作為新填料的粘彈性凝膠的製作方法

2023-09-22 16:13:40

專利名稱：作為新填料的粘彈性凝膠的製作方法
技術領域：
透明質酸(HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙醯-D-葡糖胺的交替殘基組成的雜多糖。取決於其獲自的來源和所使用的製備方法，HA是具有50，000至13 X IO6Da分子量範圍的直鏈聚合物。HA天然存在於細胞外周膠質中、脊椎動物的結締組織的基質中(其是主要組分之一)、玻璃體液中和臍帶中。HA在生物有機體中起著重要的作用，作為組織的結構和機械支持物，並在細胞生理組織如皮膚、肌腱、肌肉和軟骨中作為活性組分。它是軟骨基質的主要分子之一，還代表了滑液的主要非蛋白質構成部分。由於它是較強的親水性粘彈分子，因此其賦予了滑液以潤滑劑特性；HA因此已用於骨關節炎超過 30年，主要用於治療相關的疼痛。根據構造學觀點，HA還在組織修復過程中(在組織胞外基質的構造和調節其水合中)發揮著關鍵作用，並作為其中所述多糖直接或間接發揮作用的許多生理過程(血塊形成、吞噬細胞活性、成纖維細胞增殖、新血管形成、再上皮化等等)的刺激/調節物質 (Weigel P.等人，J Theoretical Biol, 1986 :219-234 ；Abatangelo G.等人，J Surg Res, 1983,35 =410-416 ；Goa K.等人，Drugs, 1994,47 :536-566)。由於這些特性是長期公認的， 所以還將HA用於製備護理多種來源的傷口、潰瘍和皮膚損傷的敷料。透明質酸還用作臉部皺紋、溝和小凹陷部位的填料，並且用於增加嘴唇和臉頰的體積，因為其免疫學惰性、無毒性、生物可降解和生物可再吸收。基於透明質酸的處理旨在校正 嘴唇體積和輪廓 溝(例如鼻唇溝) 面部輪廓(例如臉頰和下巴)的重塑 皺紋(例如眉間線和口連合) 眶周皺紋 纖維性痤瘡後疤痕 纖維性創傷後疤痕 軟組織瑕疵 鼻成形術疤痕。透明質酸並非永久性填料。這意味著，一旦注射，根據所處理的部位和所使用製劑的類型，該產品被身體以不同的時間逐漸代謝和再吸收。填充和增加的體積(或者弱化的皺紋)的效果是立竿見影的，並且僅持續數周。基於它們不同的再吸收時間，市售的主要產品可以劃分為以下種類
快速再吸收填料個月)。 中期再吸收填料(5-6個月)， 緩慢再吸收填料(1 年)例如 Restylane Sub Q(QMed, EP0839159)。在真皮中，由於HA結合水的大容量，HA發揮著水合作用，並且作為「支架」發揮結構功能，因為通過與其他物質結合，其形成了使得皮膚緊湊的大分子複合物。因此，作用機制由以下組成由於產物的粘彈性特性所致的即刻體積填充，和由於刺激皮膚成纖維細胞所致的新膠原合成。然而，HA是天然多糖，其被結締組織中存在的透明質酸酶快速分解；為了獲得作用持續數月的填料，因此對HA進行交聯過程，這改進其粘彈特性並增加其停留時間。由此形成的填料例如通過bdde(i，4-丁二醇二環氧甘油醚，Restylane 、BELOTERO 和Regenyal Idea)或DVS (雙乙烯碸，Hylaform )，其在聚合物分子之間產生了橋接。 然而，增加交聯程度會逐漸使HA變性到顯著改變其化學、物理和生物學特性的程度。過分交聯的HA基塊表現為顆粒固體，其不再被細胞(和尤其被免疫系統)識別為HA;因此，多糖被感知為異物，這會啟動炎症反應，在其周圍形成纖維化囊。此外，過分交聯的HA不能刺激由充分建立的科學結果已知的、由具有刺激皮膚成纖維細胞合成膠原作用的HA片段(特別是那些具有低分子量的HA片段)誘導的真皮/皮膚組織再生。還可將填料劃分為可再吸收的或永久性的。