利用CRY1^G380R創建植物矮化以及提早開花的方法

2023-09-22 19:26:05 2

專利名稱：利用CRY1G380R創建植物矮化以及提早開花的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種農業科學技術領域的方法，具體是一種利用植物隱花色素的突變蛋白CRYle38tw創建植物矮化以及提早開花的方法。
背景技術：
光對植物生長發育以及動物生理都起重要調控作用。太陽光譜中藍光/A區紫外光、紅光、遠紅光是調控植物生長發育的主要波段。動植物中普遍存在藍光/A區紫外光光受體CRYPT0CHR0ME (CRY)，又稱為隱花色素。動植物的CRY蛋白都存在一個保守的N端結構域，稱為PHR結構域(Ehotolyase-Eelated Region)。這些PHR結構域都與古老的DNA光裂解酶(photolyase)家族的同源性很高，屬於一個蛋白超家族(photolyase/CRY)，具有非常相似的蛋白序列、三維空間結構、光激活機制。甚至有極少數胺基酸位點存在於原核至真核的各界生物的photolyase/CRY超家族成員中，並且完全保守；其中包括擬南芥CRYl的第 380位甘氨酸(G380)，它在水稻OsCRYlb的對應位點為第388位甘氨酸(G388)。植物CRY (包括擬南芥CRYl、水稻OsCRYlb)主要參與調控植物的光形態建成和開花時間。黑暗條件下，CRY不具有生理活性，植物幼苗下胚軸伸長迅速且子葉閉合呈鉤狀彎曲，以利於快速破土見光，稱為「暗形態建成」(Skotomorphogenesis)。自然光照條件下，植物CRY受藍光/A區紫外光激活後介導藍光信號通路，促進幼苗子葉充分打開並擴展，下胚軸伸長受到抑制，以利於植物機體基因表達、合成色素，進行充分的營養生長，稱為「光形態建成」(photomorphogenesis)，為下一步進入生殖生長的開花階段做準備。目前已有研究證明，利用35S強啟動子的轉基因技術使植物CRYl光受體蛋白(如擬南芥CRYl或OsCRYlb) 在植物中過量表達，能導致植物呈現對藍光特異性的增強光反應的表型；即僅在藍光下生長時植株呈現矮化的表型，而在紅光、遠紅光以及黑暗條件下，過量表達CRYl或OsCRYlb的植株其形態建成表型與野生型類似；另外，擬南芥中CRYl只在另一隱花色素CRY2缺失的遺傳背景下才表現其促進開花的作用，在野生型中過量表達CRYl光受體蛋白對植物的開花時間的影響比較小。經過對現有與植物隱花色素CRY相關的技術的檢索發現，只有一種方法能夠導致植物呈現組成型的光形態建成的表型，(C0P表型，Constitutive Photomorphogenesis)。這一方法是，將擬南芥CRYl、CRY2或水稻CRYlb的C端(分別表示為CCTl、CCT2、0sCCTlb)或其全長蛋白與GUS融合後產生的重組蛋白在植物中過量表達時，導致植株不僅在藍光下呈現出增強的光反應的表型，而且在紅光、遠紅光以及黑暗條件下都呈現出相似的超敏感的光反應的表型[Yang，H. Q.，et al.，(2000) The C termini of Arabidopsis cryptochromes mediate a constitutive light response. Cell 103 :815-827. Zhang，Y. C.，et al.， (2006)Functional and signaling mechanism analysis of rice CRYPT0CHR0ME 1. Plant Journal 46 :971-983. Sang，Y.，and Li, Q. H. , et al.，(2005)N_terminal domain-mediated homodimerization is required for photoreceptor activity of Arabidopsis CRYPT0CHR0ME 1. Plant Cell 17:1569-1584.]。
