基於選擇劑的識別和量化系統及用於在單次分析中識別和量化多種分析物的方法

2023-09-22 13:19:45 4

基於選擇劑的識別和量化系統及用於在單次分析中識別和量化多種分析物的方法
【專利摘要】本申請提供了一種用於同時分析樣品溶液中的多種分析物的多維方法，所述方法包括：向包含待測量分析物的樣品溶液中添加親和選擇劑，所述親和選擇劑對所述樣品溶液中的所述分析物中的一種或更多種具有親和力；允許所述親和選擇劑與所述分析物形成免疫複合物；在第一維分離中採用選擇性吸附技術將所形成的免疫複合物與所述樣品溶液中的非分析物物質部分或全部分離；使所分離的免疫複合物解離；在第二維分離中採用選擇性吸附技術使解離的免疫複合物中的所述分析物與所述親和選擇劑彼此分離；並根據所述分析物的質荷比來解析所述分析物。
【專利說明】基於選擇劑的識別和量化系統及用於在單次分析中識別和 量化多種分析物的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求於2012年2月2日提交的美國臨時專利申請序列號 No. 61/594, 193(代理人案號NO.PERF-P0006-US)的優先權，並且是於2010年3月10日提交 的美國專利申請序列號No. 12/721，173 (代理人案號No. PERF-P0004-US)以及同樣於2010 年3月10日提交的國際專利申請No. PCT/US2010/026819 (代理人案號No. PERF-P0001-W0) 的部分繼續申請，其公開內容明確地通過引用以其整體併入本文。

【技術領域】
[0003] 本公開內容總體上涉及用於分析抗原的多維分析策略和系統，並且特別地涉及用 於在單次分析中分析多種分析物的基於親和選擇劑（affinity selector)的識別和定量系 統以及方法。

【背景技術】
[0004] 在與約100, 000種其他組分的混合物中測定單一分析物是一項艱巨的任務。在 六十多年前，分析人員開始認識到抗體的結構選擇性可用於基於抗原和半抗原的化學結 構從生物提取物或血液中結合和純化所述抗原和半抗原。該技術變得如此重要以至於 Rosalyn Yalow 因放射免疫測定（radio-immunological assays，RIA)而獲得 1960 年的諾 貝爾獎。連同酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，這兩項 技術為世界提供了測量低至pg/mL水平的抗原的簡單方法。
[0005] RIA和ELISA二者的基本組成都是在測定的第一步中使用固定化抗體以實現從樣 品中選擇抗原。自從這些方法出現以來，分析免疫學家已理解，在表面結合抗體引入了顯著 的動力學限制。例如，抗原必須依照分子大小而經過相當的距離以到達表面，從而增加了在 試管或微量滴定孔中發生抗原結合所需的時間量。此外，測定中使用的所有抗體在測定孔 表面或在顆粒上聚集在一起，而抗原則均勻地分布於整個溶液中。當在微量滴定孔中進行 ELISA時，通常使用一天或更長的孵育時間，以允許抗原有時間擴散至結合有抗體的孔壁 上。在RIA的情況下，使擴散問題最小化的努力涉及使用大量的非常小的固定有抗體的無 機顆粒。在過去的幾年期間，已經使用了許多類型的混合、流動、加熱以及甚至超聲的過程 以使上述的擴散問題最小化。雖然做出了這些努力，但是擴散問題仍然存在。
