密碼子優化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗的製作方法

2023-09-22 04:01:10

專利名稱：密碼子優化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，涉及密碼子優化的Hiv-lgpl20基因共有序列及 gp 120核酸疫苗。
背景技術：
A^^&^f-^'MM (human immunodeficiency virus,HIV)(envelop,Env) 病毒，每個病毒包膜的表面鑲嵌由糖蛋白gpl20和gp41形成的三聚體刺突。根據Env不同， HIV-I分為M，N和0三群。M群在全世界流行最廣，根據全基因組被繼續分9種亞型(A、B、 C、D、F、G、H、J、K)，並呈現出地理上的區域分布特徵。其中B亞型是最主要的流行亞型(主 要發現於北美和歐洲)，A、D亞型主要流行於非洲，C亞型則分布於非洲和亞洲，這些亞型形 成了代表HIV-IM群的系統進化樹上的不同分化枝。我國的優勢亞型(95%以上)為ThB亞 型、B/C重組亞型和A/E重組亞型。ThB亞型主要流行區是河南和河北，A/E和B/C重組體 主要流行區是廣西和雲南及新疆，B/C重組體也流行於四川省。在同一亞型/重組體內，不 同的病毒株的Env，尤其是gpl20，仍然呈現高度變異性。Gpl20的高度變異以及由此導致的 中和抗體免疫逃逸是HIV疫苗研製的重大挑戰。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的上述不足，提供中國HIV-I流行病毒株包膜蛋 白gpl20共有胺基酸序列。本發明的另一目的是提供經密碼子優化的的編碼中國HIV-I流行病毒株包膜蛋 白gpl20共有胺基酸序列的基因序列。本發明的又一目的是提供一種包含上述密碼子優化的gpl20基因序列的核酸疫
田ο我們從Genebank上收集了中國的HIV-1包膜蛋白gpl20的胺基酸序列。應用ThB 亞型、B/C重組亞型或者A/E重組亞型中不同病毒株的gpl20進行多序列比對，獲得針對每 一個亞型的共有胺基酸序列。本發明的技術方案是中國HIV-I流行病毒株(A/E重組亞型、B/C重組亞型和ThB亞型)包膜蛋白gpl20 共有胺基酸序列，序列為SEQ ID NO. 1,SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3。其中SEQ ID NO. 1為 HIV-I病毒株A/E重組亞型包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列，SEQ ID N0. 2為HIV-I病毒株 B/C重組亞型包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列，SEQ ID N0. 3為HIV-I病毒株ThB亞型包膜 蛋白gpl20共有胺基酸序列。經密碼子優化的編碼中國HIV-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基 因序列，序列為SEQ ID N0. 4,SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6。其中SEQ ID NO. 4為經密碼子 優化的編碼中國HIV-I病毒株A/E重組亞型包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基因序列， SEQ ID N0. 5為經密碼子優化的編碼中國HIV-I病毒株B/C重組亞型包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基因序列，SEQ ID NO. 6為經密碼子優化的編碼中國HIV-I病毒株ThB亞型 包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基因序列。