DNA印跡分析檢測到的PFGE分離的限制片段的大小(kb)探針MWG876 MWG87 MWG892ClaⅠ 35050110MluⅠ 550550 260NotⅠ 90 530 170SalⅠ 90 240 310SfiⅠ 120100 140SgfⅠ 580165 NDSmaⅠ 90 100 80ND，未檢測到表2YAC重疊分析YAC末端特異性標記Y18 Y18 Y30 Y30 Y31 Y31 Y73 Y73 Y113 Y113大麥YAC LRLRLRLR LRY1 ----+--- --Y2 ----+--- --Y18 ++-++--- -+Y30 -++++-+- --Y31 -++-+++- --Y73 -+--+-++ --Y113----+--- ++A正號(+)表示通過PCR分析上述各個標記，YAC為陽性。無標記表示為負號(-)
表3基於PCR的YAC末端特異性標記標記 引物PCR條件Y18L 5′-TCCCTCGTTCTATGGTCACGGTTG 94℃,10s5′-CATGCCCAGCCTGATGCATTG 60℃,20s72℃,90sY18R 5′-GAATGATGTGCCCGTGCGTGC 94℃,10s5′-GCGACGCTTCCCACCTGCAG 60℃,20s72℃,40sY30L 5′-CGATAGGTGGTAGATTTTTGACATCTTCAG 94℃,10s5′-GCTCATCCAGCTACAGAATGCTTTATG60℃,20s72℃,40sY30R 5』-GGTGAGCTGCAGGAAACGGTCC 94℃,10s5』-AGGCCAGAGTACTCCGATCGAATGG 60℃,20s72℃,30sY31L 5』-CGCCTTCTTGATCTAGCAAGAGACACG94℃,10s5』-GCGGAGTACATGGCTGCCTTGG 60℃,20s72℃,60sY31R 5』-TATGCTGACTACTGCACTCCTGATGAGG 94℃,10s5』-GAGGCTGTGAGGACTGTGGTGCTG 60℃,20s72℃,60sY73L 5』-TGGTATCAGAGCAGTACCGACCTGG 94℃,10s5』-GAGATAACTTCAACGCTCCGGATCG 60℃,20s72℃,90sY73R 5』-GCGGCAGTCGCTCGGGCGCACAGG 94℃,10s5』-CTCAGGAAATCAGAAAATGTTCACG 60℃,20s72℃,90sY113L 5』-CAGCGGCTGGACGTCCGAC94℃,10s5』-GGACGTCCAAGGGCCGGAC60℃,20s72℃,30sY113R 5』-CAGGGGAGATTTTTTACAATCACG 94℃,10s5』CCATTACCTGGGCTGGCCCAT 58℃,20s72℃,60s已經用於高解析度遺傳作圖的YAC末端以斜體顯示。所有PCR反應均以於94℃最初變性2分鐘的步驟開始。隨後進行35個所示條件的循環。
表4與Rar1基因座連鎖的CAPS標記標記 引物 PCR 限制酶條件cMWG6945』-AGTATCAGATGCTACCATGCCTGG 94℃,10sHaeⅢ5』-CTCTGGAGGAGCCGAGTGTCAGC60℃,20s72℃,30sMWG87 5』-ATCAAACCAAGCAAAGGTCCCTTG 94℃,10sTruⅠ5』-CTGCAGGCGCACTTTAGGGGAAC58℃,20s72℃,30sMWG503 5』-CGTCAGAGCCCACGCCACACGTAG 94℃,10sHin6Ⅰ5』-GCCGAACGTGCTCCAAGCGGCAAC 60℃,20s72℃,40sMWG876 5』-GTGGTCAAGGGCTTGTAGACTGGGTAC94℃,10sMvaⅠ5』-GCCCATCGGTGGTCGCCGTAGTCGCG 60℃,20s72℃,30sMWG892 5』-GGAATCTTCCAGTGGGCTGGATGAG 94℃,10s-5』-CAACCGGCCACTAGGCGTAAAGG60℃,20s72℃,30sMWG21235』-CTGCGGCGAGAGCTTGAGAGCAGT 94℃,10sBclⅠ5』-GTGTGCATGGTCTCTTCCGCCCCG 60℃,20s72℃,60sOK1114 5』-CCATGTCTTGTCCATGATGCACC94℃,10sHindⅢ5』-GCCATCTAGCTACTAACTATGGACCCG60℃,30s72℃,90sOK3236 5』-GACAGTAGCAGAGTGGTTGCACCG 94℃,10s5』-CCACATGCACACAAGTATATGCACAC 62℃,30s72℃,60sOK5558 5』-GCGATATGGAGATCAAAACCCTCA 94℃,10s5』-CACGAAATGCCTATGAACCATTCG 64℃,30s72℃,90sEdda 5』-ACTTTAAACTTGCTGGCGACAAGAGAC94℃,10sHinfⅠ5』-GGAGTTGGCTTACTTACCGTATCACATAC 64℃,10s72℃,30s顯示在進行於94℃最初變性2分鐘的步驟和35個循環後的所有CAPS標記。