功能強化型微生物群落的定向富集方法
2023-09-22 19:21:40
專利名稱：：功能強化型微生物群落的定向富集方法
技術領域：
：本發明涉及功微生物群落的定向富集方法。
背景技術：
：傳統的微生物分離方法採用平板分離法反覆純化功能微生物直到獲得純培養的微生物，分離過程耗時很長，同時存在於自然界中的微生物只有很小一部分能獲得純培養，而且得到純培養微生物應用於工程(或工藝)系統中存在應用於複雜生物過程系統中，純培養微生物的功能效果較混和微生物要差；純培養微生物應用於包含複雜底物的環境資源作培養基質時，純培養微生物利用的底物範圍有限，因此需要微生物種群多樣的微生物資源；微生物在生物工藝系統和一些特定的環境中能被初步地定向富集，但無法獲得功能微生物佔絕對優勢的功能微生物群落，即功能強化型微生物群落。
發明內容本發明的目的是為了解決現有微生物分離方法主要針對分離純培養微生物，應用於工程(或工藝)系統中的功能差、利用的底物有限、耗時長及無法獲得功能強化型微生物群落的問題，而提供的功能強化型微生物群落的定向富集方法。功能強化型微生物群落的定向富集方法按以下步驟實現一、原始微生物群落的母液梯度連續稀釋，得稀釋液；二、將稀釋液分別接種於篩選培養基中培養，然後選擇與母液功能指標相當的最大稀釋倍數下的群落，再接種於篩選培養基中傳代1020次，選擇功能指標穩定的群落，即完成功能強化型微生物群落的定向富集。本發明功能強化型微生物群落的定向富集過程中，倍比稀釋原始微生物群落一次，縮短了定向富集的時間，並且採用倍比稀釋方法獲得的微生物群落有利於其保持傳代的穩定性；本發明中能夠有效去除原始微生物群落中的非功能微生物，保留了原始微生物群落中關鍵的功能微生物，應用在工程(或工藝)系統中功能效果好、能夠利用複雜的底物，且促進系統的快速啟動及穩定高效運行。圖1為具體實施方式四中鐵還原篩選培養基中各種稀釋倍數下的稀釋液樣品的Fe(III)還原歷時圖譜，其中令為10"稀釋倍數下的稀釋液樣品，A為10—2稀釋倍數下的稀釋液，參為10J稀釋倍數下的稀釋液，口為104稀釋倍數下的稀釋液，A為10—s稀釋倍數下的稀釋液，B為10—6稀釋倍數下的稀釋液，x為10-7稀釋倍數下的稀釋液，|為10—8稀釋倍數下的稀釋液，〇為10一稀釋倍數下的稀釋液；圖2為具體實施方式五中纖維素篩選培養基中各種稀釋倍數下的稀釋液的纖維素降解歷時變化圖譜，其中口為原瘤胃液，O為10"稀釋倍數下的稀釋液，A為10'3稀釋倍數下的稀釋液，V為10—5稀釋倍數下的稀釋液，為10—9稀釋倍數下的稀釋液，O為10—u稀釋倍數下的稀釋液；圖3為具體實施方式五中纖維素篩選培養基中各種稀釋倍數下的稀釋液的產氫量歷時變化圖譜，其中口為原瘤胃液，O為10"稀釋倍數下的稀釋液，A為10—3稀釋倍數下的稀釋液，V為10—5稀釋倍數下的稀釋液，為10—9稀釋倍數下的稀釋液，O為10—u稀釋倍數下的稀釋液。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式功能強化型微生物群落的定向富集方法按以下步驟實現一、原始微生物群落的母液梯度連續稀釋，得稀釋液；二、將稀釋液分別接種於篩選培養基中培養，然後選擇與母液功能指標相當且最大稀釋倍數下的群落，再接種於篩選培養基中傳代1020次，選擇功能指標穩定的群落，即完成功能強化型微生物群落的定向富集。本實施方式步驟一中原始微生物群落為現有的各種微生物群落。本實施方式步驟一中母液為細胞懸浮液。