離子電滲裝置結構體及生物體內成分的檢測方法
2023-09-22 03:22:50
專利名稱：離子電滲裝置結構體及生物體內成分的檢測方法
技術領域：
本發明涉及醫療領域中診斷或檢查時使用的適當離子電滲裝置結構體及生物體內成分的檢測方法。
另外，腫瘤，特別是惡性黑素瘤是預後效果非常不好、浸潤能力和轉移能力非常高的疾病，一旦轉移或復發，治療非常困難，所以期待開發出新的治療手段。這種惡性黑素瘤是通過檢查外科中切除的組織中是否存在黑素瘤細胞等腫瘤標記物來進行確診的。作為檢查方法，採用使用由手術後病灶剖面製成的按印塗片的按印螢光法和使用病灶組織的免疫染色法。在組織染色法中，使用各種黑素瘤標記物抗體(抗黑素瘤抗體)。
但是，由於這種外科上切除細胞的方法不僅給患者帶來痛苦和恐懼心理，而且能夠增加腫瘤轉移的危險，因而不希望這樣。另外，由於試料的採集必須在特定的場合下由熟練的醫生進行，所以不適於集體檢查診斷等篩分法。另外，測定血清中和尿中的5-S-半胱氨醯多巴等多巴和腫瘤標記物等的方法雖然作為症狀惡化階段疾病程度和有無轉移等症狀的指標，但是作為早期診斷方法不合適。在這種狀況下，人們期待開發出並不那麼需要現有檢查中所必須的高度熟練和經驗，而且對腫瘤等能夠進行安全、早期診斷的方法。
另一方面，目前作為貼劑，已知含有水楊酸類消炎鎮痛藥和硝酸甘油等心絞痛治療藥等藥品的醫療用貼劑、用於刺激性試驗的皮膚接觸性試驗以及用於確定性變應性皮炎等的致敏物的變應原檢測用貼劑。特開昭63-106558號公報公開了一種角質層標本的製作方法，將皮膚的角質層附著粘著性物質上之後，貼付於塗敷有粘合劑的透明板上，接著浸漬在有機溶劑中，溶解除去前期的粘著物質，使上述角質層固定在上述透明板上。另外，在同一申請人的特開昭63-113358號公報中公開了使用上述角質層標本檢查角質層狀態的方法，這裡實施的檢查主要是測定角質層物性的檢查。而且，同一申請人的特開平4-121664號公報中公開了一種通過粘性薄膜剝離角質層，轉移，接著用有機溶劑洗滌，提取角質層中含有的脂質，分析該脂質的方法。
但是，上述特開昭63-106558號公報和特開昭63-13358號公報的方法中，為了固定剝離的角質細胞，有必要用有機溶劑溶解粘著層。因此，不能檢測出對有機溶劑不穩定的物質。另外，角質層脂質等用有機溶劑提取的物質已不存在於角質層標本中，以與角質層在皮膚中存在狀態相同的狀態檢查是不可能的。另外，上述特開平4-121664號公報的方法中，不用有機溶劑提取的物質是不可能進行分析的。
另外，特開平-76518號公報中公開了一種疾病的診斷方法，它是對用粘著帶剝離固定的組織、細胞或其他物質或載體上吸附固定的組織或細胞分泌的物質等用免疫學方法等進行測定。該方法在腫瘤特別是惡性黑素瘤的初期，沒有必要對組織等進行外科性切除，而且不會給患者帶來痛苦和恐懼心理，採集生物體組織、細胞或其分泌物等診斷腫瘤。
另一方面，離子電滲是使用外界刺激性的電促進頭皮吸收的系統，其原理主要是基於通電後陽極和陰極之間產生的電場中，帶正電的分子由陽極向陰極移動，帶負電的分子由陰極向陽極移動的力量，促進藥物分子透過皮膚屏障。[參照Journal of Controlled Release，18卷，1992年，213-220頁；Advanced Drug Delivery Review，9卷，1992年，119頁；Pharmaceutical Research，3卷，1986年，318-326頁]。
作為利用這種離子電滲進行診斷的用例，已知以診斷囊胞性纖維病為目的投給毛果芸香鹼((J.Pediatr)69卷，1966年，285頁；(SouthMed.J.)59卷，1966年，197頁；(Arch.Dis.Child)40卷，1965年，684頁)。另外，近年來為了讓糖尿病患者自己測定血糖，提出了使用非侵襲性的離子電滲檢測血液中的葡萄糖的技術(參照國際公開號WO96/00110號公報；Pharmaceutical Resarch，12卷，1995年，1869-1873頁；Journal of Controlled Release，38卷，1996年，159-165頁；同一雜誌，42卷，1996年，29-36頁)。該方法通過離子電滲形成對流，從而使血液中漏出的葡萄糖移動到裝置中設置的溶液層中進行採樣。
