雙鏈引物聚合酶鏈反應的製作方法
2023-10-21 03:50:02 2
專利名稱：雙鏈引物聚合酶鏈反應的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種由含雙鏈引物的DNA體外擴增技術。
在現有的DNA體外擴增技術中，聚合酶鏈反應(polymeras chain reaction,PCR)是最主要也是最有效的技術。該技術系將含有耐熱DNA聚合酶、特異性引物、dNTP底物、模板DNA、鎂離子等的反應體系反覆進行高溫模板變性、低溫引物與模板結合、中溫引物延伸的熱循環，而使靶DNA片段在體外得到擴增。在常規的PCR中，很容易出現引物二聚體的擴增和其它非特異性的DNA擴增，從而降低特異性靶DNA擴增的效率，導致擴增的假陽性和假陰性，影響擴增結果的判定。這一缺點在以粗製的變性DNA標本作模板進行PCR時尤為突出。因而出現了幾種改良的PCR方法來克服上述問題。其中最成功的有下述三種1、熱啟動PCR，即所用試劑及擴增條件與常規PCR相同，只是不象常規PCR那樣在室溫或室溫以下將耐熱DNA聚合酶與其他成分預先混合好，而是在進入擴增的前夕，反應體系處於較高的溫度下(如80℃)時最後加入，加入酶之後隨即進入熱循環；2、固體石蠟膜法PCR，即預先將耐熱DNA聚合酶與其他反應成分隔開，而在進入擴增前隨著溫度升高到一定程度(如超過60℃)時，石蠟膜融化，DNA聚合酶與其他反應成分才開始混合，然後進入熱循環；3、抗體-酶法PCR，即用耐熱DNA聚合酶的單克隆抗體預先與酶結合，將其暫時滅活，在反應體系進入高溫後，抗體失活，酶被釋放出來發揮作用，並進入熱循環。上述三種方法都利用在較高溫度時讓酶促反應才開始進行，從而降低非特異擴增、提高特異擴增的效率。但它們也有缺點，例如第一種方法增加了操作的難度和汙染的機會，且不適合大批量的反應；第二種方法在反應結束後石蠟凝固，給取樣帶來困難；第三種方法需要價格昂貴的單克隆抗體。而且這三種方法本質上都屬於熱啟動PCR，即讓反應在較高溫度時才開始進行，而一旦反應開始後，就與常規PCR無異。
本發明目的在於提供一種操作簡單，不僅能夠在反應開始之前發揮作用，而且能夠在整個反應過程中發揮作用，從而提高特異性擴增、降低非特異性擴增效率的DNA體外擴增技術。
本發明雙鏈引物聚合酶鏈反應(doubl-strand primered polymerase chain reaction,DSP-PCR)首先根據待擴增的靶DNA序列合成一對特異性的單鏈引物，記作正引物，這一對正引物界定待擴增的靶DNA片段；再根據上述兩條引物序列分別合成與其互補的兩條引物，隨後將後者的3』-末端進行加雙脫氧核苷酸或磷酸化修飾，使其失去延伸能力，記作反引物；最後將正、反引物按小於1的比例混合併使正引物完全與修飾後的反引物退火成雙鏈引物。將雙鏈引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩衝液、超純水等混勻成反應體系，在熱循環儀上進行高溫、低溫、中溫的反覆熱循環。在反應體系混勻時，由於正引物全部以雙鏈引物的形式存在，即使溫度較低也不會形成引物二聚體及引物與DNA的非特異性結合，而仍保持單鏈狀態的剩餘部分反引物即便能夠非特異性地與DNA結合，因其沒有延伸能力，也不能形成擴增產物，只有當經過熱變性步驟後，正引物才釋放出來，發揮引物的作用，引導靶DNA片段的擴增。因而能夠起到熱啟動的效果。在反應過程中，反應體系由高溫降到低溫時，一部分解鏈為單鏈的正引物與特異的靶DNA結合引導靶DNA片段的特異擴增，同時，多餘的單鏈正引物能與單鏈反引物復性為雙鏈引物，迅速降低能夠引起非特異擴增的正引物的濃度，抑制非特異擴增的產生。當溫度再度升高時雙鏈引物又解鏈釋放出正引物，從而引導又一輪擴增。這樣經過25-35個熱循環後，就能獲得上百萬拷貝的特異的正引物界定的靶DNA片段。
下面以擴增脆性X智力低下1號基因(fragile X mental retardation 1,FMR1)的5』非翻譯區為例來進行詳細說明。鏈則在重複序列區新鏈延伸受阻，不能合成完整互補新鏈。75℃時ORS從(GCC)n模板鏈上脫離下來，使該模板此時可以指導合成完整互補新鏈。這樣經過25-35個熱循環後，就能獲得上百萬拷貝的特異的含重複序列的靶DNA片段。
權利要求
1.一種將含有雙鏈引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩衝液、超純水等的反應體系進行高溫、低溫、中溫反覆熱循環而達到目的DNA片段大量擴增的DNA體外擴增技術，其中的雙鏈引物為依據靶DNA序列合成的能夠延伸的一對正引物(包括一條正向引物和一條反向引物)和3』-末端經過修飾的不能延伸的與該對正引物分別互補的反引物退火而成。該雙鏈引物在PCR反應前的低溫條件下保持雙鏈狀態，不形成二聚體和非特異性退火；在PCR過程中的高溫時解鏈，釋放出正引物，使其在低溫時與靶DNA的相應區段退火，引導特異的DNA片段的合成；同時還可與反引物退火迅速降低正引物的濃度，降低反應過程中的非特異擴增。經過多次的熱循環，產生大量的靶DNA片段。
2.根據權利要求1所述的雙鏈引物DNA體外擴增技術，其特徵在於使用的引物為雙鏈引物。
3.根據權利要求2所述的雙鏈引物，其特徵為系依據靶DNA序列合成的能夠延伸的一對正引物(包括一條正向引物和一條反向引物)和3』-末端經過修飾的不能延伸的與該對正引物分別互補的反引物退火而成。
4.根據權利要求3所述的3』-末端經過修飾的不能延伸的與該對正引物分別互補的反引物，其3』末端進行磷酸化或加雙脫氧核苷酸修飾，或使用能夠與正引物特異結合但又不能在耐熱DNA聚合酶的作用下延伸的其他物質，如肽核酸(PNA)。
5.根據權利要求1所述的雙鏈引物DNA體外擴增技術，依據該技術裝配的DNA體外擴增試劑盒。
全文摘要
本發明是一種由含雙鏈引物的DNA體外擴增技術。首先根據待擴增的靶DNA序列合成一對特異性的單鏈引物，再分別合成與其互補的兩條引物，並對後者的3』－末端進行修飾，使其失去延伸能力，然後讓它們分別退火成雙鏈引物。將該雙鏈引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩衝液、超純水等混勻成反應體系，在熱循環儀上進行高溫、低溫、中溫的反覆熱循環，從而獲得上百萬拷貝的特異的靶DNA片段。本發明中用雙鏈引物取代常規PCR中使用的單鏈引物，不僅能夠達到熱啟動的效果，而且在整個反應過程中都能起到降低非特異擴增的作用。
文檔編號C12P19/00GK1238387SQ99114950
公開日1999年12月15日 申請日期1999年6月22日 優先權日1999年6月22日
發明者夏慶傑 申請人:夏慶傑