一種新橙皮苷的高通量酶法合成方法
2023-09-22 02:18:15
專利名稱：一種新橙皮苷的高通量酶法合成方法
技術領域：
本發明涉及食品添加劑領域，特別涉及低熱值甜味劑新橙皮苷二氫查耳酮(NHDC) 的酶法合成，具體是提供了一種新橙皮苷(NH)的高通量酶法合成方法。
背景技術：
NHDC是一種安全的低熱值甜味劑(蔗糖甜度的1500 1800倍)和苦味抑制 劑，熱穩定性好，應用pH範圍廣，在食品和醫藥領域廣為使用，常以新橙皮苷為前體通過 酶法或化學法合成(中國發明專利ZL02806186、 ZL200510055397和ZL200410042658)。 在其合成中，底物NH來源受限是主要的技術瓶頸。NH既可從枳實和枳殼中提取(中 國發明專利ZL200710111229、 ZL200810036498、 ZL200410025729、 ZL200710017735和 ZL200310112480)，也可通過柚皮苷轉化而來(中國發明專利03124495)，但是這兩種原 料在中國都極為有限。另一方面，在2007年中國柑橘種植面積(191萬公頃)和產量 (2095噸)分別躍居世界第一，柑橘加工產業中富含大量橙皮苷的橙皮廢棄物(約佔果 重的1/3，90%橙皮所含黃烷酮中都是橙皮苷佔優勢，約佔果皮重的7%，見中國發明專利 ZL200710034378)和工業廢水需要處理(含橙皮苷約1% )。因此，以來源廣泛的橙皮苷向 其同分異構體新橙皮苷的高效轉化，是值得關注的課題既可解決市場前景廣闊的甜味劑
NHDC合成前體NH來源問題，又可解決中國柑橘廢棄橙皮和加工廢水的處理和資源利用問 題。 研究報導的橙皮苷向NH的轉化方法主要有一種是酶法，以橙皮苷酶酶解橙皮苷 為葡萄糖基橙皮素糖苷(HG)，再以為葡萄糖基轉移酶作用HG得橙皮素，再把橙皮素接技 新橙皮糖後即可，相應中國發明專利ZL200610052962、 ZL200610051963 ;另一種是水解， 即以高溫酸水解橙皮苷為GH，再把GH分離後按酶法合成新橙皮苷，相應中國專利包括 ZL200810099008。上述技術存在如下問題 (1)底物橙皮苷水溶性差，即使在8(TC高溫下也只是微溶(小於lg/L)，影響橙皮
苷酶酶解效率。雖然國內已有關於水溶性橙皮苷製備的專利方法(如添加磺酸基、金屬離
子配位或是甲基化等)，但都是以提高橙皮的生物活性或是拓展橙皮苷的應用範圍為目的，
而不是以改進新橙皮苷的製備方法為目的，而且水溶性橙皮苷的分子結構和化學基團都已
發生變化，成為另一種物質，不一定適合於新橙皮的酶法或化學法製備。 (2)在高溫下對橙皮苷進行水解，水解副產物多，包括橙皮素、芸香糖、鼠李糖、葡
萄糖、葡萄糖基橙皮素等，使得目的產物GH的分離純化困難，還產生大量工業廢水需要處理。 (3)由於酶解反應效率低，或是橙皮苷化學法水解的分離純化過程複雜，上述二種 方法都難以工業化。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的缺陷，通過配位改性製備水溶性橙皮苷金屬配合物，再以此為底物，利用反應條件溫和、副反應少、易於工業化的固定化橙皮苷酶和鼠李 糖基轉移酶，高通量酶法製備目的產物NH，解決長期以來甜味劑NHDC合成前體(NH)來源受 限的技術瓶頸問題，提出一種解決中國柑橘工業廢棄橙皮的環境汙染和高值化資源利用問 題的新方法。 本發明的目的通過下述技術方案實現 —種新橙皮苷的高通量酶法合成方法，包括下述步驟 (1)橙皮苷與金屬離子溶液通過配合反應製備橙皮苷金屬配合物水溶液； (2)加固定化橙皮苷酶到步驟(1)所得橙皮苷金屬配合物水溶液中，發生酶解反
應，得橙皮苷酶解產物； (3)加固定化鼠李糖基轉移酶l，2-RhaT到步驟(2)所得橙皮苷酶解產物中，發生 酶解反應，得到新橙皮苷鹽； (4)去除步驟(2)所得新橙皮苷鹽中的金屬離子，得新橙皮苷。 作為優選，所述橙皮苷金屬配合物常溫下的溶解度在1. 85g/L以上。 作為優選，步驟(1)中，所述配合反應的介質要求是50% 80%甲醇，配合反應溫
度為40°C 85°C。 作為優選，步驟(2)中，所述酶解反應的溫度為45t: 65t:，反應體系pH值為2 4，反應時間為20min 60min。 作為優選，步驟(3)中，所述酶解反應的反應溫度為25t: 35t:，反應時間為 24h 48h。 上述方法中，所述金屬配合物中所用金屬離子優選能與氨水絡合，並在鹼性條件 下可生成沉澱。此種條件下，步驟(4)中，所述的去金屬離子化，就可以通過氨水和新橙皮 苷與金屬離子的競爭絡合，並在pHll. 5 13下通過曝氣吹氨氮法沉澱金屬離子來實現。