以前的方法中，使用粘著帶的方法在採集特別是生物體組織和細胞的分泌物，即肽或蛋白質等高分子物質時，有必要長時間貼付，在順應性方面不能說是令人滿意的。而且，長時間貼付恐怕也會有皮膚刺激性，這不易給患者施用並會使患者感到不舒適。另外，象這種方法僅依賴於被測物質的被動擴散時，個體間的差異較大，會造成誤診，在性能方面也不能說是充分的。
另外，以前採用離子電滲的方法中，可以檢測出低分子物質，但檢測出肽和蛋白質等高分子物質時，為了回收被測物質，不僅需要複雜的操作，而且要在試樣溶液中將其稀釋，因此在測定靈敏度上缺乏實用性。
因而，以前不存在能夠迅速而且高靈敏度地檢測出目的物質的裝置或檢測方法。因此，存在不能根據疾病的種類在短時間內進行正確診斷的問題。
因此，本發明的目的在於提供一種能夠迅速而且高靈敏度地檢測出生物體成分的離子電滲裝置結構以及檢測方法。
具體地說，例如在診斷腫瘤等疾病時，使用配置有對構成腫瘤等標記物的蛋白質、肽、核苷酸等具有較高吸附性的檢測用部件的診斷用裝置結構進行離子電滲。而且，通過電的驅動力使生物體內成分吸附固定在檢測用部件上，之後從裝置中剝離檢測用部件，用免疫學方法或化學方法等測定吸附固定的腫瘤相關抗原、腫瘤標記物或腫瘤相關物質。
也就是說，本發明涉及的離子電滲裝置結構體包括離子電滲用電極、通過離子電滲吸附生物體內成分的檢測用部件、上述電極和檢測用部件之間設置的導電層。這裡檢測用部件例如由多孔性膜構成，其每1cm2的蛋白質吸附能力為20μg以上，顯示較高的吸附性。另外，檢測用部件的厚度優選為5-200μm。
另外，檢測用部件能夠吸附作為生物體內成分的生物體組織、血液和細胞中的至少一種。或者，能夠吸附生物體組織、血液和細胞中至少一種分泌的物質。這裡分泌的物質例如是肽或蛋白質。
進一步，檢測用部件能夠吸附腫瘤相關抗原、腫瘤標記物或其他腫瘤相關物質。這裡，腫瘤相關抗原、腫瘤標記物或其他腫瘤相關物質選自黑素瘤細胞、黑素瘤標記物(NKI/C3)、黑素瘤標記物(PAL/Ml)、黑素瘤標記物(S-100α和β)、癌胎兒性抗原(CEA)、神經芽腫(CE7)、神經芽腫(AD2)、致惡性腫瘤素、α-胎兒性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、鹼性胎兒蛋白(BFP)、胰腺癌胎兒性抗原(POA)、胎兒性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相關抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相關抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相關抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相關抗原(Span-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平細胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特異抗原(PA)、鐵蛋白、組織多肽抗原(TPA)、腫瘤相關抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、酶、胺基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素類。
本發明涉及的離子電滲裝置用塗藥器由具有凹面的襯墊、設置在襯墊凹面底部的電極、設置在襯墊凹面上部的生物體內成分檢測用部件以及設置在電極和生物體內成分檢測用部件之間設置的導電層構成。與生物體內成分檢測用部件相應的部分具備帶開口的粘性片材。
本發明涉及的生物體內成分的檢測方法中，採用離子電滲使生物體內成分吸附在檢測用部件上，通過用免疫學方法或化學方法檢測吸附在該檢測用部件上的生物體內成分。
