一種施氏假單胞菌及其培養應用的製作方法
2023-09-22 16:28:40 1
本發明屬於環境微生物領域，具體涉及一種耐鹽的脫COD施氏假單胞菌及其培養應用，該菌株特別適用於高含鹽廢水中COD的高效去除。
背景技術：
來源於石油、化工、醫藥和化肥等行業的鹽含量高於1%的高含鹽廢水普遍含有較高的COD，廢水中汙染物不斷排放到環境中會引起嚴重的汙染問題。淡水資源的缺乏問題日益嚴重，廢水的處理及其回收利用更受到人們的重視。
物理或化學法處理高含鹽廢水中的COD，成本高並且可能會造成二次汙染。傳統生物法在處理低鹽度廢水時有很大優勢，但在高鹽、高酸鹼、高溫或低溫逆環境中，微生物的降解能力就會受到抑制。耐鹽菌處理高含鹽廢水具有普通活性汙泥法無可比擬的優勢，且比物理化學法成本低，會產生較為明顯的經濟效益和社會效益，可以為相關廢水處理達標排放提供技術支撐。
耐鹽菌技術正是基於工程領域的問題和急需而產生，通過科學方法馴化出處理高含鹽廢水的優勢耐鹽菌，該類菌體以其獨特的細胞結構和物質組成能夠在較高含鹽度的環境中生長。該類耐鹽微生物的耐鹽性狀與其適應極端環境的豐富酶系和活性產物有關。
施氏假單胞菌可用於廢水中總氮脫除、COD脫除及有機物降解等多個領域。
在採用施氏假單胞菌處理廢水中氨氮及總氮技術領域：CN201310375037.8涉及到一種應用於廢水脫總氮的施氏假單胞菌WZUF25，保藏號為CGMCC No.7685。該菌株不僅對NO3--N和NO2--N的去除率高，而且具有很高的同化NH4+-N能力，可為同步硝化和反硝化提供種源。CN201410009181.4涉及到一種應用於脫硝酸鹽的施氏假單胞菌DN-LWX19，保藏號為CGMCC No.8521。該菌株對初始NO3--N濃度為32mg/L的模擬汙水，24h去除率能達到98%，32h去除率達100%，且無亞硝酸鹽積累。CN201410022561.1涉及到一種應用於低溫生物脫氮的施氏假單胞菌DN-3，保藏號為CGMCC No.8291。CN201210151039.4涉及到一種應用於養殖水體快速脫總氮的施氏假單胞菌DB-33，保藏號為CGMCC No.5993。該菌株可快速降解水體中的硝酸鹽，亞硝酸鹽，氨氮。CN201210201976.6涉及到一種應用於兼性厭氧反硝化的施氏假單胞菌LZ-4，保藏號為CCTCC NO：M2011430。CN200910273046.X涉及到一種應用於水體中總氮脫除的施氏假單胞菌YZN-001，保藏號為CCTCC NO：M209107。CN200910273368.4涉及到一種應用於水體中總氮脫除的施氏假單胞菌CY003，保藏號為CCTCC NO：M209196。
在採用施氏假單胞菌進行有機物降解脫除領域：CN201110322523.4涉及到一種包含施氏假單胞菌、惡臭假單胞菌、穿孔假單胞菌和枯草芽孢桿菌的應用於特異性有機物降解的複合菌劑，對滷代烴類、苯酚類、苯酸類、芳香烴類、多環芳烴類、雜環化合物、鄰苯二甲酸酯等有毒有害有機汙染物具有特異降解能力。CN201210573242.0涉及到一種包含惡臭假單胞菌RW10S2、施氏假單胞菌、惡臭假單胞菌DN6和惡臭假單胞菌BIRD-1的應用於苯系物降解的複合菌劑。CN200910303045.5涉及到一種降解高分子多環芳烴（BAP，BGP，PAHs）效率較高的施氏假單胞菌MT-5。CN201310746598.4涉及到一種應用於提高厭氧產沼效率和汙泥有機質分解率的施氏假單胞菌KY-02。
在採用施氏假單胞菌進行COD降解脫除領域：CN201310680417.2涉及到一種應用於好氧反硝化的施氏假單胞菌JH-1，保藏號為CCTCC NO：M2013488，其可同步脫除有機廢水中60-80%的COD。CN201110118549.7涉及到一種應用於兼性厭氧反硝化的施氏假單胞菌LZ-14，保藏號為CCTCC NO：M2011119，其可同步去除有機廢水中的COD。
在高含鹽廢水處理領域，鹽含量是影響微生物處理廢水效率的一個關鍵性因素。信欣等（生物強化技術處理高含鹽有機廢水[J].水處理技術，2008，8：66-70）採用生物強化技術處理高含鹽有機廢水，採用耐鹽菌生物強化的皂素廢水生物處理系統活性汙泥的脫氫酶活性顯著提高，系統耐受氯離子濃度高達2.8%時，皂素廢水COD的去除率為84.41%。CN201210130657.0、CN201210130644.3、CN201010536065.X和CN201210130658.5涉及到採用沼澤考克氏菌（Kocuriapalustris）FSDN-A、科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）FSDN-C，節桿菌（Arthrobactercreatinolyticus）FDN-1、水氏黃桿菌（Flavobacteriummizutaii）FDN-2、脫氮副球菌（Paracoccusdenitrificans）DN-3和甲基桿菌（Methylobacteriumphyllosphaerae）SDN-3對含鹽廢水及催化裂化催化劑廢水中的氨氮、總氮及化學需氧量進行生物處理的方法。該方法需要培養多種菌株進行復配製備耐鹽菌劑，製備過程複雜，生產成本較高。