可再吸收型是最生物相容的；它們由修飾的或者以天然形成存在的透明質酸或膠原組成，因此在最多一年內被再吸收。永久型由合成聚合物例如聚丙烯醯胺組成，特別是交聯分子，其當與水結合時形成穩定的凝膠。永久型一直留在原位，對於填充嘴唇非常有用，但是並不推薦使用它們，因為由於它們的皮膚嵌入越來越多地經常引起急性炎症，導致填料周圍形成纖維化囊，其被識別為異物並因此是有毒的。本申請已經完成了一種新型生物材料作為新填料和/或作為形體塑造的新產品， 其通過混合以不同但是互補的方式交聯的兩種HA衍生物形成，以獲得皮膚/組織替代物， 其允許所處理皮膚/組織的立即水合(並因此立即填充)，同時在體內維持非常長的分解時間以消除重複注射的需要，從而降低副作用。本發明涉及的新生物材料表現出與透明質酸本身相同的特定生物相容特性，但是它們的生物降解性不同；當植入到體內時，它們的停留時間比未修飾的HA的停留時間更長，因此允許立即再生/重建已經喪失其原始緊實性的真皮/皮膚組織。發明詳述本申請已經完成了作為新填料和/或作為形體塑造新產品的一種新型生物材料， 其基於混合具有不同但互補特徵的兩種HA衍生物，以獲得用於在處理皮膚瑕疵中、在皮膚病學中、在皮膚美容學(dermocosmetology)中和/或在美容外科中注射的新產品，其產生1.立即的真皮/皮膚水合2.所處理組織的立即填充3.非常長的體內分解時間4.降低的副作用。該新生物材料的組成為
·自動交聯的透明質酸(ACP)或HA十六烷基醯胺(HA hexadecylamide/HYADD)， 混合有 與BDDE交聯的透明質酸(HBC)。如在EP 0341745中所製備的用於本發明的ACP具有4%至5%的平均交聯程度， 並優選地使用平均分子量(MW)為200KDa的HA製備。當水合時，其表現為自動交聯凝膠， 不具有不同於天然多糖的分子，因為它產生於相同多糖鏈和/或鄰近鏈的羧基和羥基之間的酯鍵。因此，它沒有免疫毒性，生物相容性與天然HA —樣，高度溼潤，並容易被透明質酸酶降解，釋放的低分子量分子能刺激膠原合成以改進皮膚組織的緊度和彈性。HA十六烷基醯胺(HYADD)如EP 1095064和EP1853279中所述製備，優選地使用平均分子量(MW)為500-730KDa的HA，最終醯胺化/替換的平均程度為1<%至3%(摩爾)。ACP和HYADD是HA衍生物，其負責由真皮內注射本發明涉及的填料誘發的立即水合(導致瞬時的真皮填充)。與BDDE交聯的HA(含環氧基團的分子，用於在HA的伯羥基上形成醚)含有交聯分子，因此對酶降解更有抗性，因為其具有穩定多糖的酯鍵，賦予所獲得的產品更長的停留時間。將兩種種類的交聯HA混合導致新生物材料的形成，其具有與天然透明質酸相同的生物相容性特徵，但具有不同的生物降解性，以致當植入到體內時，它的停留時間比未修飾的HA更長，從而允許再生/重建已經喪失其原始緊實性的真皮組織。本申請還證明，它們的結合很出乎意料地導致體內分解時間比由相同類型的HA與BDDE交聯形成的市售參照填料更長，隨之增加了停留時間。最後，本申請要求保護新生物材料作為填料和/或作為形體塑造新產品在處理皮膚瑕疵中、在皮膚學中、在皮膚美容學中和/或在美容外科中的用途。新生物材料的化學不均一性質允許通過適當改變構成部分之間的重量比來調節終產物的特性。兩種HA可以以10 90至90 10的ACP (或HYADD) HBC的比率混合。重量比將基於所需最終粘性來選擇，這取決於所處理的部位。