[0006] 隨著分析化學的發展，已認識到可獲得涉及要同時測定多種分析物之樣品的多種 問題的更好更完整的答案。這進而導致了對"分析復用（analytical multiplexing)"興趣 的增加，其中在單次分析期間對樣品中的大量分析物進行分析。這常常通過免疫陣列而進 行。
[0007] 對免疫陣列的興趣源自微電子機械系統（micro-electro-mechanical-system， MEMS)的普及和成功。當已將幾種類型的抗體陣列用於大規模復用（包括高通量和並行處 理技術）時，另一些方法集中於較少數目樣品的大規模復用，這是例如關注使每次測定的 總分析時間和成本最小化的臨床實驗室所需要的。無論使用哪種方法，免疫陣列系統都仍 然面臨抗體固定化和動力學的挑戰。還存在抗體在固定化（尤其是如果它們被錯誤的定位 於表面）之後是否仍將保留全部活性的問題。還必須考慮空間問題，尤其是抗體在表面的 定位及其堆積密度方面。最後，再現性也是一個因素，尤其是由於很難使來自在表面上沉積 的皮升（Picoliter)體積溶液的固定化抗體再生。蒸發以及很多其他現象也使滴定板水平 的固定化所經歷的再現性降低。
[0008] 雖然抗原在免疫陣列中必須擴散以到達表面的距離比在微量滴定孔中的要小，但 是動力學問題仍然是免疫陣列的一個嚴重限制。在低的抗原濃度下尤其如此。抗原從溶液 中的所有點擴散至陣列元件之一需要大量的時間。因為在抗原：抗體複合物形成中的分子 對接需要精確的空間定位，所以抗原通常在建立正確的捕獲定位之前多次撞擊表面。例如， 如果抗原在128兀件陣列上與表面碰撞之後未被捕獲，那麼它在第二次撞擊表面之前有大 量空間要行進。
[0009] 如上所述，基於顆粒的測定始於RIA和Yalow方法。目前Yalow法已發展成為兩 類測定系統：1)用於流式細胞術測定的顆粒方法（例如，Luminex系統），其中檢測單個顆 粒的螢光；以及2)其中將抗體放置在磁性顆粒上的方法，免疫複合物在所述磁性顆粒上形 成，然後將所述顆粒從溶液中取出，並釋放抗原用於進一步測量（例如，Leigh Anderson的 SISCAPA系統）。復用需要製備用於每種被測定抗原的不同組的免疫吸附珠。這意味著，需 要將20至50組不同的攜帶珠的抗體添加到樣品溶液中，從而導致在尋找合適的抗體顆粒 方面甚至更大的抗原動力學限制。此外，所述溶液因具有如此大量的顆粒而變得擁擠，使得 抗原必須在未攜帶其抗體的顆粒周圍擴散。用於處理這些限制的一種推薦解決方案是將多 個抗體固定在單個顆粒上。然而，該解決方案未完全解決擴散和化學計量控制的問題。而 且，顆粒表面上抗體濃度的稀釋意味著抗原可撞擊顆粒表面而不接觸到其抗體。此外，總表 面積以及由此所需的顆粒總數仍然保持很高。
[0010] 至於流式細胞術策略（例如Luminex系統），在可通過流式細胞術分析免疫複合物 之前，必須在顆粒表面上形成免疫複合物。而該系統與上述系統非常類似，每個珠攜帶靶向 單一抗原的單一抗體。此外，在抗原捕獲中還存在擴散問題。
[0011] 有趣的是，哺乳動物免疫系統的功能是處理數以千計的抗原，儘管它們並不都是 同時進行。隨著在單個哺乳動物中產生對外來物質的免疫，產生了針對數以千計免疫原的 抗體。這些抗體包含在血液中循環的免疫球蛋白中，在任何時候，隨著抗原：抗體複合物的 形成，數百種抗原被隔離。基於對哺乳動物免疫系統的分析，可得出這樣的結論：因為抗體 形成免疫複合物，所以它們已發展為在溶液中起作用。除了在溶液中起作用之外，它們還同 時隔離大量抗原，並且幾乎沒有固定化抗體測定系統中所見到的限制。