目前，已知篩選獲得的施氏假單胞菌存在不具有耐鹽性能或耐鹽性能不佳等問題，不適用於高含鹽廢水的處理。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種耐鹽的脫COD施氏假單胞菌及其培養應用。本發明提供的施氏假單胞菌可快速降解脫除高含鹽廢水中的COD，具有耐鹽能力強，處理效果好等特點，不需要復配菌劑，極大地降低了耐鹽菌劑的生產成本。
本發明提供一種施氏假單胞菌FSTB-5，其分類命名為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri），已於2015年6月1日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為CGMCCNo.10940。
本發明提供的施氏假單胞菌FSTB-5，主要形態特徵為：菌落顏色為淺薑黃色，菌株個體為杆狀。生理生化特徵表現為：革蘭氏陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性，具有硝酸鹽還原性能，可水解利用多種碳源。
本發明提供的施氏假單胞菌FSTB-5能夠耐受林可黴素、二甲胺四環素、利福黴素SV、醋竹桃黴素、萬古黴素、氨曲南及萘啶酸等中的一種或幾種。
本發明提供的施氏假單胞菌FSTB-5的16SrRNA基因序列見序列表。
本發明提供的施氏假單胞菌FSTB-5在含鹽廢水脫除COD中的應用。該菌株能夠應用於鹽含量1wt%-10wt%的含鹽廢水中COD的高效脫除，而且能夠在40℃高溫下生長。
本發明中，所述含鹽廢水可以是經過預處理的化工合成廢水、煤化工廢水，也可以是煉油工藝、煤化工工藝及化工合成工藝等產生的廢水經過反滲透減量化單元產生的濃鹽水。所述的含鹽廢水鹽含量為0.5wt%-10wt%，優選為1.0wt%-8.0wt%，COD（Cr法，下同）含量為200-20000mg/L。
本發明提供的施氏假單胞菌FSTB-5的培養方法，包括菌株活化、液體種子液培養、曝氣培養等三個階段，具體步驟為：
（1）菌株活化：將施氏假單胞菌FSTB-5接種到FSTB固體培養基的斜面或者平板中，25-40℃培養24-48小時，然後保存於4℃冰箱中。
（2）液體種子液培養：配製FSTB液體培養基，分裝於三角瓶中，滅菌並冷卻至室溫後，無菌環境下挑取斜面或平板中活化的菌株接種到三角瓶中，25-40℃培養24-72h。所述FSTB液體培養基為：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白腖10g/L，pH值範圍4.5-8.5，優選為5.0-8.0。FSTB固體培養基是在液體培養基中加入20g/L的瓊脂。
（3）曝氣培養：在設有曝氣裝置的密閉反應器中加入FSTB液體培養基，按照反應器體積比0.5%-25%的比例接種液體種子液，pH值控制在5.0-8.0，曝氣培養48-96小時，之後進行周期性的補料和排料操作，排料量佔反應器體積的5%-90%，補料量佔反應器體積的5%-90%，也可補加少量的碳源、氮源和微量元素物質，培養24-48小時為1個培養周期，之後按照上述比例排出對應體積的培養液，由此得到含有較高濃度施氏假單胞菌的濃菌液產品。
本發明中，培養結束後，採集培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。在封閉式培養環境下，施氏假單胞菌為純菌株，相似百分比達到95%以上。
本發明還提供一種脫COD的耐鹽菌劑，該菌劑中包括施氏假單胞菌FSTB-5。所述的耐鹽菌劑可以是只採用施氏假單胞菌FSTB-5菌液製得的耐鹽菌劑，也可以與其他耐鹽菌劑復配，如可以與現有的具有脫氮、除磷及降解難降解有機物的微生物菌劑結合，實現更好的廢水處理效果。
本發明提供的耐鹽施氏假單胞菌FSTB-5是一株在高含鹽水體中具有較好COD脫除性能的菌株，耐鹽能力強，處理效果好，可以直接用於含鹽廢水的處理，也可以投加到現有含鹽廢水處理系統中，提高廢水處理效果。本發明提供的施氏假單胞菌FSTB-5的培養方法，可直接利用汙水處理廠含鹽廢水（根據水質條件補加少量天然培養基和化學合成培養基）進行優勢菌株培養富集增濃工作，極大的維持耐鹽菌劑的生長特性和耐受特性，並降低耐鹽菌劑的培養成本。
生物材料保藏說明
本發明提供的施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5菌株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏編號：CGMCC No.10940；保藏日期：2015年6月1日。