本實施方式步驟一中原始微生物群落依據具體工程(或工藝)系統的功能要求來選擇；選擇經過初步馴化的工程(或工藝)系統微生物群落作為原始微生物群落，或者選擇在一定選擇壓力環境中自然富集得到的微生物群落作為原始微生物群落。本實施方式步驟二中篩選培養基中培養根據篩選目標菌群在具體實施的工程(或工藝)系統的功能特點而設定的。本實施方式步驟二中稀釋液在篩選培養基中培養的溫度和時間是依據具體富集的目的功能微生物的生長特性設定的。本實施方式步驟二中選擇與母液功能指標相當的最大稀釋倍數下的群落，其中群落的篩選指標是依據具體工程(或工藝)系統的功能特點設定的。本實施方式完成功能強化型微生物群落的定向富集後，採用DGGE技術分析功能強化型微生物群落的微生物組成和數量。本實施方式完成功能強化型微生物群落的定向富集後，要將該微生物群落和原始微生物群落分別接種於原工程(或工藝)系統中，通過比較二者的功能效果，可以看出，本實施方式中所得功能強化型微生物群落的功能效果優於原始微生物群落。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟二中傳代1218次。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一不同的是步驟二中傳代15次。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。具體實施方式四本實施方式功能強化型微生物群落的定向富集方法按以下步驟實現一、原始微生物群落的母液梯度連續稀釋，得稀釋液；二、將稀釋液分別接種於篩選培養基中培養，然後選擇與母液功能指標相當且最大稀釋倍數下的群落，再接種於篩選培養基中傳代15次，選擇功能指標穩定的群落，即完成功能強化型微生物群落的定向富集。本實施方式步驟一中原始微生物群落來源於穩定運行八個月的雙室MEC(微生物電解電池)或微生物燃料電池(MFC)陽極碳布上的生物膜；母液的製備是將陽極碳布上的生物膜置於磷酸緩衝溶液中，振蕩後即得。本實施方式步驟二中篩選培養基為鐵還原篩選培養基，其中電子供體為10mM乙酸，電子受體為100mM無定形鐵(不溶於水的Fe(III))。本實施方式中稀釋液在鐵還原篩選培養基中培養的溫度是30°C，時間是264h。本實施方式中以MFC或MEC系統中Fe(III)還原能力為功能指標，實驗結果如圖1所示，經過264h的培養，濃度稀釋為原母液10"-10—6的稀釋液中5均檢測到Fe(II)的生成，且Fe(II)濃度都達到了2530mM水平；稀釋倍數達到或超過10—7的稀釋液中沒有檢測到Fe(II);因此，選擇濃度稀釋為原母液10'6的稀釋液為定向富集的MFC或MEC系統中的功能強化型微生物群落，即陽極微生物功能群落(anodophilicfunctionalconsortium,AFC)。本實施方式完成功能強化型微生物群落的定向富集後，採用DGGE技術分析功能強化型微生物群落的微生物組成和數量；分析表明AFC的微生物群落落組成主要包括土桿菌屬(Geo^cter)、假單胞菌屬(P^i^omoww)和梭桿菌屬(C7o^^Mm)，並且這三個菌屬都是MFC或MEC系統中的產電菌。本實施方式中在鐵還原篩選培養基中傳代15次的功能強化型微生物群落，即AFC，將其與汙水處理廠的活性汙泥分別接種於兩個相同的MFC反應器中，比較二者的功率密度、庫倫效率和啟動效果；結果如圖1所示，AFC的輸出功率大，啟動反應器快，在一個完整的周期中AFC獲得的庫倫效率要遠高於活性汙泥，說明獲得的AFC具有較高電化學活性，能促進MFC的運行效果。