Hiv-lgpl20核酸疫苗，該疫苗含有經密碼子優化的編碼中國HIV-1流行病毒株包 膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基因序列和真核表達載體。所述的經密碼子優化的編碼中國Hiv-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有胺基酸序 列的基因序列為在SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6的5，端和3，端分別插入限 制性內切酶NheI和BamHI粘性末端的基因序列。所述的真核表達載體為經內切酶NheI和BamHI切割pJW4303得到的載體片段。本發明提供的基於中國HIV-I流行病毒株(A/E重組亞型、B/C重組亞型和ThB亞 型)包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列核酸疫苗的構建包括如下步驟(1)中國HIV-I流行病毒株(A/E重組亞型、B/C重組亞型和ThB亞型)包膜蛋白 gpl20共有胺基酸序列分析與獲得我們從Genebank上收集了中國的HIV-I包膜蛋白gpl20的胺基酸序列。應用ThB 亞型、B/C重組亞型或者A/E重組亞型中不同病毒株的gpl20進行多序列比對，獲得針對每 一個亞型的共有胺基酸序列。(2)密碼子優化的編碼中國HIV-I流行病毒株(A/E重組亞型、B/C重組亞型和ThB 亞型)包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基因序列的設計和合成應用基因軟體MacVector 7. 2分析中國HIV-1流行病毒株(A/E重組亞型、B/C重 組亞型和ThB亞型)包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列，推導相應的編碼基因序列。由於野生 型gpl20共有胺基酸編碼序列不符合哺乳動物和大腸桿菌密碼子使用偏好，發明人通過篩 選，設計出密碼子優化的gpl20共有胺基酸序列的基因序列，並經過基因公司的化學合成 得到了密碼子優化的gpl20共有胺基酸序列的基因序列。密碼子優化後gpl20基因中哺乳 動物細胞偏愛的密碼子頻率及大腸桿菌細胞偏愛的密碼子頻率高於野生型gpl20基因(見 圖2)。此密碼子優化的序列所編碼的蛋白質胺基酸序列與原始的胺基酸序列保持一致。(3)疫苗構建將步驟⑵得到的基因片段克隆到真核表達載體PJW4303中，得到重組質粒 pJW4303/gpl20. AE. cons,pJW4303/gpl20. BC. cons 和 pJW4303/gpl20. ThB. cons。經對重組 質粒的純化、酶切和測序鑑定後，確定得到了編碼共有胺基酸序列的gpl20核酸疫苗。本發明的有益效果 1、中國HIV-I流行病毒株包膜蛋白gp 120共有胺基酸序列，與原始序列比較，降低 了 gpl20的變異。用抗原的共識序列可減少其與野生型基因免疫原之間的遺傳距離，並能 誘導機體產生較廣譜的中和抗體和細胞免疫反應。2、經密碼子優化的編碼中國HIV-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列 的基因序列選用了哺乳動物細胞和大腸桿菌密碼子使用偏好的密碼子，可以高效的在真核 (哺乳動物細胞)和原核(大腸桿菌)表達。雖然由基因的核苷酸序列可以準確的推斷出其編碼的胺基酸序列，但根據蛋白質 的胺基酸序列而推斷的核苷酸序列並不唯一，正是由於絕大多數密碼子的兼併性(絕大多 數胺基酸均對應於二個以上的密碼子，例如與亮氨酸、絲氨酸對應的密碼子分別有6個)， 因此編碼某一小肽的核苷酸序列可以有成千上萬種。越來越多的研究結果表明，特定的蛋白多肽在細胞內的表達水平通常不是取決於其胺基酸序列，而是取決於相對應的核酸編碼 序列在宿主細胞內的複製、轉錄、翻譯效率及其在宿主細胞內的穩定性等因素。因此，不同 的核酸編碼序列(雖然它們編碼的胺基酸序列相同)在各種宿主細胞中的表達效率往往存 在顯著差異。通過對野生型gpl20的基因序列分析，發明人認為由於自然界生物體存在密碼子 的偏好性，從病原體來源的gpl20基因克隆在異源宿主體內難以高效表達，因此就不能有 效的刺激宿主的免疫系統，使之產生較好的免疫保護作用。