如果待處理部位需要植入大量的生物材料，如在填充乳房、臀部、臉頰或下頌或者深度表情皺紋(de印expression wrinkle)的情況下，所用的生物材料優選地表現出良好的緊實性，因此粘性適合於獲得具有良好稠度和低生物降解性速率；在這種情況下，ACP (或HYADD) HBC混合物為10 90 至50 50，並且優選25 75，因為通過增加HBC的重量分數獲得的產物更適合於發揮更長持續的體積增強效應。然而，如果是處理唇溝或者細的前額皺紋，那麼ACP(或者 HYADD) HBC的比率優選地為90 10至50 50，因為填料中較高的ACP分數產生的材料更適合於皮膚的生物復甦和細線、表情皺紋等的校正。此外，針管必須具有非常大的尺度；從而凝膠必須可以容易地擠壓，並比前述凝膠具有更小的粘性。因此，基於選擇的 ACP HBC比率可以調節產品的流變學特性。ACP(或HYADD)/HBC組分是等同的，生物材料的特性還可以通過靶向選擇製備其的賦形劑適當地調節例如，將ACP HBC為50 50 (重量)的混合物分散在鹽溶液(0.9% NaCl)中比如果將其分散在PH = 6. 95的磷酸鹽緩衝液中更有粘性；因此，對於這種特定的混合物，為了製備在原位具有有限分散率的產品，鹽溶液是更合適的介質。主要由HBC組成的材料顯示出相反的特性。材料的粘彈性特性因此影響產品的性能。本發明還涉及如上描述的兩種生物材料的製備方法方法A和方法B。
新方法A和B分為兩個步驟
1.用於生成HBC衍生物的方法，和
2.用於將其與ACP或HYADD衍生物混合的方法。
這兩個步驟導致產生了具有非常高純度的產物。使用通常用於產生與BDDE交聯的HA的方法，通過洗滌所獲得的凝膠團塊(mass)或者通過透析進行純化。在兩種情況下， 由於摻入了大量溶劑的凝膠基質的性質(鑑於其膨脹傾向)，所以不能實現最佳純化效率。 這些凝膠具有低流動性和運輸能力，傾向於沉澱為膠凝狀膠狀物。如此獲得的沉澱被分離為固體，當再水合時具有不同的溶解性和流變學特性，特別是膨脹度、彈性和均一性(填料的基本特徵)。
然而，以下由本申請人描述為方法A的本方法以細碎粉末形式沉澱產物，因此容易洗滌。此外，在沉澱和洗滌後，通過再水合和滅菌，精心選擇的反應條件產生了具有凝膠重建能力的產物，產生的生物材料具有可重複的、良好標準化特徵的彈性和均一性。
方法B不包括將HBC產物沉澱為粉末的步驟；(混合HBC與ACP或HYADD後獲得的)凝膠的純化和均一化在粉碎步驟實現，其包括使其通過具有25 μ m至150 μ m顆粒物質保留係數的濾器。該步驟純化最終的凝膠並使得其具有理想的均一性。
在本發明中用於製備上述衍生物(HBC、ACP和HYADD)的HA可以來源於任意來源，如提取自雞冠花(cockscombs)或者發酵，具有400至3X10^1、優選地IX IO5Da至 1 X IO6Da且甚至更優選地200，000至1 X IO6Da的平均分子量。
新製備方法A包括以下步驟
交聯HBC的合成
1.在二環氧化BDDE的鹼性溶液(優選地0. 15M-0. 35M NaOH)中以2. 5%至25% (摩爾)，優選5%至15% (摩爾)(取決於產品的預期用途；BDDE的百分比越高，停留時間越長)的化學計量比溶解重複單位的透明質酸，然後
2.在室溫，在前項中所述的溶液中分散HA。HA濃度必須在80mg/ml至300mg/ml， 均一化時間為30分鐘至300分鐘。
3.通過加熱激活引發反應，在35°C至55°C的溫度加熱所述溶液2小時至36小時。
4.擠壓所獲得的團塊通過金屬篩，以將其降低成大約600 μ m大小的顆粒。
5.在4°C至的溫度，通過用水以3至25倍稀釋，水合凝膠4小時至48小時。
6.用濃度為0. 5至5摩爾/升、優選1至2摩爾/升的HCl水溶液校正pH至中性。
