兩親性mPEG修飾的石膽酸的製作方法

2023-09-22 10:05:40

本發明涉及高分子材料技術領域或是藥物製劑領域，特別涉及一種mPEG修飾的石膽酸和製備方法以及作為藥物載體的應用。

背景技術：

當代藥物學研究表明，藥物發揮其療效，除了與藥物本身的化學性質、分子結構緊密相關外，還與藥物的物理狀態如粒徑大小、表面電荷等相關。聚合物的親水和親油片段在水溶液中通過分子自組裝原理可以形成納米膠束。其表面親水、內部親油，因此難溶性藥物通過這種膠束在傳送與控釋領域具有很多的優點：提高難溶性藥物在溶液中的溶解度、減少易降解藥物在達到作用靶點的過程中發生降解、提高藥物的生物利用度、延長體內循環時間、增強對細胞膜的粘附能力，同時還可以通過對膠束表面進行化學修飾，使其靶向進入疾病細胞減少藥物在使用時對正常組織的副作用。其中聚乙二醇(PEG)是最廣泛的表面修飾材料。

聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)系列產品包括單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，無毒、無刺激性，並與許多有機物組份有良好的相溶性。其優異的生物相容性，在體內能溶於組織液中，分子量4000以下的PEG能被機體迅速排除體外而不產生任何毒副作用，其安全性已經得到了美國FDA的認證。

石膽酸(Lithocholic acid，LCA)是膽汁酸之一，不溶於水，它不是由膽甾醇在肝中直接生物合成的，而是由鵝脫氧膽酸在腸內通過細菌代謝產生的物質，石膽酸(LCA)具有剛性分子結構，作為膽甾衍生物存在於哺乳動物膽汁中，具有一定的抗癌作用。

鬼臼毒素(Podophyllotoxin)是一種天然存在的木脂素類化合物，具有抑制細胞微管蛋白聚合破壞微管形成的特性，產生顯著的抗癌和抗病毒活性。但是它難溶於水且毒副作用大，影響臨床應用。其它抗癌藥如紫衫醇、多西紫杉醇和喜樹鹼也有類似的問題。

本發明提供並公開兩親性mPEG修飾的石膽酸，它是在石膽酸上接親水性的mPEG鏈，改善石膽酸的親水性，成為一種兩親性聚合物膠束納米材料，易包裹難溶性藥物，提高難溶性藥物水溶性，便於製劑製備和使用，同時膠束納米粒外殼mPEG鏈有利於減少體內巨噬細胞吞噬，延長體內循環時間，再者納米粒能提高藥物腫瘤靶向性，增加藥物療效，減少藥物毒副作用，另外石膽酸本身具有一定抗腫瘤活性，是一種潛在的抗腫瘤藥物，且無毒、生物相容性好。

技術實現要素：

本發明描述並要求一種兩親性mPEG修飾的石膽酸、製備方法和其作為藥物膠束載體材料的應用。它是一種安全性好，生物可降解、臨界膠束濃度低的兩親性聚合物，可在水中自組裝形成聚合物膠束，作為納米藥物傳遞系統，同時材料本身具有抑制腫瘤生長的作用。

本發明的目的在於提供一種兩親性mPEG修飾的石膽酸及其製備方法。

本發明的目的在於提供一種兩親性mPEG修飾的石膽酸作為藥物載體在藥物製劑學領域的應用。

本發明涉及的mPEG修飾的石膽酸，是指在石膽酸上羧基上接親水鏈mPEG，改善其兩親性，可在水中自組裝形成聚合物膠束。

本發明的目的在於提供一種兩親性mPEG修飾的石膽酸，其中單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分子量為300～10000。

本發明所述的兩親性mPEG修飾的石膽酸，其製備過程如下：

mPEG溶於無水二氯甲烷，加入氧化銀、碘化鉀、對甲苯磺醯氯(TsCl)，室溫下磁力攪拌2～4h，反應液經硅藻土過濾，過量二氯甲烷洗滌，旋轉蒸發除掉溶劑即得到mPEG-OTs粗品；將上述合成的mPEG-OTs溶於濃氨水，加入氯化銨，40℃恆溫油浴磁力攪拌3d，反應液用二氯甲烷萃取，收集有機層，有機層用無水硫酸鎂脫水，旋轉蒸發濃縮後，滴加過量冰乙醚，沉澱，過濾，收集沉澱，真空乾燥12h，得mPEG-NH2；