上述方法中，步驟(1)所述的配合反應完成後要求回收有機溶劑，不要求回收水 分。步驟(2)和(3)中橙皮苷酶和鼠李糖基轉移酶l，2-RhaT是以固定化的形式使用，固 定化的方法可參考以下兩篇文獻1、盛雪飛等，橙皮苷改性技術研究進展，食品與發酵工 業，2008，34(9) :109-112 ;2、 Ah證Frydman， et al. ， Metabolic Engineering of Plant Cells for Biotransformation of Hesperedin intoNeohesperidin， a Substrate for Production of the Low—Calorie Sweetener and FlavorEnhancer NHDC. ， J. Agric. Food Chem. ，2005,53(25) :9708-9712.。步驟(2)和(3)中，根據酶活確定底物添加量。步驟(2) 的酶解產物不需分離，直接用作步驟(3)中鼠李糖基轉移酶的作用底物。
本發明兩步酶解反應的基本原理橙皮苷酶作用位點為橙皮苷糖基中的鼠李糖和 葡萄糖之間的糖苷鍵，而橙皮苷與銅等金屬離子配位後，不僅沒有改變橙皮苷中的鼠李糖 和葡萄糖之間的糖苷鍵，相反通過金屬離子配位對非水溶性的橙皮素的"集中效應"，是水 溶性糖基部分暴露在外，提高橙皮苷水溶性，更有利於酶解。鼠李糖基轉移酶1，2-RhaT來 自菸草或胡蘿蔔植物細胞，可在25t: 35t:連續使用24h 48h，其作用底物為水相中的鼠 李糖和葡萄糖基橙皮素糖苷(HG)金屬配合物，產物為新橙皮苷金屬配合物。
本發明與現有技術相比，具有如下優點 (1)酶作用底物是橙皮苷金屬配合物，水溶性明顯提高，提高了酶作用效率，為中 藥廢棄橙皮的高附加值利用開闢新途徑。
(2)原料來源廣、成本低廉、反應條件溫和、操作簡便、無環境汙染、酶回收容易，適 合NHDC特別是新橙皮苷的工業化生產應用。 (3)酶反應產物不需分離，節約了產物分離純化成本。例如橙皮苷酶解產物HG金
屬配合物和鼠李糖不需分離，直接用作鼠李糖基轉移酶為1，2-RbaT作用底物。 (4)縮短了反應路徑。按傳統方法，橙皮苷酶解後要合成新橙皮苷還需三步①產
物HG和鼠李糖分離；②HG經葡萄糖酶解去葡萄糖，得橙皮素；③橙皮素和新橙皮糖接枝。
本發明直接把HG-Cu和鼠李糖結合得新橙皮苷，雖然後面存在NH3競爭絡合和曝氣脫NH3以
去配位，但都是極其簡易的步驟。
圖1是本發明橙皮苷酶法轉化為新橙皮苷的技術路線圖(方法中金屬離子以Cu2+ 為例)。
具體實施例方式
下面結合實施例和附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施不限於 此。 實施例1 如圖1所示，實現橙皮苷向新橙皮苷的高通量酶法轉化新方法，主要通過以下四
步來是實現橙皮苷與金屬離子的配對a)、橙皮苷金屬配合物的橙皮苷酶酶解(n)、橙皮
苷酶解產物的生物轉化，即新橙皮苷金屬配合物的高通量酶法合成(III)和新橙皮苷金屬 配合物的去配位(IV)。 用80%甲醇配置6X 10—3mol/L橙皮苷和3X 103mol/L CuCl2溶液，在40。C水浴中 密閉反應lh，旋轉蒸發回收甲醇和HC1，得橙皮苷銅配合物水溶液，濃度1. 85g/L，比橙皮苷 的溶解度高出IOO倍以上(1)。以戊二醛交聯法固定化橙皮苷酶，作用上述橙皮苷金屬配合 物水溶液，反應溫度為45°C，反應pH4. 0，反應時間60min，此時反應產物在200nm 400nm 下以紫外可見光譜掃描，不再出現橙皮苷銅配合物在382nm處的特徵吸收峰。酶解產物不 需分離，直接用作鼠李糖基轉移酶作用底物(11)。同樣以戊二醛交聯法固定化來自菸草或 胡蘿蔔植物細胞的鼠李糖基轉移酶l，2-RhaT，在35t:下作用上述橙皮苷酶解產物，即水相 中的葡萄糖基橙皮素糖苷(HG)金屬配合物和鼠李糖，該固定化酶可連續使用24h，產物為 新橙皮苷銅配合物(III)。新橙皮苷銅配合物在室溫下和過量氨水混合，通過氨水的競爭絡 合，使新橙皮苷去配位，再加片鹼調節pH13，曝氣吹氨氮至不再產生Cu (OH) 2沉澱為止，過濾 後即使可得新橙皮苷配合物水溶液，去水分後即可得目的產物新橙皮苷(IV)(請提供該產 物的化學分析數據？)，實現由橙皮苷向新橙皮苷的高通量酶法轉化，無需針對酶解產物的 複雜分離純化過程。