7.添加2. 5倍體積的水溶性有機溶劑，如乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇、二巧I烷、乙腈、丙酮和/或它們的混合物(優選地乙醇和丙酮)，直到獲得沉澱粉末形式的產物。
8.用含有水百分數在35%以下的有機溶劑洗滌，如乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇、 二巧惡烷、乙腈、丙酮和/或它們的混合物(優選地乙醇和丙酮)。
9.在30°C至45°C的溫度、在真空下乾燥2至7天，並且在任何情況下直到將殘餘溶劑去除在400ppm以下，獲得白色HBC粉末。
ACP (或 HYADD)與 HBC 的混合
10.以10 90至90 10的ACP HBC比率(取決於所選擇的用途，如前所述) 將HBC粉末與ACP (或HYADD)粉末混合。
11.在01至^rc的溫度，用鹽溶液或磷酸鹽緩衝液、優選鹽溶液(其可以含有另外的賦形劑如利多卡因)水合，產生12mg/ml至27mg/ml、優選20mg/ml至25mg/ml的總HA 濃度。
12.通過具有50 μ m至500 μ m、優選100 μ m至250 μ m篩孔的篩擠壓。所述過濾在室溫或者在25°C至65°C、優選在40°C至60°C的溫度進行。
13.用獲得的產物填充優選由玻璃或者聚合物材料製備的注射器。
14.用飽和蒸汽在120°C至的溫度(優選121. 5士 1°C )加熱滅菌至少10分鐘。
新製備方法B包括以下步驟
交聯HBC的合成
1.在二環氧化BDDE的鹼性溶液(優選0. 15M-0. 35M NaOH)中、以2. 5%至25% (摩爾)、優選5%至15% (摩爾)(取決於產品的預期用途)的化學計量比溶解重複單位的透明質酸，然後
2.在室溫，在前項中所述的溶液中分散HA。HA濃度必須在80mg/ml至300mg/ml， 均一化時間為30分鐘至300分鐘。
3.通過加熱激活引發反應，在35°C至55°C的溫度加熱所述溶液2小時至36小時。
4.用濃度0. 05摩爾/升至1摩爾/升、優選0. 1摩爾/升的HCl水溶液校正pH至中性。
5.在4°C至的溫度，通過用水以3至20倍稀釋，水合凝膠4小時至48小時。 該溶液可以另外含有賦形劑，如NaCl、磷酸鈉或者鉀鹽和利多卡因，優選地以鹽酸鹽形式。 鈉鹽(氯化鈉或者磷酸鈉)具有維持產物的合適滲透壓的功能，並將PH維持在與組織相兼容的值。在本發明優選的實施方案中，加入的NaCl的量使得最終溶液含有0.8%至1.0% 的濃度，優選0. 9% ；如果存在鹽酸利多卡因，那麼其加入量使得最終製劑含有2. 2mg/ml至 3. 2mg/ml 的量，優選 2. 7mg/ml。
ACP (或 HYADD)與 HBC 的混合
6.取決於選擇新填料的用途，如前所述，以10 90至90 10的ACP(或 HYADD) HBC比率(以活性成分的重量計)將HBC凝膠與ACP (或HYADD)粉末混合。備選地，兩種組分都以凝膠形成開始將ACP或HYADD與HBC混合，使用合適的攪拌系統(優選地用軌道刀片(orbital blade))，在0°C至的溫度攪拌30分鐘至M小時。
7.通過具有25 μ m至150 μ m、優選40 μ m至IlOym的顆粒物質保留係數的濾器， 粉碎並均一化。如果粘度過高，該操作可以在25°C至65°C的溫度加熱進行。
8.用所獲得的產物填充由玻璃或聚合物材料製備的注射器。
9.在120°C至的溫度(優選121. 5士 1°C )用飽和蒸汽滅菌至少10分鐘。
以下舉例而非限制地描述了製備本發明新填料的一些實施例。
實施例1 :HBC 500 (HA 50Q-730kDa)的合成
方法A