對應於RFLP基因座MWG892的擴增產物揭示出在PCR過多後進行分析消化的Rar1突變體以及Mla12 BC系Ingrid、Pallas和Siri中的長度不同。RFLP基因座OK3236和OK5558揭示出僅在Rar1突變體以及Mla12BC系Ingrid和Pallas長度不同。
表5與間隔Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅰ3具有序列相似性的Gene Bank登錄號間隔 位置 Gene Bank 描述 計分E值登錄號 Blast 2.011 43500-45000 AF057183玉米推定的tonoplast aquaporin mRNA496 1.00E-138D23748 水稻cDNA，部分序列(R0063_1A) 218 1.00E-54AJ005078黑挪威雲杉(Picea abies)的aquaporin樣蛋白的mRNA168 1.00E-39X80266 (H.vulgare)γ-TIP樣蛋白的mRNA 159 1.00E-36AF037061玉米tonoplast內在蛋白tip1 139 1.00E-30D40090 水稻cDNA，部分序列(S1835_1A) 135 2.00E-29D25534 水稻γ-Tip mRNA，全cds127 5.00E-27C72141 水稻cDNA，部分序列(E1069_3A) 127 4.00E-27D41197 水稻cDNA，部分序列(S3526_1A) 123 6.00E-26D39818 水稻cDNA，部分序列(S1424_2A) 123 6.00E-2612 45001-46500 D40090 水稻cDNA，部分序列(S1835_1A) 90 1.00E-15D23748 水稻cDNA，部分序列(R0063_1A) 78 5.00E-12D40435 水稻cDNA，部分序列(S2414_2A) 76 2.00E-11D41992 水稻cDNA，部分序列(S5055_1A) 76 2.00E-11D40210 水稻cDNA，部分序列(S2017_2A) 76 2.00E-11D25114 水稻cDNA，部分序列(R3240_1A) 76 2.00E-11D42002 水稻cDNA，部分序列(S5071_1A) 76 2.00E-11D41421 水稻cDNA，部分序列(S3914_1A) 76 2.00E-11AF057183玉米推定的tomoplast aquaporin mRNA72 3.00E-09D41197 水稻cDNA，部分序列(S3526_1A) 70 1.00E-0913 56000-61000 C28356 水稻cDNA，部分序列(C60815_1A) 105 2.00E-53L37995 蕪菁(Brassica rapa(克隆F016)已表達序列標記50 0.008
表6用於擴增Rar1基因組和cDNA的引物引物 序列OK94 5』-GTGCGCCTGCAGTTACTTGTAGCOK96 5』-TCTTATGCTGCTGCACTTGTGGGOK97 5』-GTATGTTGACAAGTGATCCTCCACTGOK98 5』-GCCTCCTCTCATTCTAGACCACAGTGOK99 5』-CTCAGAGCTCACCCAAGCAGCAGOK100 5』-CTGCAGGACCTGGATGGTAATCGOK101 5』-CATAGGCTGCGACGCCATGOK102 5』-CTGGTTTCTCAGTTGTATGCTTCCCOK103 5』-GGTAGTGGCAGGAGCATCGGOK104 5』-GCTTGCAACAGCTCCACTCTTTCOK105 5』-GGAGAAGGATAACCATGATGCTGCOK106 5』-GGGAAGCATACAACTGAGAAACCAGOK109 5』-GACTCAGCAGCTGTCCCGATTCOK110 5』-CAACCCCGATGGCTCCTGCCACTACCACOK111 5』-GCAGGACCTGGATGGTAATCGCATGCAGCOK112 5』-CCTGCATTAAGATCACGGCACTC