稱取石膽酸(LCA)，置於含有二氯甲烷的三口圓底燒瓶中，攪拌下滴加N，N』-二甲基甲醯胺(DMF)，至石膽酸全部溶解，置於冰浴中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)，攪拌兩小時後，緩慢加入溶於二氯甲烷中的mPEG-NH2，在室溫下攪拌24h，反應液用飽和食鹽水稀釋，分層後，收集有機層，水層用二氯甲烷萃取(5×100ml)，收集合併有機層，用無水硫酸鎂乾燥脫水，旋轉蒸發濃縮後，滴加過量冰乙醚，沉澱，過濾，收集沉澱，真空乾燥12h，得mPEG-LCA。

本發明的目的還在於提供一種載藥聚合物膠束納米粒，其特徵在於用本發明所述的兩親性mPEG修飾的石膽酸，包載難溶性藥物，製成載藥聚合物膠束納米粒，其製備方法包括以下過程：將mPEG修飾的石膽酸溶於雙蒸水中，自組裝形成濃度1～4mg/ml的空白膠束溶液，將難溶性藥物溶於有機溶劑後，逐滴加入到上述的空白膠束溶液中，經超聲處理後，置於雙蒸水中透析除去有機溶劑，透析液經離心，過濾後，必要時凍幹，製得150～300nm的聚合物載藥膠束。

本發明所述的mPEG修飾的石膽酸，具有膠束臨界膠束濃度低，生物相容性好，延長體循環時間，靶向到癌細胞能力強等特點。

本發明所述的mPEG修飾的石膽酸，具有易形成載藥聚合物納米粒，製備納米粒工藝簡便，納米粒膠束穩定性好，載藥量高等特點。

附圖說明

圖1：mPEG-LCA的1H-NMR圖

圖2：mPEG-LCA的螢光發射光譜I1/I3與聚合物對數濃度關係圖

圖3：PPT溶液和PPT-mPEG-LCA NPs的體外釋放曲線

圖4：PPT溶液、PPT-mPEG-LCANPs和mPEG-LCA NPs對細胞抑制作用圖

具體實施方式

下面將結合實施例來進一步說明本發明所涉及的兩親性mPEG修飾的石膽酸、製備方法以及載藥應用。但是，下述實施例不應當被看作是以任意方式限制本發明。

實施例1mPEG-OTs的製備

稱取乾燥處理後的mPEG(1900Da，4g)於50mL圓底燒瓶中，加入30mL無水二氯甲烷溶解。分別加入氧化銀(Ag2O，0.92g)、碘化鉀(KI，0.66g)、對甲苯磺醯氯(TsCl，0.76g)，室溫下磁力攪拌2～4h，反應液經硅藻土過濾，30℃減壓旋轉蒸發濃縮，滴加冰乙醚，混勻，冰箱中沉澱十分鐘後，過濾沉澱，真空乾燥12h，得mPEG-Ots(3.96g)。

實施例2mPEG-NH2製備

將實施例1合成的mPEG-OTs溶於50mL濃氨水，加入氯化銨(NH4Cl，1.35g)，40℃恆溫油浴磁力攪拌3d。反應液用二氯甲烷萃取，收集有機層，有機層用無水硫酸鎂脫水，旋轉蒸發濃縮後，滴加過量冰乙醚，冰箱中沉澱十分鐘後，過濾，收集沉澱，真空乾燥12h，得mPEG-NH2(3.32g)。

實施例3mPEG-LCA製備方法：

稱取石膽酸(112.95mg，0.3mmol)，置於含有12ml二氯甲烷的三口圓底燒瓶中，滴加DMF，至石膽酸(LCA)全部溶解，置於冰浴中攪拌，加入EDAC(172.53mg，0.9mmol)，攪拌兩小時後，緩慢加入溶於3ml二氯甲烷mPEG-NH2(380mg，0.2mmol)，在室溫下攪拌24h，反應液用36ml的飽和食鹽水稀釋，分層後，收集有機層，水層用二氯甲烷萃取(5×100ml)。收集合併有機層，用無水硫酸鎂乾燥脫水，旋轉蒸發濃縮後，滴加過量冰乙醚，沉澱，過濾，收集沉澱，真空乾燥12h，得mPEG-LCA(306.1mg)，經1H-NMR(如圖1)確認。

實施例4mPEG-LCA的臨界膠束濃度的測定

精密稱取1.011mg的芘，置於10ml容量瓶中，用丙酮稀釋，至刻度線，定溶，配製濃度為5.0×10-6mol·L-1。取9個10mL的容量瓶，分別加入上述配置好的芘溶液1mL，氮氣吹乾。另精密稱取10mg聚合物，置於10ml容量瓶中，用水稀釋，至刻度線，定溶，配製濃度為1mg/ml的聚合物溶液。然後在上述容量瓶中，分別加0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5和5ml的聚合物溶液，用水稀釋至刻度線，定容。配製成濃度為0.001，0.0025，0.05，0.01，0.025，0.05，0.1，0.25和0.5mg/ml的含有芘的聚合物溶液。混合超聲30min，40℃水浴1h，靜止過夜。用螢光光譜儀Shimadzu RF5301測定螢光強度，芘的發射光譜為390nm，激發波長為374和386nm，狹縫寬度為10.0nm。