本發明涉及的離子電滲系統由離子電滲裝置、參比裝置以及電源，離子電滲裝置包括通過離子電滲吸附生物體內成分的檢測用部件、裝置用電極以及設置在裝置用電極和檢測用部件之間的導電層，參比裝置包括與裝置用電極對應設置的參比電極，電源將上述裝置用電極和參比電極之間電連接。這裡，檢測用部件具有例如平均孔徑0.001-20μm的多孔性結構。
這樣，本發明的離子電滲裝置可以迅速而且高靈敏度地檢測出生物體內成分，對於各種疾病的診斷是非常有用的。
圖2是說明牛血清白蛋白對診斷用裝置所使用的檢測用部件的吸附性的圖。
圖3是說明人胰島素對診斷用裝置所使用的檢測用部件的吸附性的圖。
圖4(a)-(d)是分別表示檢測用部件上人癌胎兒性抗原的免疫學染色結果的圖。
發明的最佳實施方式以下，參照圖面詳細地說明本發明。
本發明涉及的離子電滲裝置結構體包括離子電滲用電極、通過離子電滲吸附生物體內成分的檢測用部件以及設置在離子電滲用電極和檢測部件之間的導電層。而且，使用對皮膚或黏膜適用的各種塗藥器，採用免疫學方法或化學方法檢測通過離子電滲移動的生物體內成分。
圖1(a)是具備本發明涉及的離子電滲裝置結構體的塗藥器的一個實例的剖面圖。如圖所示，襯墊1形成圓筒狀的凹面。例如使用聚丙烯制內徑為18mm的物質作為襯墊1。襯墊1的底部設有衝切成圓形的箔型銀電極2。箔型銀電極2例如直徑為10mm，厚度為0.04mm。襯墊1的凹面部分設有電解質層作為導電層3。另外，箔型銀電極2上設有連接端子4，它可以通過襯墊1中心部開的小孔與電源相連。在這樣構成的裝置中設置能夠吸附生物體內成分的檢測用部件6。檢測用部件6的材料等將在後面詳細敘述，例如可使用直徑20mm，厚度0.016mm的親水性尼龍膜。檢測用部件6預先貼付在比其直徑小一些直徑為18mm的具有開口的粘性片材5上，離子電滲開始時，使檢測用部件6與皮膚或黏膜接觸使用。
本發明涉及的離子電滲裝置結構體的形態可以是任何一種形態，例如長方形、圓形、橢圓形、正方形、心形、菱形等，對此並沒有限定。另外，大小、顏色只要具有實用性並沒有特別的限定。
本發明的離子電滲裝置的通電可以如圖1(b)所示，通過使用電源30在裝置10的電極2和與之對應設置的參比裝置20的參比電極7之間施加直流電壓進行。電源只要是可以施加連續直流電壓或脈衝直流電壓的物質即可，更優選使用可以施加矩形脈衝直流電壓的物質。脈衝直流電壓的頻率優選在0.1至200kHz，更優選在1至100kHz，特別優選在5至80kHz的範圍內適當選擇。脈衝直流電壓的on/off的比在1/100至20/1，優選在1/50至15/1，更優選在1/30至10/1的範圍內適當選擇。通電時間為連續通電24小時以下，更優選12小時以下，特別優選6小時以下。
這種離子電滲裝置中，例如被測物質是等電點在4附近的蛋白質，在皮膚和黏膜等生物體內具有負電荷，使用離子電滲時向陽極側移動。因此，檢測用裝置設置在陽極側。而且，離子電滲裝置通電後，採用免疫學方法或化學方法檢測吸附固定在檢測用部件上的生物體組織、血液和細胞或其分泌物等。
本發明涉及的裝置結構中，其結構的增強方法，即襯墊只要是電絕緣體或實施了絕緣處理的物質，沒有特別的限定，優選使用氯乙烯、聚乙烯、聚烯烴、聚酯、聚氨酯、聚乙烯醇、偏二氯乙烯聚醯胺以及乙烯-醋酸乙烯共聚物等塑料性薄膜或含有鋁的層壓箔片等。襯墊的厚度沒有特別的限定，優選約為1μm-5000μm，特別優選10μm-600μm。
本發明使用的電極只要是通常離子電滲中可以使用的導電性電極材料即可，沒有特別的限定。這種導電材料例如銀、氯化銀、鋁、鋅、銅、鐵、碳、鉑、鈦、不鏽鋼等。其中，銀或氯化銀的電阻等電特性優良，使用如果使用漿狀材料製造，價格便宜而且生產率高。