為了提高異源基因在哺乳動物 和大腸桿菌中的表達效率，往往需要對核苷酸編碼序列進行優化。由於目前對核苷酸序列 的優化尚沒有統一的標準或原則，因此針對胺基酸序列，不同的研究人員完全會設計出不 同的核苷酸序列用於目標多肽的表達和製造，相應地表達效率也可能存在差異。根據我們 優化的核苷酸編碼序列，克服了上述缺陷，提高了 gpl20蛋白表達水平，以及由該基因構建 的核酸疫苗的免疫原性。3、應用真核表達載體PJW4303製備的經密碼子優化的中國HIV_lgpl20共有序列 核酸疫苗能顯著有效的刺激宿主的免疫系統，使之產生良好的免疫應答。


圖1對基因庫中已知的中國HIV-1AE、BC和ThB亞型的gpl20胺基酸序列進行分 析。A :HIV-1A/E重組亞型gpl20共識序列與從HIV-I感染者分離的HIV-1A/E重組亞 型的胺基酸序列進化樹的分析。圈中所示為本研究設計的HIV-1A/E重組亞型gpl20共識 序列；B :HIV-1B/C重組亞型gpl20共識序列與從HIV-1感染者分離的HIV-1B/C重組亞 型的胺基酸序列進化樹的分析。圈中所示為本研究設計的HIV-1B/C重組亞型gpl20共識 序列。C =HIV-IThB亞型gpl20共識序列與從HIV-1感染者分離的HIV-IThB亞型的氨基 酸序列進化樹的分析。圈中所示為本研究設計的HIV-IThB亞型gpl20共識序列。圖2野生型與密碼子優化的gpl20基因中哺乳動物細胞偏愛密碼子頻率的比較 指數> 1為哺乳動物細胞所偏好，縱坐標表示偏好指數，橫坐標表示核苷酸序列位置。左圖 為野生型gpl20基因，右圖為密碼子優化的gpl20基因。圖3密碼子優化的核酸疫苗的鑑定應用BamHI和NheI酶切質粒；1 :AE. gpl20 ； 2 :AE. gpl20 經 BamHI+Nhel 雙酶切；3 :BC. gpl20 ；4 :BC. gpl20 經 BamHI+Nhel 雙酶切；5 ThB. gpl20 ；6 :ThB. gpl20 經 BamHI+Nhel 雙酶切。圖4轉染293T細胞內gpl20蛋白表達的Western blot分析結果。圖5應用ELISA檢測紐西蘭白兔血清gpl20抗體應答時間曲線，箭頭表示免疫時 間點，各點所用的兔血清稀釋度為1 1000。圖6應用Western-blot檢測紐西蘭白兔血清gpl20抗體應答。圖7檢測假型病毒SF162的TCID50，TCID50/ml是28000，說明假型病毒製備成功。圖8應用兔免疫血清中和來自B亞型的假型病毒株SF162的中和試驗結果。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明。實施例1.中國HIV-1AE、BC和ThB亞型的gpl20胺基酸序列分析對基因庫中已知的中國HIV-1AE、BC和ThB亞型的gpl20胺基酸序列進行分析。 根據序列排列的結果和遺傳進化樹的分析結果(圖1)，設計了中國HIV-1AE、BC和ThB亞 型的gpl20胺基酸共識序列。實施例2.編碼共有胺基酸序列的密碼子的設計和合成首先用基因軟體MacVector 7. 2分析編碼中國HIV-1流行病毒株(A/E重組亞型、 B/C重組亞型和ThB亞型)包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基因序列，找出其密碼子使用 偏好以及原始序列中密碼子使用偏好與哺乳動物密碼子使用偏好和與大腸桿菌密碼子使 用偏好不同的密碼子位點。對於其中哺乳動物和大腸桿菌密碼子使用偏好相同的胺基酸， 用哺乳動物和大腸桿菌都偏好的密碼子替代原始序列中編碼該胺基酸的密碼子，分別設計 了密碼子優化的編碼AE、BC及ThB亞型gpl20蛋白的基因序列，序列分別為SEQ ID NO. 4、 SEQ IDN0. 5及SEQ ID NO. 6。密碼子優化後gpl20基因DNA序列有所變化，但gpl20蛋白 胺基酸序列不變。密碼子優化後gpl20基因由人工化學合成(Geneart公司，德國)，構建成 重組質粒pGA4/AE. gpl20、pGA4/BC. gpl20和pGA4/ThB. gpl20。