將通過發酵產生的0. 075摩爾分子量為500-730kDa的HA分散在含1. 41ml BDDE 的215ml 0. 25M NaOH溶液中。然後將該混合物加熱到42°C並反應3小時。然後用300ml 含化學計算量HCl的溶液水合該混合物M小時，以調整pH至中性。使總體積為750ml，用2. 5倍體積的乙醇沉澱，獲得可濾過的、可潷析的沉澱物。將混合物用75%乙醇洗滌，直到徹底純化，通過測量洗滌溶劑的比電導率驗證，其應當低於30μ S/cm，在40°C真空下乾燥5 天。獲得HBC 500產物，重量產率87%。
實施例2 :HBC 1000 (HA IMDa)的合成
方法A
將通過發酵產生的1. 60g平均分子量為IMDa的HA分散在含75 μ IBDDE的20ml 0.25M NaOH溶液中。然後將該混合物加熱到42°C並反應2小時。然後用20ml含化學計算量HCl的溶液水合該混合物M小時，以調整pH至中性。使總體積為75ml，用2. 5倍體積的乙醇沉澱HBC，以獲得可濾過的、可潷析的沉澱物。將混合物用75%乙醇洗滌，直到徹底純化，通過測量洗滌溶劑的比電導率驗證，其應當低於30 μ S/cm，在40°C真空下乾燥5天。獲得產物HBC 1000，重量產率90%。
實施例3 :HBC 200 (HA 200MDa)的合成
方法A
將通過發酵產生的2. 55g平均分子量為200KDa的HA分散在含63 μ IBDDE的20ml 0.25M NaOH溶液中。然後將該混合物加熱到42°C並反應150分鐘。然後用20ml含化學計算量HCl的溶液水合該混合物M小時。使總體積為75ml，用2. 5倍體積的乙醇沉澱，以獲得可濾過的、可潷析的沉澱物。將混合物用75%乙醇洗滌，直到徹底純化，通過測量洗滌溶劑的比電導率驗證，其應當低於30 μ S/cm，在40°C真空下乾燥5天。獲得產物HBC 200，重量產率85%。
實施例4 製備比率為50 50的ACP HBC 500凝膠
方法A
將1. OOg如實施例1中所述製備的HBC 500與1. OOg HA ACP內酯混合。在8°C的溫度用IOOml 0.9% (重量/體積)無菌鹽溶液水合粉末16小時。將所獲得的凝膠加熱至 48°C，通過具有0. 17mm篩孔的金屬篩過濾，然後分布在Iml玻璃注射器中，其隨後在121°C 的溫度經歷飽和蒸汽滅菌循環10分鐘。獲得適合於局部施用的均一無菌凝膠。
實施例5:製備比率為30 70的ACP HBC 1000凝膠
方法A
將1. 40g如實施例2所述製備的HBC 1000與0. 60g HAACP內酯混合。在8°C的溫度用IOOml 0.9% (w/v)無菌鹽溶液水合粉末16小時。將獲得的凝膠加熱至48°C，通過具有0. 17mm篩孔的金屬篩過濾，然後分布在Iml玻璃注射器中，其隨後在121°C的溫度經歷飽和蒸汽滅菌循環10分鐘。獲得適合於局部施用的均一無菌凝膠。
實施例6:製備比率為25 75的ACP HBC 500凝膠
方法A
將1. 875g如實施例1所述製備的HBC 500與0. 625g HA內酯ACP混合。在8°C的溫度用IOOml 0.9% (w/v)無菌鹽溶液水合粉末16小時。將獲得的凝膠加熱至48°C，通過具有0. 19mm篩孔的金屬篩過濾，然後分布在Iml玻璃注射器中，其隨後在121°C的溫度經歷飽和蒸汽滅菌循環12分鐘。獲得適合於局部施用的均一無菌凝膠。
實施例7:製備比率為75 25的ACP HBC 1000凝膠
方法A