[0012] 哺乳動物免疫系統的上述發現極其重要，特別是因為它們清楚地表明，溶液中免 疫複合物的形成是天然有效的，而在固定化表面上之複合物的形成則並非如此。此外，清楚 的是，可以在溶液（例如，血液）中同時形成幾種免疫複合物，這是在進行分析復用過程時 要實現的一個必需因素。最後，通常影響免疫測定的大多數問題（例如，固定化期間的活性 喪失、抗體的適當定位、擴散動力學以及具有足夠的表面積）在這些基於天然溶液的系統 內並不普遍。
[0013] 雖然天然形成的免疫複合物具有上述優點，但是這樣的免疫測定仍需要向樣品中 添加抗體，這可產生問題。例如，向血漿樣品中添加大量抗體可導致蛋白質濃度升高至阻礙 分析物擴散的水平。雖然這個問題在表面上看起來可能似乎有關係，但是進一步觀察之後 可推斷出這個問題很可能並不合邏輯。更特別地，在血漿中存在的血清白蛋白的平均濃度 為約50mg/mL至約100mg/mL，而存在的免疫球蛋白的量為約4mg/mL,並且任意特定抗體的 量很可能在約1 μ g/mL至約100 μ g/mL的範圍內。如果假定進行分析測量所需的抗體濃度 為10 μ g/mL,並且當將100種抗體添加至血楽樣品中時，蛋白質濃度將總計升高約lmg/mL。 類似地，如果血漿樣品中的蛋白質濃度為75mg/mL，則蛋白質濃度將升高約1. 3%。因此，可 推斷出向血漿中添加100種抗體以進行100倍的復用分析將對蛋白質濃度、溶液粘度以及 最終分析物的擴散幾乎沒有影響。而且，添加1〇〇〇種抗體只使質量提高10mg/mL，或者使蛋 白質濃度改變14% ;這很可能也不足以對分析造成影響。
[0014] 在1960年以前，免疫測定一般靶向單個抗原，並且通過所謂的"沉澱素反應 (precipitin reaction)"的方法在溶液中進行。形成免疫複合物之後，用於測定的多克隆 抗體混合物或者形成沉澱，或者通過添加碳水化合物或乙二醇聚合物而被誘導形成沉澱。 抗原濃度通過光散射進行測定；然而，這種方法缺乏靈敏度和線性，並且沉澱素測定一次只 允許測定一種抗原的事實導致了該方法告終，並最終轉變為靈敏得多的RIA和ELISA方法。 雖然沉澱素反應方法失敗了，但是仍然可以推理出，如果選擇性和檢測靈敏度得以大幅改 進，則基於溶液的免疫複合物形成方法可用於免疫測定。
[0015] 雖然最初的沉澱素和RIA方法在進行抗原測量中取決於單一選擇方法（即，一種 抗原），但是現今可接受的是，單一抗體的選擇性不足以將樣品中的抗原與所有其他化學實 體區分開。當前的免疫測定建立在多維的選擇和/或區分上，並且如果這些維度中的每一 個都是正交選擇時尤其理想。


【發明內容】

[0016] 本公開內容通過提供用於分析抗原的新的多維分析策略和系統從而克服或改善 了上述現有技術缺點中的至少一個，或者提供了有用的替代方案。
[0017] 在其一種形式中，提供了用於抗原分析的多維分析策略。根據本公開內容的這個 方面，在第一維分析期間，用可溶性免疫複合物中的抗體隔離樣品溶液中的抗原。在分析 過程開始時向溶液中添加抗體的具體目的是結合抗原以在所述多維方法的後續步驟中進 行定性和定量分析。交叉反應的抗原、非特異性結合物質以及與抗原發生次級結合的物質 也可在第一維中吸附至免疫複合物，並在之後維的分析中被清除。在第一維中形成的免 疫複合物的獨特性質之後在第二維分析中被利用，其使用分子大小分級系統（molecular sizing system)或祀向隔離抗體之具體性質的吸附介質，基於其流體力學體積將其與樣 品中的其他組分分離（resolve)。