表ltableseeoriginaldocumentpage6具體實施方式五本實施方式功能強化型微生物群落的定向富集方法按以下步驟實現一、原始微生物群落的母液梯度連續稀釋，得稀釋液；二、將稀釋液分別接種於篩選培養基中培養，然後選擇與母液功能指標相當且最大稀釋倍數下的群落，再接種於篩選培養基中傳代12次，選擇功能指標穩定的群落，即完成功能強化型微生物群落的定向富集。本實施方式步驟一中原始微生物群落的母液來源於牛瘤胃液。本實施方式步驟二中篩選培養基為纖維素篩選培養基，其中纖維素濃度為10g/L。本實施方式中稀釋液在纖維素篩選培養基中培養的溫度是37°C，時間是160h。本實施方式中以產氫量和纖維素降解度為功能指標，實驗結果如圖2所示經過160h的培養，濃度稀釋為原母液10"-10'7的稀釋液能降解纖維素，且與母液功能指標相當；如圖3所示有0.280.32g的纖維素經微生物的降解生成120145ml/L的H2;濃度稀釋為原母液1(T910—11的稀釋液中的纖維素在160h內沒有被其中的微生物降解；因此，選擇濃度稀釋為原母液1化7的稀釋液為定向富集的纖維素產氫系統中的功能強化型微生物群落，即瘤胃液纖維素降角早功能微生物群落(mmencellulose-degradingbacterialconsortium,RCBC)。本實施方式完成功能強化型微生物群落的定向富集後，採用DGGE技術分析功能強化型微生物群落的微生物組成和數量；分析表明RCBC的功能微生物組成主要是瘤胃菌屬、琥珀酸弧菌和丁酸弧菌屬；群落分析同時還發現在濃度稀釋為原母液10力10—n的稀釋液中瘤胃球菌消失了，可能是這類關鍵微生物的丟失破壞了微生物群落內的協同作用，導致過高稀釋倍數下的稀釋液失去功效。本實施方式中定向富集的RCBC與原瘤胃液各自的纖維素降解率和產氫量，經測試RCBC在發酵過程中纖維素降解量比原瘤胃液的高；RCBC在發酵過程中產氫量不變，而原瘤胃液在發酵過程中產氫量在後續的時間裡逐漸被消耗了，這表明在原瘤胃液中存在著某些耗氫微生物，而這種現象在定向富集得到的RCBC中沒有出現。權利要求1、功能強化型微生物群落的定向富集方法，其特徵在於功能強化型微生物群落的定向富集方法按以下步驟實現一、原始微生物群落的母液梯度連續稀釋，得稀釋液；二、將稀釋液分別接種於篩選培養基中培養，然後選擇與母液功能指標相當且最大稀釋倍數下的群落，再接種於篩選培養基中傳代10～20次，選擇功能指標穩定的群落，即完成功能強化型微生物群落的定向富集。2、根據權利要求1所述的功能強化型微生物群落的定向富集方法，其特徵在於步驟二中傳代1218次。3、根據權利要求1所述的功能強化型微生物群落的定向富集方法，其特徵在於步驟二中傳代15次。全文摘要功能強化型微生物群落的定向富集方法，它涉及功微生物群落的定向富集方法。它解決了現有微生物分離方法主要針對分離純培養微生物，應用於工程(或工藝)系統中的功能差、利用的底物有限、耗時長及無法獲得功能強化型微生物群落的問題。方法一、原始微生物群落的母液梯度連續稀釋，得稀釋液；二、將稀釋液分別接種於篩選培養基中培養，然後選擇與母液功能指標相當的最大稀釋倍數下的群落，再接種於篩選培養基中傳代，選擇功能指標穩定的群落，即完成功能強化型微生物群落的定向富集。本發明倍比稀釋原始微生物群落一次，縮短了定向富集的時間，應用在工程(或工藝)系統中功能效果好、能夠利用複雜的底物，且促進系統的快速啟動及穩定高效運行。文檔編號C12N1/00GK101497862SQ20091007145公開日2009年8月5日申請日期2009年2月27日優先權日2009年2月27日發明者充劉,劉文宗,丹孫,王愛傑,程浩毅,高靈芳申請人:哈爾濱工業大學