將0. 50g如實施例2所述製備的HBC 1000與1. 5g HA內酯ACP混合。在8°C的溫度用IOOml 0.9% (w/v)無菌鹽溶液水合粉末M小時。將獲得的凝膠加熱至42°C，通過具有0. 17mm篩孔的金屬篩過濾，然後分布於2ml玻璃注射器，其隨後在121°C的溫度經歷飽和蒸汽滅菌循環12分鐘。獲得適合於局部施用的均一無菌凝膠。
實施例8:製備比率為60 40的HYADD HBC 500凝膠
方法A
將1. 20g如實施例1所述製備的HBC 500與0. 8g HA十六烷基醯胺(HYADD)混合。在8°C的溫度用IOOml 0.9% (w/v)無菌鹽溶液水合粉末M小時。將獲得的凝膠加熱至52°C，通過具有0. 17mm篩孔的金屬篩過濾，然後分布於Iml玻璃注射器，其隨後在121°C 的溫度經歷飽和蒸汽滅菌循環11分鐘。獲得適合於局部施用的均一無菌凝膠。
實施例9:製備比率為40 60的HYADD HBC 500凝膠
方法A
將通過發酵產生的平均分子量為500-7301(0￡1的8.(^ HA鈉鹽分散在含0. Mml BDDE的40ml 0. 25M NaOH溶液中。然後將該混合物在41. 5°C加熱2小時40分鐘。然後用 IOOml 0. IM HCl溶液和200ml水水合過夜。加入50ml NaCl的飽和溶液，讓混合物膨脹過夜。第二天，加入170ml丙酮和30ml飽和NaCl溶液，緩慢加入1升乙醇沉澱混合物。用相同的溶劑洗滌沉澱，直至消除NaCl殘餘，然後在35°C真空下烘箱乾燥，直至殘餘溶劑已經消除。將由此獲得的HBC粉末以5 3的比率與如專利EP 1853279所述製備的HYADD混合。將混合的粉末用鹽溶液水合，得到總濃度20mg/ml (對應於12. 5mg/ml HBC和7. 5mg/ ml HYADD4)。使產物在5°C膨脹過夜，次日通過具有100 μ m公標顆粒物質保留率的平板膜過濾。將Iml玻璃注射器用如此獲得的產物填充，並在121. 5°C在FO = 13的循環中滅菌。
實施例10:HYADD HBC凝膠在真皮內兔施用模型中的皮膚填充和耐受性
實驗的目的是通過與市售填料BELOTERO 比較，評價注射到兔真皮內組織的HYADD HBC凝膠(如實施例9所述製備)引發的皮膚填充、任一肉眼可見的副作用的發病，以及組織響應。
對於所述評價，將測試的凝膠真皮內施用至體重為1. 8-2. 3kg的雄性NZW-KBL兔。
實驗設計
通過靜脈內施用氯胺酮和賽拉嗪麻醉動物。對於測試的每種填料，使用3隻動物。
第0天巡
-在剃去兔背上的毛後注射樣品(每一樣品Iml水凝膠)；
-測量所有兔的膨脹並肉眼觀察副作用。
第7 天！！
-測量膨脹體積並肉眼觀察副作用。
-用以下公式計算膨脹體積
(2/3x3i)x(rl)x(r2)x(r3)
其中(rl)、(r2)和(r3)分別表示用卡尺測量的膨脹的寬、長和高。
結果
新填料在經處理的真皮中沒有引起任何炎症事件。
獲得的停留時間的結果顯示於

圖1 在第一周的處理中評價的膨脹量(表達為mm3)顯示本發明凝膠比對照能誘導更大的皮膚膨脹體積，其甚至在7天後仍較高，並且比用作為比較物的市售填料誘導至更大的程度。該發現清楚地證實新填料立即產生了顯著的真皮水合，這種效應歸因於HYADD衍生物的存在，由於其化學/流變學特徵，已經證明其對於促進隨時間仍保持穩定的立即皮膚填充是必需的。
實施例11 :HBC 500 (HA 50Q-730kDa)的合成
方法B
將通過發酵產生的、平均分子量為500_730KDa的18. 75g HA鈉鹽分散在含885 μ 1 BDDE的13:3ml 0. 25M NaOH溶液中。然後在45°C將該混合物加熱2. 5小時。在緩慢攪拌下，用0. 62L含有化學計算量HCl、2. 65g NaCl和2. 7g鹽酸利多卡因的溶液將混合物水合過夜。