經測序證實合成的序列正 確。實施例3. gpl20DNA疫苗構建將質粒pJW4303 和 pGA4/AE. gpl20 (或者 pGA4/BC. gpl20,或者 pGA4/ThB. gpl20) 用Nhe I和BamH I分別進行雙酶切。酶切反應體系為10XBuffer TangoTM 4μ L, 10父85六4「1^，質粒2(^1^他61 1 μ L，BamHI 1口1^，補水至401^。酶切產物經7g/L的瓊脂 糖凝膠電泳後，用凝膠回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0，大連寶 生物公司)分別回收純化約HOObp的目的片段和線性化的PJW4303。將電泳後瓊脂糖凝膠置於紫外檢測儀下，切下含目的DNA的凝膠，分析天平稱膠 塊的質量，按Img = 1 μ L計算膠塊的體積。加入3倍體積的DR-I Buffer,置於75°C水浴 中加熱融化膠塊，每隔2min混勻一次，直至膠塊完全融化，加入DR-I Buffer 1/2體積的 DR-II Buffer，充分混勻溶液。將離心吸附柱安置在收集管上，轉移混合溶液至吸附柱中， 靜置 2min，3600rpm，離心 lmin。棄濾液，加入 500 μ L Rinse A 液，3600rpm，離心 30s。棄濾 液，加入700 μ L Rinse B液，3600rpm，離心30s，重複洗滌一次。空柱12000rpm，離心lmin, 將吸附柱安置在Ep管上，讓乙醇完全揮發乾淨。在吸附膜的中央，加入25 μ L洗脫緩衝液， 靜置60s。12000rpm，離心lmin，此時Ep管中的洗脫液即為目的DNA溶液。測定DNA溶液 的濃度，用10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析割膠純化效果，洗脫液保存在-20°C冰箱中備用。用T4DNA連接酶將約1400bp的目的片段和線性化的pJW4303連接，構建pJW4303/ gpl20重組表達質粒。即為本文結果中提及的gpl20DNA疫苗AE. gpl20、BC. gpl20和ThB. gpl20。連接反應體系為10XT4 DNA Ligase Buffer 1 μ L，線性化的 pJW43031 μ L，純化 目的片段7yL，T4DNALigase 1 μ L，混勻，16°C放置16h。連接物轉化HBlOl感受態細胞。實施例4編碼共有胺基酸序列的核酸疫苗的鑑定4. 1 gpl20DNA 疫苗 AE. gpl20、BC. gpl20 和 ThB. gpl20 轉化 HB101 感受態細胞1)將10 μ L連接物加入到裝有100 μ L ΗΒ101感受態細胞的Ep管中，輕輕拍動管壁數次，充分混勻，冰浴30min。2)將Ep管置於42°C水浴中90s，立即轉至冰浴，靜置2min。3)向Ep管中緩慢加入LB培養基0. 5mL, 37°C，80rpm振搖，培養45min。4)將菌液塗布在含氨苄黴素(0. lg/L)的LB平板上，37°C，培養過夜。4. 2篩選陽性克隆隨機挑取5個單菌落，分別接種於5隻培養試管(含0. lg/L氨苄黴素的LB培養 基)中，37°C，250rpm振搖，培養過夜。4. 3小量提取gpl20的重組DNA疫苗質粒(質粒小量提取試劑盒QIAGEN Plasmid Mini Kit (50)，Qiagen 公司)1)將4. 2中搖過夜的細菌在無菌超淨臺中緩慢吸到1. 5ml離心管中，培養試管中 剩下少量均液保存於4°C。2)離心管中菌液，常溫下6000g，離心lOmin，棄上清，收集細菌。3)加入250 μ 1重懸緩衝液於細菌沉澱，反覆振搖，直至看不到細菌團塊，細菌全 部重懸於溶液中。4)加入250 μ 1裂解緩衝液到上述菌體重懸液體中，溫和顛倒5-6次，溶液呈均勻 藍色，靜置5min。5)加入350 μ 1平衡緩衝液於⑷中得到的液體中，溫和顛倒5-6次，藍色溶液消 失，溶液分層，上層為結實的乳白色團塊，下層為清亮液體，室溫靜置2min。6) 12000g，離心lOmin，吸取上清，轉移至另一離心管。該條件下離心lOmin。