表7與大麥Rar1具有相似性的Gene Bank登錄號基因 Gene Bank bp 生物 tblastn 2.0名稱 登錄號AtRar1-h1 AB010074 擬南芥 324OsRar1-h1 c28356 424稻(Oryza sativa) 158BrRar1-h1 L37995 367蕪菁 92AA134808452智人(Homo sapiens) 77W92190 435智人 59AA249751291智人 71AA216041352智人 70AA313760416智人 42AA346843399智人 69AA382946314智人 85AA311950431智人 84AA385686347智人 82AA313823520智人 79W20519 460智人 77AA581174385智人 75AA333125276智人 71AA355517240智人 61AA333321251智人 45AA249829370智人 75AA249107205智人 61AA222387430小家鼠(Mus musculus) 74AA117998466小家鼠 58AA049028473小家鼠 85W83076 463小家鼠 85AA268197506小家鼠 83AA896237430小家鼠 78AA409037328小家鼠 78AA959286374小家鼠 80AA050833373小家鼠 80W12728 439小家鼠 80AA571713349小家鼠 78W70829 418小家鼠 78AA052424449小家鼠 77AA240093479小家鼠 77AA171338274小家鼠 77W83689 454小家鼠 77W10223 277小家鼠 73W41418 336小家鼠 48W98189 500小家鼠 80BmRar1-h1 AA509002307馬來絲蟲(Brugia malayi) 79DntRar1-h1 AA141981566黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)75TgRar1-h1 N81452 430鼠弓形體(Toxoplasma gonii) 74TbRar1-h1 W06674 330布氏錐蟲(Trypanosoma bruei) 68EnRar1-h1 AA965935339Emericella nidulans 47CeRar1-h1 Y110A7.90 Caenorhabditis elegans 190
權利要求
1．分離的多核苷酸，其編碼的多肽在植物病原體防衛反應信號途徑中起作用，所述多肽包括與圖1所示胺基酸序列具有至少70％胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
2．按照權利要求1的分離多核苷酸，其中所述多肽具有圖1所示的胺基酸序列。
3．按照權利要求2的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸具有圖1所示的編碼序列。
4．分離的多核苷酸，其編碼的多肽在植物病原體防衛反應信號途徑中起作用，所述多核苷酸在嚴格條件下選擇性地與為圖1所示Rar1編碼核苷酸序列互補物的探針雜交。
5．分離的多核苷酸，其編碼圖5A、圖5C或圖6中所示的大麥Rar1片段。
6．按照權利要求5的分離多核苷酸，其中所述多肽具有圖5B或圖5D所示編碼序列或圖7所示的編碼序列之一。
7．分離的多核苷酸，其編碼圖8D、圖8F或圖5H中所示的擬南芥屬Rar1片段。
8．按照權利要求7的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸具有圖8C、圖8E或圖8G所示的編碼序列。
9．分離的多核苷酸，其中按照權利要求1-8中任一項的多核苷酸或選自以下的多核苷酸有效連接於用於表達的調節序列(ⅰ)多核苷酸，編碼圖3所示的OsRar1-h1胺基酸序列；(ⅱ)多核苷酸，編碼圖3所示的AtRar1-h1胺基酸序列；(ⅲ)多核苷酸，其編碼的多肽在植物病原體防衛反應信號途徑中起作用，所述多肽包括與所述OsRar1-h1或AtRar1-h1胺基酸序列具有至少70％胺基酸序列同一性的胺基酸序列；(ⅳ)多核苷酸，其編碼的多肽在植物病原體防衛反應信號途徑中起作用，所述多核苷酸在嚴格條件下選擇性地與探針雜交，所述探針為編碼所述OsRar1-h1的GenBank登錄號c28356或編碼所述AtRar1-h1的GenBank登錄號AB010074的編碼核苷酸序列的互補物。
10．分離的多核苷酸，其核苷酸序列與互補於按照權利要求1-19中任一項的核酸編碼序列的編碼序列或序列的至少50個連續核苷酸互補，以適用於對所述編碼序列並在轉錄調節序列控制之下表達的反義或有義調節(「共抑制」)。