基於這兩種性質之一的分級對於表位：互補位識別是正 交的，並且第三維和第四維中的區分通過下述方式的組合來實現：分析物特異性化學修飾 (例如，衍生化或蛋白水解）和大小區分以及從表面（例如，在反相基質或離子交換介質 上）吸附和差異洗脫，或者通過以尺寸排阻和疏水吸附（正如使用限進介質一樣）的組合。 所選擇的具體區分機制以及其中它們聯用的順序取決於所靶向分析物的化學性質以及在 前兩維中使用的分級機制。在第五維及更高維的分析發生在從質譜到螢光和電化學檢測器 的檢測系統內。根據採用質譜檢測系統的某些實施方案，可根據分析物在第五維中的質量、 在第六維中碰撞誘導的分析物解離以及在第七維中所得碎片離子的質量分析來解析所述 分析物。
[0018] 根據本公開內容的另一形式，提供了同時分析樣品溶液中的多種分析物的多維方 法。根據本公開內容的這個方面，所述方法包括：向所述樣品溶液添加親和選擇劑以形成所 述親和選擇劑與所述分析物的免疫複合物；提供第一分離方式，以使所述樣品溶液中的所 形成的免疫複合物與其它非分析物物質部分或完全分離；提供第二分離方式，以使所述樣 品溶液中所述分析物彼此部分或全部分離；以及根據其質荷比來解析所述分析物。
[0019] 根據本公開內容的另一些方面，提供了用於同時分析樣品溶液中的多種分析物的 多維方法。根據本公開內容的這個方面，所述方法包括：向包含待測量分析物的樣品溶液中 添加親和選擇劑，所述親和選擇劑對所述樣品溶液中的所述分析物中的一種或更多種具有 親和力；允許所述親和選擇劑與所述分析物形成免疫複合物；將所形成的免疫複合物與所 述樣品溶液中的非分析物物質部分或全部分離；使所分離的免疫複合物解離；通過表面吸 附過程捕獲所述分析物從而使解離的免疫複合物中的分析物與親和選擇劑彼此分離；將捕 獲的分析物轉移至檢測裝置；以及用所述檢測裝置根據其質荷比來解析所述分析物。
[0020] 在本公開內容的某些方面中，通過以下將所形成的免疫複合物完全或部分分離： 根據其流體力學體積分離分析物或所形成的免疫複合物，靶向親和選擇劑或分析物之獨特 的結構特徵以捕獲分析物或所形成的免疫複合物的抗體，進行寡核苷酸雜交或者利用固定 化親和素來吸附和捕獲生物素化的親和選擇劑。
[0021] 在本公開內容的另一些方面中，通過以下將樣品溶液中的分析物與親和選擇劑彼 此分離：根據其流體力學體積分離分析物或所形成的免疫複合物，從疏水表面吸附和差異 洗脫分析物，靶向親和選擇劑或分析物之獨特的結構特徵以捕獲分析物或所形成的免疫復 合物的抗體，進行寡核苷酸雜交，利用固定化親和素捕獲生物素化的親和選擇劑，從帶電錶 面吸附和差異洗脫分析物，從固定化的金屬親和螯合劑吸附和差異化洗脫分析物，或者從 富含硼酸的表面吸附和差異洗脫分析物。
[0022] 根據本發明教導的分析的分析物可包括但不限於分析物片段、分析物衍生物和分 析物同素異構體（isotopomer)中的至少一種。而且，本發明教導的親和選擇劑可包括但 不限於抗體、抗體片段、適配體（aptamer)、凝集素、噬菌體展示蛋白受體、細菌蛋白質和寡 核苷酸中的至少一種。根據某些實施方案，所述細菌蛋白質可包括G蛋白、A蛋白以及由生 物體產生的靶向來自另一生物體之蛋白質的蛋白質中的至少一種，而所述寡核苷酸可包括 RNA、DNA和PNA中的至少一種。
[0023] 根據本公開內容的某些實施方案，用固定化抗體靶向親和選擇劑之獨特的結構特 徵使分析物與親和選擇劑彼此分離。根據這些具體實施方案，被祀向的獨特的結構特徵可 包括但不限於親和選擇劑特有的天然結構特徵、已與親和選擇劑綴合的半抗原以及與親和 選擇劑綴合的免疫原中的至少一種。