7)將上清液加入到離心吸附柱中，12000g，離心lmin，棄濾液。8)吸附柱再12000g，離心lmin，棄去濾過液體。9)向離心吸附柱中加入洗滌緩衝液25 μ 1，12000g，離心lmin，收集濾液。10)再將步驟9重複操作1次。11)兩次收集的液體中即含有質粒。4. 4小量提取gpl20的重組DNA疫苗質粒進行酶切鑑定質粒用Nhe I和BamH I進行雙酶切，雙酶切總反應體系(10 μ L) =IOXBuffer Tango l μ L, IOXBSA 1 μ L，質粒(0. 22mg/mL) 2 μ L，Nhe I O. 25 μ L，BamH I 0. 25yL，補水 至10 μ L。37°C孵育lh，加入1 μ L 10 X Loading buffer終止酶切反應，10g/L瓊脂糖凝膠 電泳觀察結果(圖3)，酶切正確細菌劃三次平板，保存兩個單克隆細菌。實施例5.核酸疫苗的大量製備(質粒大提試劑盒為QIAGEN Plasmid Mega Kit (5) ,Qiagen 公司)1)吸取鑑定正確的細菌保存液5μ L接種於5ml含氨苄青黴素的LB培養液中， 37°C，200rpm，過夜生長。2)按1 500將1)中培養菌液接種於1000ml含氨苄青黴素的LB培養液中，37°C， 200rpm，過夜生長。3)第二天將細菌移到250ml離心瓶中，4°C、6000g離心15min，棄上清，收集細菌。4) 50ml緩衝液Pl重懸細菌沉澱，反覆振搖，直至看不到細菌團塊，細菌全部重懸 於溶液中。5) 50ml緩衝液P2加入重懸液體於離心瓶，溫和顛倒5_6次，溶液呈均勻藍色，靜置5min。6) 50ml緩衝液P3加入上述混合液體中，溫和顛倒5_6次，藍色溶液消失，溶液分 層，上層為結實的乳白色團塊，下層為清亮液體，冰上放置30min。7) 4°C，20000g,離心30min，保留上清，轉移至另一離心瓶。該條件下再將上清液離 心 IOmin08)平衡緩衝液QBT35ml溼潤平衡提取柱。9)將(7)中得到的上清加入提取柱，自然過柱，棄去濾過液體。10)加入洗滌緩衝液QC200ml，自然過柱，棄去濾過液體。11)加入洗脫緩衝液QF35ml，自然過柱，收集濾過液體。12)向收集液體中加入24. 5ml異丙醇，4°C，15000g，離心30min，棄上清。13)用7ml 70%乙醇重懸離心管中沉澱，常溫15000g離心lOmin，棄去上清。14)將有沉澱的離心管於超淨臺自然晾乾，Iml生理鹽水溶解。15)紫外分光光度法(波長260nm 280nm)定量質粒含量。16)加入洗脫緩衝液QF35ml，再將柱子洗脫1次。17)為提高吸附柱的利用率，第二天用自配的溶液按1-15的步驟再進行1次質粒
大量提取。18)將兩次提取的質粒混合，進行限制性內切酶酶切鑑定。實施例6.細胞轉染293T細胞用含10%胎牛血清的含雙抗DMEM高糖培養基37°C ,5% CO2飽和溼度培 養箱內培養至對數生長期，用2. 5g/L胰酶消化後，以1. OX IO6個細胞(6mL)接種於60mm培 養皿中，待生長至80 %融合時開始轉染。依據PEI轉染方法進行細胞轉染，取PEI 50 μ L，加 入到930 μ L含雙抗DMEM高糖培養基中，另取8. O μ g重組質粒加入到上述培養液中，輕輕 混勻，室溫，孵育15min，然後將Iml PEI/DNA複合物加到培養瓶中並輕輕搖動使混合均勻， 同時以PJW4303空質粒轉染細胞作為陰性對照，IOh後可更換不含血清含雙抗的DMEM培養 液。繼續培養72h後進行Western blot分析。分析結果如圖4所示。圖中顯示gpl20的 重組DNA疫苗質粒轉染293T細胞後可在上清和裂解產物中檢出特異性蛋白的表達，其分子 量約為120kDa，陰性對照空載體PJW4303轉染293T細胞的上清和裂解產物中沒有特異性蛋 白存在。轉染細胞收穫吸取細胞上清液，2500rpm，室溫，離心lOmin，吸取上清_20°C凍 存。用PBS (濃度10mM，pH7. 2)將細胞從培養皿中洗脫，收集細胞懸液，2500rpm，室溫，離 心 lOmin，棄上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl Ph7. 