實施例12 製備比率為25 75的ACP HBC 500凝膠
方法B
在緩慢攪拌下，將6. 25g透明質酸ACP 200內酯溶解在250ml含有4. 4gNaCl的溶液。當水合完成時，將該凝膠與根據實施例11所獲得的凝膠在配備有混合半固體系統的混合器中合併，直到均質。將獲得的凝膠擠壓通過公標顆粒物質保留率70 μ m的平板膜。將由此獲得的產物引入到玻璃注射器中，並在121. 5°C於FO = 13循環中滅菌。
實施例13 製備比率為25 75的HYADD HBC 500凝膠
方法B
在緩慢攪拌下，將6. 25g HYADD十六烷基醯胺溶解在250ml含有4. 4gNaCl的溶液。當水合完成時，將該凝膠與根據實施例11獲得的凝膠在配備有軌道混合系統的混合器中合併，直到均質。將所得凝膠擠壓通過70 μ m公標顆粒物質保留率的平板膜。將由此獲得的產物引入到玻璃注射器中，並在121. 5°C於FO = 13循環中滅菌。
實施例14 :HBC 500 (HA 50Q-730kDa)的合成
方法B
將通過發酵產生的、分子量500_730kDa的125g HA鈉鹽分散在1. 33L含9. BDDE的0. 25M NaOH溶液中。將該混合物在45°C加熱2. 5小時。在緩慢攪拌下，將混合物用6. 2L含有化學計算量HCl J6. 5g NaCl和27g鹽酸利多卡因的溶液水合過夜。
實施例15 製備比率為50 50的ACP HBC 500凝膠
方法B
在緩慢攪拌下，將125g透明質酸ACP200內酯溶解在2. 5L含有44gNaCl的溶液中。當水合完成時，將該凝膠與根據實施例14獲得的凝膠在配備有具有擋板和刮刀的軌道混合系統的混合器中合併。將所得凝膠通過45 μ m公標顆粒物質保留率的平板膜擠壓。將由此獲得的產物引入到玻璃注射器中，並在121. 5°C於FO = 13循環中滅菌。
實施例16:ACP HBC凝膠在真皮內兔施用模型中的皮膚填充和耐受性
使用如實施例11-12所述製備的凝膠，如實施例10所述進行實驗，將其與 Belotero 對照和與第二市售填料Regenyal Idea比較。
對於該實驗，通過與兩種眾所周知的市售填料(其代表最終的比較物，因為二者都由與BDDE交聯的HA組成)比較，本申請人不僅測定了由處理引起的皮膚膨脹體積，還評價了本發明凝膠/填料的總停留時間。11CN 102548590 A
每兩星期(用肉眼觀察副作用)測量經處理兔的皮膚膨脹，直到最多96天。
結果
圖2顯示了所得結果證實了上述發現，即經處理真皮的立即水合與對照相比，達到了令人驚訝的更大程度；此外，相比兩種市售比較物，皮膚膨脹的大小更明顯，並且停留時間更長。在實驗結束時，本發明的新填料仍存在，而兩種對照幾乎消失。
可以以多種方式明確地修飾本文中所述方法。這類修飾不應視為偏離了本發明的精神和範圍，所有對技術人員顯而易見的修飾都包含於以下權利要求的範圍內。
權利要求
1.生物材料，其可以如下獲得以10 90至90 10的重量比混合 -透明質酸的自動交聯衍生物(ACP)與-與1，4_ 丁二醇二環氧甘油醚(BDDE)交聯的透明質酸的衍生物(HBC)，作為新填料和 /或作為形體塑造產品。
2.生物材料，其可以如下獲得以10 90至90 10的重量比混合 -透明質酸十六烷基醯胺(HYADD)與-與1，4_ 丁二醇二環氧甘油醚(BDDE)交聯的透明質酸的衍生物(HBC)，作為新填料和 /或作為形體塑造產品。
3.權利要求1-2所述的生物材料，優選地以90 10至50 50的重量比，作為生物再生填料。
4.權利要求1-2所述的生物材料，以10 90至50 50的重量比，具有體積增強效應。