CRYl的G380以及OsCRYlb的G388在進化中的完全保守性意味著該甘氨酸位點 (glycine, G)對於相應CRY的生理功能而言是至關重要的，該G位點突變後很可能導致相應CRY蛋白的生理功能發生明顯改變(功能缺失，抑或功能獲得)。目前關於該保守G位點突變後怎樣影響相應的Photolyase/CRY蛋白功能，對生物體會產生怎樣的生理影響尚無報導。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種利用CRYle38tffi創建植物矮化以及提早開花的方法，通過定點誘變植物隱花色素CRYl的上述保守G位點也能導致植物呈現如上所述的COP表型(包括對光質及光強均不敏感的組成型矮化表型)的方法；本發明的這一方法還導致另外一方面效應，即導致植物提早開花。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及一種植物隱花色素的突變蛋白CRY1G38°K，包括1)擬南芥隱花色素突變蛋白CRYIg38cik的胺基酸序列，如SEQ ID No. 1所示；以及2)水稻隱花色素突變蛋白0sCRYlbG388K的胺基酸序列，如SEQ ID No. 2所示。 本發明涉及上述突變蛋白CRYIg38qk的應用，通過CRYIg38qk創建植物矮化或植物早開花。所述的創建是指通過將擬南芥CRYl的G380或水稻OsCRYlb相對應的G388突變為R，再利用35S啟動子使該突變蛋白在植物中過量表達。所述的過量表達是通過包括定點誘變技術在內的分子克隆技術，構建過量表達 CRYIg380e, 0sCRYlbG388E 的植物表達載體 35S: CRYIg380e,35S: 0sCRYlbG388K。本發明適用於培養各種矮化的供觀賞和綠化的園林植物、農作物以及經濟作物， 包括十字花科芸苔屬、茄科番茄屬、茄科菸草屬、蝶形花科、禾本科稻屬、禾本科大麥屬的各種植物。本發明與現有技術相比的優點在於本發明提供的方法可導致植物的組成型矮化，即植物矮化發育受光質、光照強度的影響微小；此方法同時還可導致植物明顯地早開花，並且此早開花表型不依賴於植物生長的光周期條件。


圖1為植物表達載體示意圖；圖中A為過量表達擬南芥CRYIg38qk cDNA序列的植物表達載體示意圖。數字表示胺基酸殘基數；B為利用ClusterX對擬南芥和水稻的CRYl進行胺基酸序列比對，顯示水稻OsCRYlb的G388與擬南芥CRYl的G380相對應，並擬將其突變為R ；C為過量表達水稻 0sCRYlbG388E cDNA序列的植物表達載體示意圖。數字表示胺基酸殘基數。圖2為35S CRYIg380e幼苗光形態建成表型示意圖；圖中A_D分另Ij 在黑暗(DK)、藍光(BL，60ymol · m_2 · s—1)、紅光(RL， 20 μ mol · πΓ2 · si、遠紅光(FR，0. 2 μ mol · πΓ2 · s—1)萌發 6 天的 WT (野生型)和 35S::CRY1G38°K#4轉基因幼苗的光形態建成表型。標尺為5mm。E為上述A-D條件相對應的幼苗下胚軸長度統計分析(mm)。η > 20，誤差線表示士 SE。
圖3為35S 0sCRYlbG388E幼苗光形態建成表型示意圖；圖中A_D分另Ij 在黑暗(DK)、藍光(BL，60ymol · m_2 · s—1)、紅光(RL， 20 μ mol · πΓ2 · si、遠紅光(FR，0. 2 μ mol · πΓ2 · s—1)萌發 6 天的 WT (野生型)和 35S: :0sCRYlbG388E#2轉基因幼苗的光形態建成表型。標尺為5mm。E為上述A-D條件相對應的幼苗下胚軸長度統計分析(mm)。η彡20，誤差線表示士 SE。圖4為成苗矮化表型示意圖；圖4在長日照(LD，16h白光/8h黑暗)下生長3周的WT、35S: :CRY1G38°K#4及 35S: :0sCRYlbG388E#2轉基因成苗的矮化表型。標尺為5cm。圖5為植株開花表型示意圖；圖中A為在長日照(LD，16h白光/8h黑暗)下生長3周的WT、35S: :CRY1G38°K#4、 35S: :0sCRYlbG388E#2 植株的開花表型。！