6,150mM NaCl，1 % Triton，用前加入 2% IOOmM PMSF(苯甲基磺醯氟))，冰上孵育20min, 12000rpm，4°C，離心60min,收集上清 液，-20°C凍存。實施例7. gpl20核酸疫苗的免疫原性的研究方法在編碼共有胺基酸序列的核酸疫苗構建和表達成功後，通過對試驗動物家兔進行 核酸疫苗免疫，檢測核酸疫苗的免疫原性。用ELISA和Western blot等方法，檢測gpl20 抗原特異的抗體免疫應答。通過病毒中和試驗，測定該核酸疫苗誘導產生的抗體對HIV感 染的保護作用。由於免疫家兔可以產生大量的免疫血清，可以足夠進行抗體檢測的研究。因此，在
8本發明涉及免疫保護的研究中，將用家兔免疫作為動物模型。紐西蘭兔免疫，實驗設計見表1 表1 gpl20疫苗和空載體免疫家兔和分組 肌肉注射、活體基因導入方式免疫，保證針頭插入深度2mm，注射後立即於注射部 位用WJ-2002活體基因導入儀進行體內電轉染(技術參數電壓100V，脈衝次數正反各6 次，波寬60ms，頻率60Hz)，以兔子腿部肌肉發生抖動視為電轉染有效。於每次免疫前和末 次免疫後兩周採血及收集血清。用ELISA方法和Western-blot法檢測血清中gpl20特異 的抗體反應，評價gpl20核酸疫苗在家兔動物模型中誘導產生體液免疫的能力。實施例8.免疫應答檢測8. IELISA檢測血清中gpl20特異性抗體ConA(50y g/ml) 100 μ 1包被ELISA板，室溫孵育lh，PBST (磷酸鹽緩衝液加.05% Tween-20)洗5遍；用轉染DNA的293T細胞上清液100 μ 1 (1 10， lug/ml)包被ELISA 板，室溫孵育lh，PBST洗5遍；5%脫脂奶粉4度封閉過夜，PBST洗5遍；加適當稀釋的免 疫兔血清100 μ 1 37°C孵育lh，PBST洗5遍；生物素標記的羊抗兔IgG(l 2000)，37°C孵 育 lh, PBST 洗 5 遍；HRP 標記鏈親和素(1 8000)，37°C孵育 lh, TMB 顯色 3. 5min ；2mol/ LH2SO4 50ul終止顯色。450nm處讀取吸光度(A)值。應用ELISA檢測紐西蘭白兔血清gpl20抗體應答時間曲線如圖5所示。圖5中顯 示gpl20核酸疫苗和空載體PJW4303分別免疫3隻紐西蘭兔，於0，2，4，8周免疫，免疫前和 免疫後2周收集血清。箭頭表示免疫時間點。由圖可知，gpl20疫苗在第2次免疫後兩周 即可檢測到gpl20特異性抗體，第4次免疫後兩周gpl20特異性抗體水平達到最高，表明 gpl20重組質粒疫苗可以有效的誘導免疫應答，且隨著多次免疫，免疫應答強度提高。8. 2ffestern blot檢測血清中特異性gpl20抗體1) gpl20核酸疫苗轉染293T細胞裂解及上清，pJW4303轉染293T細胞裂解及上清 20ul，加入5x上樣緩衝液5μ 1，100°C，煮沸IOmin。2)首先製備10%的分離膠(4ml蒸餾水，5ml 30%丙烯醯胺溶液，5. 7ml IMTris/ ClpH8. 8,150μ 1 10% SDS,150y 1 10%過硫酸氨，6μ1 TEMED)，灌膠，液面頂端加入水，室 溫下聚合20 30min。3)倒棄水，再製備5%的積層膠(4. Iml蒸餾水，Iml 30%丙烯醯胺溶液， 750ullMTris/Cl pH 6. 8,60μ 1 10% SDS,60y 1 10%過硫酸氨，6μ1 TEMED)，在積層膠上 插入梳齒，待膠完全凝聚後，拔下梳齒。
4)將上述處理好的樣品加入15%膠中進行電泳，20mA，lh，40mA，2h。5)膠上的蛋白轉到PVDF膜上，100v，2h。6)轉好的膜用5%脫脂奶粉封閉，37°C，lh。7)用IxPBST洗膜兩次。8)將膜浸在1 500稀釋的血清中，4°C，過夜。9)棄掉血清，用IxPBST洗膜6次，每次lOmin。10)棄掉洗液，加入1 10000稀釋HPR標記的羊抗兔IgG，37°C，lh。11)棄掉二抗，用IxPBST洗膜6次，每次lOmin。12)發光劑加到膜上，暗室顯影。應用Western-blot檢測紐西蘭白兔血清gpl20抗體應答，如圖6所示。由圖可知， gpl20重組疫苗質粒AE. gpl20或者BC. gpl20或者ThB. gpl20誘導的兔免疫血清可以交叉 識別gpl20重組疫苗質粒AE. gpl20或者BC. gpl20或者ThB. gpl20的轉染產物，表明雖然 AE. gpl20或者BC. gpl20或者ThB. gp 120雖然來自不同的進化分支，但是含有相同/相近的