11．分離的多核苷酸，其編碼包含符合下式之一的CHORD胺基酸序列的肽(ⅰ)C-x3-G-C-x3-A1-x6-9-C-x2-H-x5-F-y1-A2-x1-2-A3-x1-W-x1-C-C-x15-C-x4-5-H(ⅱ)C-x2-C-x5-C-x2-H其中C、G、F和W分別為Cys、Gly、Phe和Trp的單字母代碼，A1為芳族胺基酸，A2為帶負電荷殘基，A3為帶正電荷殘基，y1為His或任何胺基酸，最好為His或Arg，而X可以是任何胺基酸，其編號顯示胺基酸編號，並且其中肽(ⅰ)結合鋅。
12．適用於轉化植物細胞的核酸載體，其包括按照權利要求1-11中任一項的多核苷酸。
13．宿主細胞，含有異源多核苷酸或按照權利要求1-12中任一項的核酸載體。
14．按照權利要求13的宿主細胞，其為微生物細胞。
15．按照權利要求13的宿主細胞，其為植物細胞。
16．按照權利要求15的植物細胞，在其染色體內具有異源所述多核苷酸。
17．按照權利要求16的植物細胞，其每個單倍體基因組具有一個以上的所述多核苷酸。
18．按照權利要求15-17中任一項的植物細胞，其包含於植物、植物部分或植物繁殖體或植物的提取物或衍生物中。
19．產生按照權利要求13-17中任一項的細胞的方法，所述方法包括通過轉化將所述多核苷酸或核酸載體摻入所述細胞中。
20．按照權利要求19的方法，所述方法包括使所述多核苷酸與所述細胞基因組核酸重組，以使其穩定摻入所述基因組核酸中。
21．按照權利要求19或20的方法，所述方法包括由一個或多個轉化細胞再生植株。
22．包含按照權利要求15-17中任一項的植物細胞的植物。
23．包含按照權利要求15-17中任一項的植物細胞的植物的部分或繁殖體。
24．產生植物的方法，所述方法包括將按照權利要求1-12中任一項的多核苷酸或核酸載體摻入植物細胞中，並由所述植物細胞再生植株。
25．按照權利要求24的方法，包括有性或無性繁殖或培育由所述植物細胞再生的植株的苗種或後代。
26．影響植物特性的方法，所述方法包括使得在所述植物的細胞中從按照權利要求1-11中任一項的異源多核苷酸進行轉錄。
27．按照權利要求1-11中任一項的多核苷酸在產生轉基因植物中的用途。
28．鑑定或獲得其編碼的多肽在植物病原體防衛反應信號途徑中起作用的多核苷酸的方法，所述方法包括用在嚴格條件下與權利要求4的多核苷酸或其互補物選擇性雜交的核酸分子篩選候選核酸。
29．具有至少約20-30個核苷酸的核苷酸序列的核酸探針或引物，所述序列示於圖1或與圖1所示編碼區互補。
30．按照權利要求29的引物對，其適用於擴增按照權利要求1-9中任一項的多核苷酸編碼區的片段。
31．從植物或植物細胞中鑑定或獲得其編碼的多肽在植物病原體防衛反應信號途徑中起作用的多核苷酸的方法，所述方法使用按照權利要求29或權利要求30的核酸探針或引物。
32．按照權利要求31的方法，包括(a)提供植物細胞的核酸製備物；(b)提供按照權利要求29的探針；(c)使所述核酸製備物與所述探針接觸，其接觸條件使得所述探針與編碼所述多肽的任何核酸選擇性地雜交；(d)如果存在編碼所述多肽的所述核酸，則根據其與所述探針雜交，鑑定出所述核酸；以及任選地(e)通過在表達系統中表達並確定在植物病原體防衛反應信號途徑中起作用的能力，證實由所述編碼的所述多肽的身份。
33．按照權利要求31的方法，包括(a)提供植物細胞的核酸製備物；(b)提供按照權利要求30的引物對；(c)使所述製備物中的核酸與所述引物在進行PCR的條件下接觸；(d)進行PCR並確定擴增PCR產物的存在與否；以及任選地(e)通過在表達系統中表達產生多肽並確定所產生的多肽在植物病原體防衛反應信號途徑中起作用的能力，證實所擴增PCR產物的身份。
34．由按照權利要求1-9中任一項的多核苷酸編碼的分離的多肽。
35．分離的抗體，其包含對按照權利要求34的多肽具有特異性結合親和性的抗原結合位點。
36．包含按照權利要求35的抗體的抗原結合位點的多肽。
37．鑑定或獲得按照權利要求34的多肽的方法，所述方法包括用按照權利要求35或權利要求36的抗體或多肽篩選候選多肽。
38．由按照權利要求11的多核苷酸編碼的分離多肽。
全文摘要
來自大麥、水稻、擬南芥屬的植物抗病性信號基因Rarl和來自其它物種的同源體。核酸和所編碼的多肽可用於調節植物信號途徑,導致植物病原體防衛反應和/或細胞死亡或由於R基因產物與病原體Avr蛋白互作實現的對病原體的抗性。
文檔編號C07K14/415GK1322248SQ9981173
公開日2001年11月14日 申請日期1999年8月6日 優先權日1998年8月6日
發明者P·M·J·舒爾策－萊菲爾特, K·施拉蘇, T·拉哈耶 申請人:植物生物科學有限公司