35S: :CRY1G380E#4,35S: 0sCRYlbG388E#2 植株在長日照下比WT略早開花，標尺為5cm ;B為在短日照(SDjh白光/1 黑暗)下生長 6 周的 WT.35S: :CRY1G380E#4,35S: 0sCRYlbG388E#2 植株的開花表型。35S: :CRY1G380K#4、 35S: :0sCRYlbG388E#2植株在短日照下比WT顯著早開花，標尺為5cm。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。下面實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆實驗手冊(Molecular cloning :A laboratory manual, 3rd ed. , Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)和植物分子生物學實驗手冊(Plant Molecular Biology-Α Laboratory Manual, Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1 在擬南芥中過量表達CRYIg38cik或0sCRYlbG388K的轉基因植株的構建將PCR擴增的擬南芥CRYl的全長cDNA序列克隆到pBS_Myc載體的EcoRI和McI 位點間，得到pBS-Myc-CRYl。測序後利用定點誘變PCR技術將CRYl的第380位甘氨酸誘變為精氨酸(G380R)，得到克隆 pBS-Myc-CRYlG38°K。Myc-CRY1G38°K 片段用 BioI 和 McI 酶切， 插入PKYL71載體上35S啟動子的後面獲得過量表達Myc-CRY1G3■的植物表達載體(圖1A)， 用獲得的質粒轉化農桿菌GV3101菌株。通過胺基酸序列比對發現，水稻OsCRYlb的G388與擬南芥CRYl (AtCRYl)的G380 相對應(圖1B)。將PCR擴增的水稻OsCRYlb的全長cDNA序列克隆到pBS載體的HindIII 和McI位點間，得到pBS-OsCRYlb。測序後利用定點誘變PCR技術將OsCRYlb的第388位甘氨酸誘變為精氨酸(G388R)，得到克隆pBS-0sCRYlbG388K。測序後將0sCRYlbG388K片段用 HindIII和Mel酶切，插入pHB載體35S啟動子的後面獲得過量表達0sCRYlbG3■的植物表達載體(圖1C)，用獲得的質粒轉化農桿菌GV3101菌株。由獲得的GV3101菌株介導，通過浸花法將上述植物表達載體轉化植物，分別獲得轉基因植株。經Immimoblot實驗分別檢測蛋白Myc-CRY1G38°K或0sCRYlbG388K的表達量， 獲得的轉基因植株分別為過量表達CRYIg3■或0sCRYlbG388K的轉基因植株，分別表示為35S: CRYIg380e 和 35S: 0sCRYlbG388E 植株。實施例2 在擬南芥中35S: CRYIg38cik和35S: 0sCRYlbG388K轉基因植株的光形態建成表型分析通過觀察35S: CRYIg3■和35S: 0sCRYlbG388K轉基因植株的形態建成表型發現， 35S: :CRY1G38°K和35S: 0sCRYlbG3■這兩種轉基因植株在藍光(BL)、紅光(RL)、遠紅光(FR) 各主要光質條件下以及在黑暗(DK)下生長時，其幼苗的形態建成表型受光條件影響小，表現為在各種條件下，幼苗下胚軸伸長均受到明顯抑制、子葉充分打開並且擴展、幼苗的子葉甚至部分下胚軸明顯發紅(分別為圖2A-2D、圖3A-3D)。對下胚軸長度的統計分析顯示， 35S: CRYIg38qk和35S: :0sCRYlbG388K轉基因植株明顯比WT矮化(分別為圖2E、3E)。這表明轉基因植株35S::CRY1G3■和35S::0sCRYlbG388K在幼苗階段的形態建成基本都不需要依賴於光質和光強就幾乎能完成正常的形態建成(除葉綠素合成外)。