抗原決定基。實施例9.病毒中和試驗實驗研究9.1假型病毒的構建1)第一天上午293T細胞傳代至細胞培養皿，3*106個細胞，6ml培養基。2)第二天上午觀察293T生長至50% 80%，進行轉染。3)取 7ug SF162-Env 和 14ug pSG3_dEnv 加到 1. 5mlEp 管中，加入 900ul 的 DMEM， 加入105ul的轉染試劑PEI，震蕩混勻，室溫靜置20min ；轉移至細胞培養皿；輕輕晃勻；細 胞培養箱培養4 6h後，棄去培養液，更換9ml新培養液，繼續培養48h。4)第四天上午吸取細胞培養上清，加入Iml FBS,0. 45um濾器過濾，4度保存；細 胞培養皿中加入9ml新培養液，繼續培養24h。5)第五天上午吸取細胞培養上清，加入Iml FBS，0.45um濾器過濾；與第4天的 濾液混勻，分裝，每Ep管1ml，凍存在-80度；TCID50待測。9.2TCID50 檢測1)取7支1.5ml的Ep管，編號1 7，每管加入480ul的培養基。2)在1號Ep管中加入120ul的假型病毒，振蕩器充分混勻。3)從1號Ep管中取120ul至2號Ep管，振蕩器充分混勻。4)依次至6號Ep管，振蕩器充分混勻，吸棄120ul。5)應用EDTA-胰酶消化溶解TZM-BL細胞，製備單細胞懸液，計數，調整細胞濃度至 lX105/ml。6)在1 7號Ep管中，每管加入480ul的TZM-BL單細胞懸液，振蕩器充分混勻。7)從1號Ep管吸取200ul加至IA ID ；從2號Ep管吸取200ul加至2A 2D ； 從7號Ep管吸取200ul加至7A 7D。8)將96孔細胞培養板置於細胞培養箱中。9)培養48h後取出培養板，輕輕甩幹，去掉培養基。10)每孔加入90ul不含血清的DMEM。11)每孔加入 90ul Bright-Glo Luciferase。
12)2min後用排槍吸取96孔中的液體至白板中。13)上機檢測，獲得包括cell control在內的每個樣品孔的RLU (Relative Light Unit)。14)以 cell control 對照的 RLU 的 2. 5 倍作為 cutoff，按照 SPEARMAN-KARBER 法 計算 TCID50。如圖7所示，表達SF162-Erw的HIV-1假型病毒的TCID50/ml是28000，說明假型 病毒製備成功。9. 2病毒中和試驗1)96孔細胞培養板，A3 AlO中加入67. 5ul培養基含10% FBS和P/S (青 黴素 100U/ml，鏈黴素 0. lmg/ml)的高糖 DMEM(Hyclone)添加 DEAE-dextran (40ug/ml)。2)A3 A4中加入7. 5ul來自AE. gpl20免疫的滅活兔血清，混勻；A5 A6中加入 7. 5ul來自BC. gpl20免疫的滅活兔血清，混勻；A7 A8中加入7. 5ul來自ThB. gpl20免疫 的滅活兔血清，混勻；A9 AlO中加入7. 5ul來陽性對照血清(UMASSserum)，混勻。3)在 B3 B10、C3 C10、D3 D10、F3 F10、G3 G10、H3 HlO 中加入 50ul 的培養基。4)從A3 AlO中吸取25ul至B3 B10，混勻，更換tip頭，依次至H3 H10，棄 去 25ul。5)在第1縱孔(1A 1H)中加入IOOul的培養基；在第2縱孔(2A 2H)中加入 50ul的培養基。6)稀釋假型病毒至4000TCID50/ml，在第2縱孔(2A 2H)至第10縱孔(10A 10H)中加入50ul的假型病毒稀釋液。7)置於細胞培養箱中孵育60min。8)製備TZM-BL單細胞懸液，調整至lX105/ml。