5.權利要求4所述的生物材料，優選地為25 75的重量比。
6.用於製備和純化HBC衍生物的方法，包括以下步驟a.在二環氧化物BDDE的鹼性溶液中以2.5%至25%的摩爾化學計量比溶解透明質酸的重複單位，然後b.在室溫，在a)中所述的溶液中分散透明質酸(HA)；c.通過加熱激活引發反應，將b)中所述溶液在35°C至55°C的溫度加熱2小時至36小時；d.通過金屬篩擠壓獲得的團塊，以降低其至大約600μ m大小的顆粒；e.以3至20的倍數將其用水稀釋，水合所得到的凝膠；f.用HCl水溶液校正pH至中性；g.用水溶性有機溶劑如乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇、二巧憑烷、乙腈、丙酮和/或它們的混合物沉澱，直到獲得粉末形式的產物；h.用含水的有機溶劑如乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇、二，悉烷、乙腈、丙酮和/或它們的混合物洗滌；i.在真空下乾燥，直到已將殘留溶劑去除在400ppm以下，並獲得HBC粉末。
7.混合ACP或HYADD與如權利要求6中所述製備的HBC的方法，包括以下步驟a.將ACP或HYADD粉末與HBC粉末以90 10至10 90的ACP或HYADD HBC的比率混合；b.用鹽水溶液或磷酸鹽緩衝液水合，使總HA濃度為12mg/ml至27mg/ml；c.在25°C至65°C的溫度、通過具有50μ m至500 μ m篩孔的篩擠壓；d.充填注射器；e.用飽和蒸汽在120至的溫度、通過加熱滅菌至少10分鐘。
8.製備和純化HBC衍生物的方法，包括以下步驟a.在二環氧化物BDDE的鹼性溶液中以2.5%至25%的摩爾化學計量比溶解透明質酸的重複單位，然後b.在室溫，在a)中所述的溶液中分散HA;c.通過加熱激活引發反應，將b)中所述溶液在35°C至55°C的溫度加熱2小時至36小時；d.用HCl水溶液校正pH至中性；e.以3至20的倍數將其用水稀釋，水合所得到的凝膠。
9.混合ACP或HYADD與如權利要求8中所述製備的HBC的方法，包括以下步驟a.將ACP或HYADD凝膠或粉末與凝膠形式的HBC以90 10至10 90的ACP或 HYADD HBC的比率混合；b.通過25μ m至150 μ m顆粒物質保留係數的濾器，粉碎並均一化；c.充填注射器；d.用飽和蒸汽在120至的溫度加熱滅菌至少10分鐘。
10.權利要求6-9所述的方法，其中用於製備HBC、ACP和HYADD衍生物的HA具有平均分子量為400至3 X IO6Da,優選地1 X IO5Da至1 X IO6Da,和更優選地200，000至1 X IO6Da0
11.如權利要求8-9所述獲得的生物材料，其中所述ACP HBC重量比為25 75。
12.前述權利要求所述的生物材料，其中所述賦形劑是鹽溶液。
13.前述權利要求所述的生物材料，其含有利多卡因。
14.權利要求11所述的生物材料，其含有利多卡因，其中所述賦形劑由鹽溶液組成。
15.前述權利要求所述的生物材料作為新填料和/或作為新形體塑造產品在處理皮膚瑕疵中、在皮膚病學中、在皮膚美容學中和/或在美容外科中的用途。
全文摘要
通過將透明質酸的自動交聯衍生物(ACP)與與1，4-丁二醇二環氧甘油醚(BDDE)交聯的透明質酸的衍生物(HBC)以10∶90至90∶10的重量比混合，可得到作為新填料的生物材料。
文檔編號A61L27/26GK102548590SQ201080037756
公開日2012年7月4日 申請日期2010年8月25日 優先權日2009年8月27日
發明者D·雷尼爾, M·戴斯特 申請人:菲迪雅製藥股份公司