並且35S::CRY1G38°K和 35S::0sCRYlbG388K轉基因植株成苗階段的形態建成表型也明顯比WT矮化(圖4)。這些結果表明，35S: CRYIg380e和35S: 0sCRYlbG388E轉基因植株在其整個發育階段都表現組成型的光形態建成的表型，其中最明顯的特徵即組成型的矮化。實施例3 在擬南芥中轉基因植株35S: CRYIg380e,35S: 0sCRYlbG388E的開花表型分析對開花表型的觀察發現，在長日照(16h白光/8h黑暗)下，35S::CRY1G38°k、 35S::0sCRYlbG388K轉基因植株比WT略早開花(圖5A)。另外，擬南芥是長日照植物，WT在短日照(8h白光/16h黑暗)下其開花時間會大大延遲，而:35S: CRYIg380e,35S: 0sCRYlbG388E 植株在短日照下的開花時間比WT也明顯提前，與WT在長日照的開花時間接近(圖SB)。 這些結果表明，過量表達CRY1G38°k、0SCRYlbG388K的植株其開花時間對光周期的變化不敏感，具有提早開花的能力。CRYIg38cik及0sCRYlbG388K導致植物早開花這一結果也支持了植物 CRYl蛋白在參與正調控植物開花方面的作用[Mockler，T. C.，et al.，(1999) Antagonistic actions of the Arabidopsis cryptochromes and phytochrome B in the regulation of floral induction. Development 126 :2073-2082. Imaizumi, Τ. , and Kay, S. A. (2006) Photoperiodic control of flowering :not only by coincidence. Trends in Plant Sci. 11 :550-558]。植物生長條件擬南芥生長環境的空氣相對溼度60 %，恆溫22°C，光照周期為Mh，長日照條件為 16h白光/8h黑暗，短日照條件為8h白光/16h黑暗。白光光照強度為160μπι01 !^ s—1。 光強測定用的儀器是美國Li-Cor公司的Li250光量子測定儀。
權利要求
1.一種植物隱花色素的突變蛋白CRYle3·，其特徵在於，包括1)擬南芥隱花色素突變蛋白CRYIg38qk的胺基酸序列，如SEQID No. 1所示；以及2)水稻隱花色素突變蛋白0sCRYlbG388K的胺基酸序列，如SEQID No. 2所示。
2.一種根據權利要求1所述突變蛋白CRYIg38cik的應用，其特徵在於，通過CRYIg38cik創建植物矮化或植物早開花。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵是，所述的創建是指通過將擬南芥CRYl的 G380或水稻OsCRYlb相對應的G388突變為R，再利用35S啟動子使該突變蛋白在植物中過量表達。
4.根據權利要求2所述的應用，其特徵是，所述的過量表達是通過包括定點誘變技術在內的分子克隆技術，構建過量表達CRYlG38°K、0sCRYlbG388K的植物表達載體35S: CRYIg380e, 35S: :0sCRYlbG388K。
5.根據權利要求2所述的應用，其特徵是，所述的植物為十字花科芸苔屬、茄科番茄屬、茄科菸草屬、蝶形花科、禾本科稻屬或禾本科大麥屬的植物。
全文摘要
一種農業科學技術領域的利用CRY1G380R創建植物矮化以及提早開花的方法，通過定點誘變植物隱花色素CRY1的保守位點可導致植物的組成型矮化，即植物矮化發育受光質、光照強度的影響微小；此方法同時還可導致植物明顯地早開花，並且此早開花表型不依賴於植物生長的光周期條件。
文檔編號C12N15/82GK102344486SQ201110130339
公開日2012年2月8日 申請日期2011年5月19日 優先權日2011年5月19日
發明者楊洪全, 顧南南 申請人:上海交通大學