9)孵育結束後，取出96孔細胞培養板，每孔加入IOOul的TZM-BL單細胞懸液。10)置於細胞培養箱中孵育48h。11)孵育結束後，取出96孔細胞培養板，輕輕甩幹，去掉培養基。12)每孔加入90ul不含血清的DMEM。13)每孑L力口入 90ul Bright-Glo Luciferase。14)2min後用排槍吸取96孔中的液體至白板中 15)上機檢測，獲得包括cell control在內的每個樣品孔的RLU。16)計算每個稀釋度的抑制效率=1-(sample-Cell control)/(Virus controI-Ce11control)。如圖8所示，陽性對照UMASS serum可以中和SF162假型病毒；與UMASS serum比 較，BC. gpl20和ThB. gpl20免疫血清也可以中和SF162，但是AE. gpl20免疫血清不能中和 SF162。由於SF162是來自B亞型的病毒，因此上述血清中和能力的差異反應了 Env蛋白的 變異對中和作用的影響，也說明了 AE. gpl20、BC. gpl20和ThB. gpl20誘導的免疫應答的有 效性(具有中和作用)和特異性(中和作用具有亞型上的差別)。本發明未涉及部分均與現有技術相同或可採用現有技術加以實現。實施例中所涉及的試劑信息如下表
Taq酶Promega 公司
T4DNA連接酶Promega 公司
DNA marker(DL 3000)大連寶生物公司
限制性內切酶BamH I，Pst I和Sac IFermentas 公司
DNA凝膠回收試劑盒大連寶生物公司
DMEM高糖培養基Hyclone 公司
RPM1640細胞培養液Hyclone 公司
胎牛血清Gibico公司
質粒小量提取試劑盒Qiagen公司
粒大量提取試劑盒Qiagen公司
PEIInvitrogen 公司
HRP標記的鏈親和素SouthernBiotech 公司
HRP標記的羊抗兔IgGSouthernBiotech 公司
生物素標記的羊抗兔IgGSouthernBiotech 公司
TMB片劑Sigma公司
權利要求
中國HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有胺基酸序列，序列為SEQ ID NO.1、SEQID NO.2或SEQ ID NO.3。
2.經密碼子優化的編碼中國HIV-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基因 序列，序列為 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6。
3.HIV-lgpl20核酸疫苗，其特徵在於該疫苗含有權利要求2所述的經密碼子優化的編 碼中國HIV-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有胺基酸序列的基因序列和真核表達載體。
4.根據權利要求3所述的核酸疫苗，其特徵在於所述的真核表達載體為經內切酶NheI 和BamHI切割質粒pJW4303得到的載體大片段。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥技術領域，涉及密碼子優化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗。本發明應用多序列比對分析，獲得中國HIV-1流行病毒株(A/E重組亞型、B/C重組亞型和ThB亞型)包膜蛋白gp120共有胺基酸序列；應用人工合成的方法製備編碼共有胺基酸序列的gp120基因片段，該基因經密碼子優化，兼顧了哺乳動物細胞和大腸桿菌密碼子使用偏好；在此基礎上，構建了由gp120基因和真核表達載體pJW4303組成的HIV-1gp120核酸疫苗。該核酸疫苗可以應用於動物和人體免疫，也可以應用於gp120蛋白的表達和生產。
文檔編號A61P31/18GK101885760SQ20101012614
公開日2010年11月17日 申請日期2010年3月16日 優先權日2010年3月16日
發明者盧山, 張明順, 王世霞, 黃祖瑚 申請人:王世霞;張明順;黃祖瑚;盧山