對本發明的裝置結構中的導電層並沒有特別的限定。一般優選以對皮膚或黏膜等貼付部位生理性刺激小的組成成分和pH範圍使用，為了通過離子電滲使被測物質向診斷用裝置移動，優選使用考慮了被測物質即標記物蛋白質、肽等的等電點的電解質組成和pH。而且，本發明所使用的導電層的保持方法可以是凝膠型或溶液型代表的基質型或貯器型等，並沒有特別的限定。這種基質型導電性凝膠例如瓊脂、明膠、黃原膠、槐樹豆膠、角叉菜膠、殼膠、羅望籽果膠、凝膠多糖、果膠、farceleran、瓜爾膠、海藻酸、海藻酸鈉、tara gum、刺梧桐膠、纖維素、其衍生物等、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚異丁烯、等合成高分子類和共聚物等，可以單獨使用也可以2種以上組合使用。而且，作為溶液型代表的貯器型電解質保持手段，可使用各種具有多孔性或毛細管結構的部件(以下，有時簡稱為多孔性材料)。這種多孔性材料可以使用有機多孔性材料(例如由纖維素等天然纖維、醋酸纖維素等半合成纖維、聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚酯等合成纖維等形成的纖維集合體，紙等片材，紡布或無紡布等布，多孔性聚丙烯、多孔性聚苯乙烯、多孔性聚甲基丙烯酸甲酯、多孔性尼龍、多孔性聚碸、多孔性氟樹脂等多孔性合成樹脂，海綿等吸水性樹脂等)以及無機多孔性材料(例如陶瓷多孔體、具有多孔性或毛細管結構的陶瓷等)等。在上述各種保持手段中，必要時也可以添加電解質、pH調節劑、穩定劑、增粘劑、潤溼劑、表面活性劑、溶解助劑等，或使之含浸在其中。
本發明涉及的裝置結構的檢測用部件可以吸附固定生物體組織、血液或細胞或它們的分泌物等，更優選處於電場時也可以維持其吸附力。另外，檢測用部件是親水性的，對蛋白質、肽等具有較高的吸附性能，對用來檢測吸附固定的物質所使用的水、醇、甲醛等穩定，優選在這些溶液中不會從檢測用部件上脫離、溶解的物質。對於這種檢測用部件沒有特別的限定，可以使用對蛋白質、肽等有高吸附力的具有多孔性或毛細管結構的各種親水性多孔材料或實施了親水處理的疏水性多孔材料。
優選的檢測用部件可以舉出有機多孔性材料(例如由纖維素等天然纖維、硝酸纖維素或醋酸纖維素等半合成纖維、聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚酯等合成纖維等形成的纖維集合體，紙等片材，紡布或無紡布等布，多孔性聚丙烯、多孔性聚苯乙烯、多孔性聚甲基丙烯酸甲酯、多孔性尼龍、多孔性聚碸、多孔性氟樹脂、多孔性聚偏二氟乙烯等多孔性合成樹脂等)。
本發明所使用的檢測用部件具有對蛋白質、肽顯示較高吸附性，其吸附量也大的特點。檢測用部件對蛋白質的吸附量每1cm2為20μg以上，優選每1cm2為40μg以上，更優選每1cm2為50μg以上。另外，蛋白質的吸附量可以通過使用代表性蛋白質能夠簡便測定的慣用方法，例如將1.3cm2的檢測用部件在室溫下浸漬於含有示蹤量的用125I標識的牛血清白蛋白或人胰島素的溶液(蛋白質濃度為1mg/ml磷酸鹽緩衝液)400μl中90分鐘後，用磷酸鹽緩衝液洗滌，通過測定殘留放射活性計算出來。另外，也可以使用被測物質計算吸附量。
這些檢測用部件具有多孔性結構，其細孔徑只要在被測物質的保持量和目的物質的測定方面不會損害檢測性能即可，可以在生物體可接受的範圍內選擇，例如平均孔徑為0.001-20μm，優選0.01-10μm，更優選0.01-1μm。
另外，檢測用部件的厚度只要在被測物質的保持量和目的物質的測定方面不會損害檢測性能即可，可以在生物體可接受的範圍選擇，最好是約0.1-500μm，優選約1-300μm，更優選約5-200μm。
其次，說明本發明涉及的檢測方法。採用本發明的裝置結構，檢測用部件上吸附固定的生物體組織、血液或細胞或它們的分泌物是腫瘤相關抗原、腫瘤標記物或其他腫瘤相關物質等，通過用免疫學方法或化學方法對上述檢測用部件進行染色或測定，可以診斷腫瘤等。採用本發明的裝置結構以及檢查方法可以檢測出的腫瘤的例子有皮膚癌、口腔癌、乳腺癌以及直腸癌等。皮膚癌的例子可以舉出惡性黑素瘤、基底細胞癌、扁平上皮癌等，口腔癌的例子可以舉出舌癌、頰黏膜癌、喉癌等。