[0024] 根據本公開內容的一些方面，進行分析的分析物包括使用質譜分析可檢測的離子 化分析物，所述質譜分析特別檢測根據其質荷比已經分離的分析物的母體離子。
[0025] 在本公開內容的某些方面中，通過使用檢測裝置對分析物進行解析，所述檢測裝 置被配置成進行以下的整合步驟：（a)將已根據其質荷比分離的分析物離子化；(b)利用氣 相碎裂過程（gas phase fragmentation process)產生來自步驟（a)之母體離子的碎片離 子；（C)根據其質荷比分離步驟（b)中產生的碎片離子；以及（d)記錄當步驟（C)所產生的 碎片離子與檢測器表面碰撞時所產生的相對離子流。在用於解析分析物的檢測裝置方面， 根據某些實施方案，通過以下技術中的一種或更多種對分析物進行檢測：質譜、吸光度、熒 光和電化學分析。
[0026] 根據本公開內容的另一些實施方案，可使用同位素標記的內標物（isotopically coded internal standard)來實現進行分析之分析物的相對或絕對量化。此外，連續添加、 競爭性結合測定也可用來實現分析物的相對或絕對量化。
[0027] 在本公開內容的另一些方面中，還可考慮利用抗體濃縮來從樣品溶液中收集分析 物的等量份。根據本公開內容的這些方面，將收集的等量份配置成與用於解析分析物之裝 置的最佳檢測範圍相適應。
[0028] 根據本公開內容的另一形式，提供了利用多個正交分離維數來分析樣品溶液中的 多種分析物的方法。根據本公開內容的這個方面，所述方法包括：向所述樣品溶液中添加親 和選擇劑以形成所述親和選擇劑與所述分析物的免疫複合物，並獨立地隔離所述樣品溶液 中的一種或更多種抗原和幹擾物質；利用選擇性吸附技術在第一或第二正交分離維數中除 去所隔離的一種或更多種抗原和幹擾物質，而不論其順序如何；提供第一分離方式，以使所 述樣品溶液中的所形成的免疫複合物與其他非分析物物質部分或完全分離；提供第二分離 方式，以使所述樣品溶液中的所述分析物彼此部分或全部分離；以及根據其質荷比來解析 所述分析物。
[0029] 根據本公開內容的另一個方面，提供了用於同時分析樣品溶液中的分析物的方 法，所述方法包括：向所述樣品溶液中添加親和選擇劑以形成所述親和選擇劑與所述分析 物的免疫複合物；通過提供第一色譜柱來將所形成的複合物與所述樣品溶液中的其他未復 合物質分離；使所形成的複合物解離；通過第二色譜柱的表面吸附捕獲所述分析物，以將 所述分析物與所述親和選擇劑分離；將所捕獲的分析物轉移至與所述第二色譜柱相聯的第 三色譜柱；以及隨著所捕獲的抗原或其片段從所述第三色譜柱洗脫，對所述捕獲的抗原或 其片段進行分析。
[0030] 根據本公開內容的某些方面，所述非複合物質包括不具有被所添加親和選擇劑靶 向的表位的物質。
[0031] 在本公開內容的另一些方面中，用於將樣品溶液中形成的複合物與其他非複合物 質分離的色譜柱選自以下的至少一種：尺寸排阻色譜柱、填充有吸附劑的限進介質柱、配置 成靶向一般類別的所添加親和選擇劑的抗體柱、配置成靶向所有的所添加的親和選擇劑的 蛋白質A柱或G柱、具有與附著於一種或更多種所添加親和選擇劑上寡核苷酸互補之固定 DNA的DNA寡核苷酸柱、配置成靶向附著於一種或更多種所添加親和選擇劑上的生物素的 親和素柱、以及配置成選擇所添加親和選擇劑的天然存在或合成產生之特徵的色譜柱。
[0032] 根據本公開內容的另一些方面，通過表面吸附捕獲分析物的用於將分析物與親和 選擇劑分離的色譜柱選自以下的至少一種：反相色譜柱、限進介質柱、免疫吸附、固定化的 金屬離子親和色譜柱、離子交換柱以及色譜保留裝置。