實施例2 實施例2和實施例1類似。不同之處在於將步驟I中的甲醇濃度調整為50%， 由Cu (N03) 2提供Cu2+和橙皮苷配位，反應溫度調整為85°C ;將步驟II中的橙皮苷酶作用溫 度調整為65t:，反應pH調整為2. O，此時反應時間僅需20min，說明此條件下酶活比實施例 l高；將步驟(III)中鼠李糖基轉移酶l，2-RhaT作用溫度調整為25°C，此固定化酶同樣可重複使用24小時；將步驟IV中曝氣吹氮的pH調整為11. 5，也可沉澱銅氨絡合物中Cu2+'，
實現橙皮苷向新橙皮苷的高通量酶法轉化。
實施例3 用70%甲醇配置6X 10—3mol/L橙皮苷和3X 103mol/L FeCl2溶液，在65。C水浴中 密閉反映lh，旋轉蒸發回收甲醇和HC1，得橙皮苷-亞鐵配合物水溶液，濃度2. 01g/L，比橙 皮苷的溶解度高出110倍以上(1)。以戊二醛交聯法固定化橙皮苷酶，作用上述橙皮苷亞 鐵配合物水溶液，反應溫度為55°C ，反應pH3. 0，反應時間40min，此時反應產物在200nm 400nm下以紫外可見光譜掃描，不再出現橙皮苷亞鐵配合物在380nm附近處的特徵吸收峰。 酶解產物不需分離，直接用作鼠李糖基轉移酶作用底物(11)。同樣以戊二醛交聯法固定化 來自菸草或胡蘿蔔植物細胞的鼠李糖基轉移酶l，2-RhaT，在3(TC下作用上述橙皮苷酶解 產物，即水相中的葡萄糖基橙皮素糖苷亞鐵配合物和鼠李糖，該固定化酶可連續使用48h， 產物為新橙皮苷亞鐵配合物(III)。新橙皮苷亞鐵配合物在室溫下和過量氨水混合，通過氨 水的競爭絡合，使新橙皮苷去配位，再加片鹼調節PH12. 5，曝氣吹氨氮至不再產生Fe (OH) 2 沉澱為止，過濾後即使可得新橙皮苷配合物水溶液，去水分後即可得目的產物新橙皮苷 (IV)，實現由橙皮苷向新橙皮苷的高通量酶法轉化，無需針對酶解產物的複雜分離純化過 程。 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特徵在於包括下述步驟(1)橙皮苷與金屬離子溶液通過配合反應製備橙皮苷金屬配合物水溶液；(2)加固定化橙皮苷酶到步驟(1)所得橙皮苷金屬配合物的水溶液中，發生酶解反應，得橙皮苷酶解產物；(3)加固定化鼠李糖基轉移酶1，2-RhaT到步驟(2)所得橙皮苷酶解產物中，發生酶解反應，得到新橙皮苷鹽；(4)去除步驟(2)所得新橙皮苷鹽中的金屬離子，得新橙皮苷。
2. 根據權利要求書1所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特徵在於步驟(1) 中，所述橙皮苷金屬配合物常溫下的溶解度在1. 85g/L以上。
3. 根據權利要求書1所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特徵在於步驟(1) 中，所述配合反應的介質為50% 80%甲醇，溫度為40°C 85°C。
4. 根據權利要求書1所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特徵在於步驟(2) 中，所述酶解反應的溫度為45t: 65t:，反應體系pH值為2 4，反應時間為20min 60min。
5. 根據權利要求書1所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特徵在於步驟(3)中，所述酶解反應的溫度為25°C 35t:，反應時間為24h 48h。
6. 根據權利要求1 5中任一項所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特徵在於 步驟(1)中，所述金屬離子溶液中所用金屬離子能與氨水絡合，在鹼性條件下生成沉澱。
7. 根據權利要求6所述的新橙皮苷的高通量酶法合成方法，其特徵在於步驟(4)中， 所述去除步驟(2)所得新橙皮苷鹽中的金屬離子，是通過氨水和新橙皮苷與金屬離子的競 爭絡合，並在pHll. 5 13下通過曝氣吹氨氮法沉澱金屬離子。
全文摘要
本發明公開了一種新橙皮苷的高通量酶法合成方法，該方法包括橙皮苷的金屬配位，以橙皮苷酶和鼠李糖基轉移酶1，2-RhaT實現橙皮苷金屬配合物向新橙皮苷的生物轉化和新橙皮苷金屬配合物去配位的步驟。該方法適用於低熱值甜味劑NHDC的工業化生產，克服向新橙皮苷生物轉化時橙皮苷水溶性差的技術瓶頸，實現NHDC合成前體新橙皮苷的高通量酶法合成，解決NH來源受限問題，同時為工業廢棄橙皮的資源利用和橙皮苷的高附加值化開闢了新途徑。
文檔編號C12P19/60GK101709316SQ200910193529
公開日2010年5月19日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者於淑娟, 何樹珍, 朱思明 申請人:華南理工大學