另外，上述腫瘤相關抗原、腫瘤標記物和其他腫瘤相關物質可以選自黑素瘤細胞、黑素瘤標記物(NKI/C3)、黑素瘤標記物(PAL/Ml)、黑素瘤標記物(S-100α和β)、癌胎兒性抗原(CEA)、神經芽腫(CE7)、神經芽腫(AD2)、致惡性腫瘤素、α-胎兒性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、鹼性胎兒蛋白(BFP)、胰腺癌胎兒性抗原(POA)、胎兒性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相關抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相關抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相關抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相關抗原(Span-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平細胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特異抗原(PA)、鐵蛋白、組織多肽抗原(TPA)、腫瘤相關抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、酶、胺基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素類。
黑素瘤標記物的檢測可以考慮特異性和靈敏度使用各種黑素瘤抗體。黑素瘤抗體只要是惡性黑素瘤特異性高的抗體即可，可以是任意一種物質。通過貼付在病變部位，剝離固定或吸附固定有組織、血液和細胞等的本發明的診斷用裝置結構，採用使用上述抗體的EIA法、使用各種標識粒子(膠乳、金膠體)的免疫測定法以及螢光免疫測定法，以細胞染色的形式可以檢測出組織、血液或細胞中有無腫瘤標記物。另外，5-S-半胱氨醯多巴的場合，本發明的診斷用裝置結構的檢測用部件經甲醛處理後，可以用螢光顯微鏡檢測出來。這時，通過被染色的細胞的顏色濃度及其個數可以進行定性的判斷。另外，也可以使用上述方法以外的任意一種公知檢測方法，測定本發明裝置結構上吸附固定的組織、細胞、蛋白質、肽等。
以下結合試驗例更詳細地說明本發明的實施例、比較例，但是本發明並不僅限於這些實施例。試驗例1-3中討論了診斷用裝置所使用的檢測用部件對蛋白質的吸附特性、擴散性以及在電場中的保持性能。試驗例4中選擇試驗例1-3中的診斷用裝置的檢測用部件，評價對乳腺癌腫瘤標記物—人癌胎兒性抗原(人CEA)的免疫學染色法的染色性能帶來的影響。而且，試驗例5中使用本發明的診斷用離子電滲裝置，討論從皮膚檢測乳腺癌標記物—人CEA。另外，以牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司生產)、人胰島素(Sigma公司產生產)和人CEA(生化學工業)作為代表性蛋白質、肽以及診斷用標記物的例子。(試驗例1)為了評價診斷用裝置的檢測用部件的特性，選擇由各種材料構成的多孔膜，討論對蛋白質的吸附特性。另外，蛋白質的吸附量是通過使用代表性蛋白質能夠簡便測定的慣用方法，將1.3cm2的各種檢測用部件在室溫下浸漬於含有示蹤量的用125I標識的牛血清白蛋白(I-BSA，0.827mCi/mg，ICN Pharmaceutical Inc.)或人胰島素(0.912μ Ci/μg，ICN Pharmaceutical Inc.)的溶液(蛋白質濃度為1mg/ml磷酸鹽緩衝液)400μl中90分鐘後，用磷酸鹽緩衝液洗滌，通過用γ-計數器測定殘留放射活性從而計算出來。各實施例以及比較例中所採用的檢測用部件的材料如下所示。
實施例1硝酸纖維素膜(Biolad公司生產，硝酸纖維素薄膜)實施例2尼龍膜(Pall公司生產，Biodyne A)實施例3疏水性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Biolad公司生產，PVDF薄膜)比較例1親水性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司生產，親水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在試驗之前在100％的甲醇中浸潤數秒進行親水處理，之後用磷酸鹽緩衝液浸潤。