採用374和386nm處的螢光強度比值(I1/I3)比值與lgC(mg/ml)作曲線，處理數據，繪製圖表。通過切線法由緩慢增大的直線段和突躍直線段的交點所對應的聚合物濃度即為該聚合物材料的臨界膠束濃度(CMC)的值。

芘螢光激發譜中I374/I386隨mPEG-LCA質量濃度對數值的變化，拐點處(見圖2)表明聚合物在此濃度時恰好形成膠束，為3.8×10-2mg·mL-1。由此表明mPEG-LCA膠束的臨界膠束濃度較小，以此製備的載藥膠束具有較好的稀釋穩定性。

實施例5空白mPEG-LCA納米粒(mPEG-LCA NPs)的製備

將mPEG修飾的石膽酸溶於雙蒸水中，經超聲自組裝形成濃度1～4mg/ml的mPEG-LCA NPs溶液。

實施例6載鬼臼毒素(PPT)mPEG-LCA納米粒的製備

稱取10mg的mPEG-LCA溶於雙蒸水中製得2mg/ml的空白膠束溶液，磁力攪拌4h，將16mg的鬼臼毒素(PPT)溶於200μL甲醇中，逐滴加入到上述空白膠束溶液中，冰浴超聲30min(超聲功率95w，工作3s，間歇3s)，置於雙蒸水中透析除去甲醇，透析液經離心，過濾後，製得粒徑為10～300nm的載藥mPEG-LCA膠束納米粒(PPT-mPEG-LCA NPs)溶液。PPT-mPEG-LCA NPs的一些性質(見表1)。

表1.PPT-mPEG-LCA NPs的一些性質。

結果顯示，mPEG修飾的石膽酸可以在水中自發形成膠束，製備的納米粒粒徑小，載藥量高。可以增加鬼臼毒素(PPT)的溶解度，另外PEG鏈修飾可以延長體循環時間，有利於納米聚合物膠束髮揮更好的靶向作用。

實施例9載藥聚合物膠束納米粒體外釋放研究

體外釋放實驗操作

精密稱取4ml載藥納米粒溶液及4ml PPT溶液，平行三批，裝入3500Da透析袋中，置於40mlpH7.4的PBS的釋放介質中，37±0.5℃的恆溫搖床中，100rpm振蕩，分別於0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，36h，48h，72h，96h取出1ml溶液，過0.45μm微孔濾膜，補液1ml，取20μl濾液進高效液相測定濃度，以累計釋放百分率為縱坐標，時間為橫坐標繪製釋放曲線。處理數據，繪製圖表(見圖3)。

計算，測定各個時間樣品藥物濃度後Cn(μg/ml)，按公式求的校正濃度C，計算累計釋放百分率Q(t)，w為納米膠束中的PPT含量。

Q(t)％＝C(μg/ml)*40/W(μg)*100％

結果顯示，PPT-mPEG-LCA NPs在24h內釋放低於60％，PPT在24h內釋放接近90％，表明納米粒具有很好的緩釋作用。

實施例10體外細胞毒性研究

納米製劑組：PPT-mPEG-LCA NPs，培養液稀釋至濃度為0.39μg/mL～50μg/mL。

原料藥組：鬼臼毒素溶液(PPT)，培養液稀釋至濃度為0.39μg/mL～50μg/mL。

空白納米粒組：mPEG-LCA NPs，培養液稀釋至上述相同濃度。

取處於指數生長期狀態良好的人肺癌細胞(A549)，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，計數製成細胞懸液；分別以6×103～1×104個/孔的密度接種於96孔培養板中，置CO2培養箱中培養24h：按上述實驗方案分別給予所需濃度的納米製劑組、原料藥組、空白納米粒溶液，每一濃度平行6孔，繼續培養。48h後，向每孔加入10μL MTT液，放入細胞培養箱孵育4h後，向每孔加入150μL DMSO，使用酶標儀檢測490nm處吸光度。處理數據，繪製圖表(見圖4)，計算半數抑制濃度IC50值(見表2)

表2.體外對腫瘤細胞增殖的抑制作用(IC50值)

結果顯示，空白納米粒組對於A549細胞的生長具有一定的抑制作用。PPT-mPEG-LCA NPs製劑組的IC50小於PPT原料藥，說明載藥PPT-mPEG-LCA NPs能使鬼臼毒素對A549毒性明顯增強，提高抗腫瘤活性。

以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但只是作為範例，本發明並不限制於以上描述的具體實施例。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的範圍內。