具體實施方式
本發明的施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5是2014年6月從取自湖南省嶽陽市某石化企業用於處理環氧氯丙烷生產廢水的活性汙泥中分離篩選得到的，其生理生化試驗結果見表1。
表1施氏假單胞菌FSTB-5的生理生化試驗結果
經「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」鑑定，該菌株屬於施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri），命名為FSTB-5。
實施例2篩選和分離純化
採用逐漸提高培養液中鹽濃度的方法對取自湖南省嶽陽市某石化企業用於處理環氧氯丙烷生產廢水的活性汙泥進行馴化培養15天。
取上述馴化好的活性汙泥，採用稀釋塗布的方法在富集培養基中進行初步分離，由此得到15個生長狀態良好且性狀各異的菌落。所採用的富集培養基含有的主要成分為：COD為1000mg/L，鈣離子濃度為1000mg/L，全鹽量為10000mg/L，所採用的固體培養基中瓊脂含量為2.0%。
然後採用平板劃線的方法對得到的菌落進行轉接，劃線轉接到篩選培養基中，進行進一步的分離和篩選。採用的篩選培養基含有的主要成分為：CODCr為1000mg/L，鈣離子濃度為4000mg/L，全鹽量為25000mg/L，所採用的固體培養基中瓊脂含量為2.0%。
由上述操作得到10株純菌株，其中一株即為施氏假單胞菌FSTB-5。
實施例3施氏假單胞菌FSTB-5耐鹽能力的考察
本發明所述的施氏假單胞菌FSTB-5的培養方法包括：菌株活化、液體種子液培養、曝氣培養，具體過程如下：
（1）菌株活化：將施氏假單胞菌FSTB-5接種到含有FSTB固體培養基的平板中，35℃環境下培養48小時，然後保存於4℃冰箱中待用。所述FSTB固體培養基為：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白腖10g/L，瓊脂20g/L，pH值7.8。
（2）液體種子液培養：配製FSTB液體培養基，分裝於三角瓶中，滅菌並冷卻至室溫後，無菌環境下用接種環挑取斜面中活化後的菌株接種到三角瓶中，35℃條件下培養48小時。所述FSTB液體培養基為：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白腖10g/L，pH值7.8。
（3）曝氣培養：採用密閉的反應器進行培養，所採用反應器及各種器具均需要滅菌完全，進氣和排氣位置需安裝細菌過濾裝置，培養液、酸鹼調節劑及微量元素溶液均需要滅菌後按照無菌操作規程投加，反應器需配備曝氣裝置，並可進行進水、調酸、調鹼、補料和排水排料操作，在該器具中放入滅菌後的FSTB液體培養基，按照反應器體積百分比10%的比例接種液體種子液，開啟培養過程後，培養過程中採用酸鹼自動控制系統將培養液pH值範圍控制在5.0-8.0，曝氣培養72小時之後進行周期性的補料和排料操作，排料為反應器體積百分比25%的培養液，補料為反應器體積百分比25%的FSTB液體培養基，也可同時補加少量的碳源、氮源和微量元素物質，培養24小時為1個培養周期，之後按照上述比例排出對應體積的培養液，由此得到含有純施氏假單胞菌的濃菌液產品。
採集上述培養完畢的濃菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比，相似百分比達到95%以上，即認定該施氏假單胞菌為純菌株。
採用上述培養得到的施氏假單胞菌FSTB-5處理含鹽廢水。本實施例以經過預處理的環氧氯丙烷生產工藝廢水為例，所處理含鹽廢水的水質為：COD濃度範圍為800-2000mg/L，鹽含量為2wt%-10wt%，處理溫度30-40℃。處理效果如表2所示。
表2施氏假單胞菌FSTB-5處理含鹽廢水的效果
由表2可知，施氏假單胞菌FSTB-5能夠耐受的鹽含量為2wt%-10wt%，能夠在40℃高溫下生長，可以高效脫除廢水中的COD。
本發明所述施氏假單胞菌FSTB-5對實際含鹽廢水的適應性和處理效果非常好，具有較強的COD降解功能，可直接採用該菌株的純培養處理含鹽廢水，也可單獨放大培養後作為外源功能微生物投加到現有工藝流程，有針對性地對實際工藝狀況進行優化調節，解決高鹽環境下活性汙泥處理效果差且易退化的問題。採用耐鹽菌處理高含鹽廢水比物理化學法成本低，直接應用會產生較為明顯的經濟效益和社會效益，可為高含鹽相關廢水處理達標排放提供技術支撐。
SEQUENCE LISTING
中國石油化工股份有限公司
中國石油化工股份有限公司大連石油化工研究院
一種施氏假單胞菌及其培養應用
新申請
PatentIn version 3.5
1320
DNA
Pseudomonas stutzeri
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