圖2是表示實施例1-3和比較例1中牛血清白蛋白(BSA)對診斷用裝置所使用的檢測用部件的吸附性的圖(平均±標準偏差，n＝3)。另外，圖3是表示同樣在實施例1-3和比較例1中人胰島素對診斷用裝置所使用的檢測用部件的吸附性的圖(平均±標準偏差，n＝3)。BSA的吸附量如圖2所示，在實施例1中為約80μg/cm2，實施例2中為約50μg/cm2，實施例3中為約170μg/cm2。另外，使用蛋白質吸附性低的部件的比較例1中為5μg/cm2以下。另一方面，人胰島素的吸附量如圖3所示，在實施例1中為約100μg/cm2，實施例2中為約80μg/cm2，實施例3中為約150μg/cm2。另外，比較例1中為5μg/cm2以下。硝酸纖維素、尼龍、疏水性PVDF對代表性蛋白質和肽-BSA和人胰島素具有高吸附能力。(試驗例2)其次，討論各種檢測用部件中各種蛋白質的擴散性。採用與試驗例1相同的方法，也就是將1.3cm2的各種檢測用部件在室溫下浸漬於含有示蹤量的用125I標識的BSA的溶液(蛋白質濃度為1mg/ml磷酸鹽緩衝液)400μl中90分鐘後，用磷酸鹽緩衝液洗滌，用γ-計數器測定殘留放射活性。之後，再在磷酸鹽緩衝液中浸漬24小時，同樣用γ-計數器測定殘留的放射活性。各實施例和比較例中使用的檢測用部件的材料如下所示。
實施例4硝酸纖維素膜(Biolad公司生產，硝酸纖維素薄膜)實施例5尼龍膜(Pall公司生產，Biodyne A)實施例6疏水性PVDF膜(Biolad公司生產，PVDF薄膜)比較例2親水性PVDF膜(Millipore公司生產，親水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在試驗前與上述試驗例1同樣進行親水處理。
實施例4-6和比較例2得到的結果如表1所示。
表1
表1表示牛血清白蛋白對診斷用裝置所使用的檢測用部件的擴散性(平均±標準偏差，n＝3)。如表1所示，實施例4、5、6中，24小時後的吸附量都幾乎不減少，確認吸附的蛋白質在溶液中不擴散。另外，比較例2確認幾乎沒有初期吸附，24小時後吸附量進一步減少。(試驗例3)另外，討論診斷用裝置中檢測用部件的吸附性能，特別是在電場中的特性。使用作為代表性蛋白質的BSA、人胰島素，以及一種診斷用標記物人CEA，評價各種檢測用部件在電場中的吸附性能。對於BSA、人胰島素、人CEA，在100-150V下進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(使用10-25％聚丙烯醯胺梯度凝膠)。另外，電泳時各種蛋白質的用量為2.5μg。使電泳後的凝膠與實施例和比較例的2張轉印膜重疊，再放上第3張作為支持膜的硝酸纖維素膜，在150mA下轉印3小時。轉印的蛋白質用醯氨黑染色液染色。各實施例和比較例所使用的檢測用部件的材料如下所示。
實施例7硝酸纖維素膜(Biolad公司生產，硝酸纖維素薄膜)實施例8尼龍膜(Pall公司生產，Biodyne A)實施例9疏水性PVDF膜(Biolad公司生產，PVDF薄膜)比較例3親水性PVDF膜(Millipore公司生產，親水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在試驗前與上述試驗例1和2同樣進行親水處理。
實施例7-9和比較例3得到的結果如表2所示。
表2
表2表示診斷用裝置所使用的檢測用部件對於牛血清白蛋白、人胰島素和人癌胎兒性抗原在電場中的保持能力。如表2所示，對於BSA(分子量約6萬)，在實施例7-9中，主要保持在轉印膜(1)上，轉印膜(2)上僅能檢測出少量。對於人胰島素(分子量約6000)，與BSA具有同樣的趨勢，主要保持在轉印膜(1)上，轉印膜(2)上僅能檢測出少量。而且，對於人CEA(分子量約18萬)，保持在轉印膜(1)上，在轉印膜(2)上檢測不出來。另一方面，比較例3在電場中BSA、人胰島素和人CEA通過轉印膜，完全不能吸附保持。因此，硝酸纖維素、尼龍、疏水性PVDF對任何蛋白質和肽都具有高吸附性、低擴散性，並在電場中也具有較強的保持能力。(試驗例4)其次，討論各種檢測用部件對人CEA的免疫學染色的影響。分別將人CEA 0.1、1.0、10ng滴加在各種檢測用部件上，乾燥固定後，進行下述免疫學染色。對固定有人CEA的各種檢測用部件進行阻滯處理後，浸潤在一次抗體溶液(小鼠抗人CEA單克隆抗體、克隆EB-016，日本生物實驗研究所)中。用硼酸緩衝液洗滌後，浸潤在生物素標識二次抗體溶液(生物素標識抗小鼠IgF(ab』)2、DAKO JAPAN Co.、Ltd.)中。洗滌後，浸漬在過氧化物酶標識鏈球菌抗生物素蛋白(streptoavidin)溶液(生化學工業)中，用硼酸洗滌後，用DAB(diaminobenzidinetetrahydrochloride)作為基質，使之顯色。各實施例和比較例所使用的檢測用部件的材料如下所示。
實施例10硝酸纖維素膜(Biolad公司生產，硝酸纖維素薄膜)實施例11尼龍膜(Pall公司生產，Biodyne A)實施例12疏水性PVDF膜(Biolad公司生產，PVDF薄膜)比較例4親水性PVDF膜(Millipore公司生產，親水性Durapore)另外，疏水性PVDF膜在試驗前與上述試驗例1和2同樣進行親水處理。
實施例10-12和比較例4得到的結果如表3所示。
表3
表3表示各種檢測用部件對人癌胎兒性抗原(人CEA)的免疫學染色法的染色性能的影響。如表3所示，實施例10、11中可以檢測出lng以上的人CEA。實施例12中，可以檢測出10ng以上的人CEA，但在1ng以下則檢測不出來。另外，比較例4中完全沒有染色，可以認為是在免疫染色的操作過程中流出造成的。(試驗例5)使用本發明涉及的裝置，通過體外實驗研究從皮膚檢測人CEA。另外，使用Yucatan Micropigs的表皮層作為皮膚模型。在角質層一側使用診斷用裝置(陽極，銀電極)，真皮層一側設置添加有人CEA(10μg/ml，磷酸鹽緩衝液(pH＝7.4))的無紡布層，再與參比電極(陰極氯化銀電極)連接。另外，作為診斷用裝置的檢測用部件，使用具有高吸附能力、低擴散性、高保持能力以及高染色性能尼龍膜(Pall公司生產，Biodyne A)。以頻率50kHz、on/off比為50％的脈衝直流電壓、0.5mA/cm2通電1小時。免疫學檢測採用與上述試驗例4同樣的染色方法進行。另外，將人CEA 0.1、1.0、10ng滴加在檢測用部件上，作為基準值。
實施例13添加人CEA，實施離子電滲的場合比較例5添加人CEA，不實施離子電滲的場合比較例6僅用磷酸鹽緩衝液實施離子電滲的場合實施例13和比較例5、6得到的結果如表4所示。
表4
表4表示使用本發明的診斷用離子電滲裝置，人癌胎兒性抗原(人CEA)從皮膚檢測出的人CEA濃度和染色性。另外，圖4(a)-(b)是表示檢測用部件上人癌胎兒性抗原的免疫學染色結果的圖。如表4和圖4(a)-(b)所示，實施例13中檢測用部件的多個部位檢測出人CEA，與基準值相比判斷檢測量，檢測出10ng以上的人CEA。染色結果表明通過Yucatan Micropigs表皮內的毛孔或汗腺等，人CEA轉移到檢測用部件上。另一方面，比較例5、6中沒有檢測出人CEA(基準值0.1ng以下)。這樣，通過皮膚也可以檢測出腫瘤標記物，表明本診斷用裝置結構以及染色方法具有實用性。
因此，本發明提供的採用離子電滲的裝置結構對診斷腫瘤等是有用的。使用本發明的裝置結構，不需要進行皮膚或黏膜表面的外科切除或穿刺吸引，不會給患者帶來痛苦，可以在短時間內非常容易地採集試樣。因此，可以檢查診斷皮膚癌、口腔癌、乳腺癌和直腸癌等腫瘤塊。而且，可以減少外科處理等引起的復發。另外，使用本發明的裝置結構，對於難以判斷的極初期腫瘤，也可以確認腫瘤相關抗原、腫瘤相關標記物或其他腫瘤相關物質的有無，使腫瘤的早期診斷成為可能。而且，採用本發明的裝置結構，將皮膚或黏膜表面的組織、細胞或它們的分泌物或其他物質吸附固定在檢測用部件上，將其直接作為試樣使用，因此與現有技術相比可以迅速而且容易地進行診斷，在經濟上也是實用的。
工業實用性本發明涉及的離子電滲裝置結構和檢測方法對迅速而且高靈敏度地檢測出生物體內成分是有用的，適用於醫療領域的離子電滲。
權利要求
1.離子電滲裝置結構體，其特徵在於，包括離子電滲用電極、通過離子電滲吸附生物體內成分的檢測用部件、上述電極和檢測用部件之間設置的導電層。
2.如權利要求1所述的離子電滲裝置結構體，其特徵在於，上述檢測用部件由多孔性膜構成。
3.如權利要求1或2所述的離子電滲裝置結構體，其特徵在於，上述檢測用部件每1cm2的蛋白質吸附能力為20μg以上。
4.如權利要求1至3中任意一項所述的離子電滲裝置結構體，其特徵在於，上述檢測用部件的厚度為5-200μm。
5.如權利要求1至4中任意一項所述的離子電滲裝置結構體，其特徵在於，上述檢測用部件能夠吸附生物體組織、血液和細胞中的至少一種。
6.如權利要求1至4中任意一項所述的離子電滲裝置結構體，其特徵在於，上述檢測用部件能夠吸附生物體組織、血液和細胞中至少一種分泌的物質。
7.如權利要求6所述的離子電滲裝置結構體，其特徵在於，上述分泌的物質是肽或蛋白質。
8.如權利要求1至4中任意一項所述的離子電滲裝置結構體，其特徵在於，上述檢測用部件能夠吸附腫瘤相關抗原、腫瘤標記物或其他腫瘤相關物質。
9.如權利要求8所述的離子電滲裝置結構體，其特徵在於，上述腫瘤相關抗原、腫瘤標記物或其他腫瘤相關物質選自黑素瘤細胞、黑素瘤標記物(NKI/C3)、黑素瘤標記物(PAL/Ml)、黑素瘤標記物(S-100α和β)、癌胎兒性抗原(CEA)、神經芽腫(CE7)、神經芽腫(AD2)、致惡性腫瘤素、α-胎兒性蛋白(AFP)、胃蛋白酶原、鹼性胎兒蛋白(BFP)、胰腺癌胎兒性抗原(POA)、胎兒性前清蛋白(EPA)、碳水化合物抗原(CA19-9)、胰腺癌相關抗原(CA50)、癌抗原(CSLEX-1)、胰腺癌相關抗原(Sialyl SSEA-1)、胰腺癌相關抗原(Dupan-2)、癌抗原(NCC-ST-439)、碳水化合物抗原(Sialyl Tn)、癌抗原(CA72-4)、癌抗原(KMO-1)、胰腺癌相關抗原(SPan-1)、碳水化合物抗原(CA125)、癌抗原(CA15-3)、扁平細胞癌(SCC)、精原蛋白(seminoprotein)(γ-Sm)、前列腺特異抗原(PA)、鐵蛋白、組織多肽抗原(TPA)、腫瘤相關抗原(CYFRA-21-1)、免疫酸性蛋白(IAP)、免疫抑制酸性蛋白、前列腺酸性蛋白(PAP)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、酶、胺基酸、含有粘多糖的粘液、多巴、多巴胺以及激素類。
10.離子電滲用塗藥器，其特徵在於，由具有凹面的襯墊、設置在上述襯墊凹面底部的電極、設置在上述襯墊凹面上部的生物體內成分檢測用部件以及設置在電極和生物體內成分檢測用部件之間的導電層構成。
11.如權利要求11所述的離子電滲用塗藥器，其特徵在於與上述生物體內成分檢測用部件相應的部分具備帶開口的粘性片材。
12.生物體內成分的檢測方法，其特徵在於，採用離子電滲使生物體內成分吸附在檢測用部件上，通過用免疫學方法或化學方法檢測吸附在該檢測用部件上的生物體內成分。
13.如權利要求12所述的生物體內成分檢測方法，其特徵在於上述檢測是通過對上述生物體內成分染色或測定進行的。
14.離子電滲系統，其特徵在於，由離子電滲裝置、參比裝置以及電源構成，離子電滲裝置包括通過離子電滲吸附生物體內成分的檢測用部件、裝置用電極以及設置在上述裝置用電極和檢測用部件之間的導電層，參比裝置包括與上述裝置用電極對應設置的參比電極，電源將上述裝置用電極和上述參比電極之間電連接起來。
15.如權利要求14所述的離子電滲系統，上述檢測用部件具有平均孔徑0.001-20μm的多孔性結構。
全文摘要
本發明涉及可以迅速而且高靈敏度檢測出生物體內成分的離子電滲裝置結構體。在這種結構中,具有凹面的襯墊(1)的底部設有電極(2),凹面部分設有導電層(3)。電極(2)上設有連接端子(4),它可以通過襯墊(1)底部開的小孔與電源相連。在這樣結構中,設置能夠吸附生物體內成分的檢測用部件(6)。檢測用部件(6)預先貼付在其相應部分具有開口的粘性片材(5)上,離子電滲開始時,使檢測用部件(6)與皮膚或黏膜接觸使用。
文檔編號A61B5/1477GK1308503SQ99808414
公開日2001年8月15日 申請日期1999年5月19日 優先權日1998年6月5日
發明者肥後成人, 安達博敏, 葛卷紀行 申請人:久光製藥株式會社