[0033] 根據本公開內容的某些方面，親和選擇劑包括但不限於：適配體、蛋白A、蛋白G、 噬菌體展示蛋白、天然受體、凝集素、DNA、RNA、合成親和試劑或對分析物表現出親和力以在 親和捕獲劑與分析物之間形成多種分子間複合物的一些其他物質。
[0034] 根據本公開內容的另一個方面，用於同時分析樣品溶液中的多種分析物的多維方 法包括：向包含待測量分析物的樣品溶液中添加親和選擇劑，所述親和選擇劑對所述樣品 溶液中的所述分析物中的一種或更多種具有親和力；允許所述親和選擇劑與所述分析物之 間形成免疫複合物；在第一維分離中採用選擇性吸附技術使所述樣品溶液中的所形成的免 疫複合物與其他非分析物物質部分或完全分離；使所分離的免疫複合物解離；在第二維分 離中採用選擇性吸附技術使解離的免疫複合物中的分析物與親和選擇劑彼此分離；以及根 據其質荷比來解析所述分析物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 通過結合附圖參照下文對本公開內容之一些實施方案的描述，本公開內容的上述 優點和其他優點以及得到這些優點的方式將變得顯而易見，並且將更好地理解本公開內容 本身，其中：
[0036] 圖1是示出根據本公開內容教導基於親和選擇劑與分析物複合而形成複合物從 而同時分析多種分析物的多維方案；
[0037] 圖2是根據本公開內容教導的限進介質（restricted access media, RAM)顆粒；
[0038] 圖3是根據本公開內容教導的半滲透表面（semipermeable surface, SPS)支持物 的圖解；
[0039] 圖4是根據本公開內容教導用於對由親和選擇劑從複合物樣品基質中捕獲的蛋 白質直接進行質譜（MS)分析的分析方案。
[0040] 圖5是根據本公開內容教導的限進柱的圖解，其中柱內部是親水凝膠並且外部用 固定化胰蛋白酶包被；
[0041] 圖6描述了據本公開內容教導的胰蛋白酶-RAM柱中塗層的合成；
[0042] 圖7是根據本公開內容教導用於蛋白質質譜分析的分析方案，所述蛋白質通過親 和選擇劑從複合物樣品基質中捕獲，並且隨後在進一步分析之前進行蛋白水解消化。
[0043] 圖8是根據本公開內容教導的一種示例性閥系統，其允許向截流模式分析中的固 定化酶柱施加高壓；
[0044] 圖9是根據本公開內容教導用於對由多克隆抗體親和選擇劑捕獲的半抗原和肽 進行分析之方案的圖解；
[0045] 圖10是根據本公開內容教導用於對由生物素化親和選擇劑捕獲的半抗原和肽進 行分析之方案的圖解；
[0046] 圖11是根據本公開內容教導用於對由DNA、RNA或PNA親和選擇劑捕獲的半抗原 和肽進行分析之方案的圖解；
[0047] 圖12是根據本公開內容教導基於分子大小用於對免疫複合物進行分級之方案的 圖解；以及
[0048] 圖13是根據本公開內容教導的儀器平臺的液相色譜組件，其能夠進行基於親和 選擇劑方法的高解析度分析，用於同時分析多種分析物。
[0049] 發明詳述
[0050] 下文描述的本公開內容的實施方案並不旨在窮舉或將本公開內容限制在下文詳 細描述所公開的精確形式。相反，對實施方案進行選擇和描述使得本領域其他技術人員可 領會和理解本公開內容的原理和實踐。
[0051] 如上所述，本公開內容總體上涉及用於分析抗原的多維分析策略和系統。如將在 下文更詳細解釋的，本發明教導的一個區別特徵是在第一維中與樣品溶液中的分析物形成 大量分子間複合物，之後在第二維中進行某一類型分子間複合物的分離，這將產生用於在 第三維中進一步分級或化學反應的級分，之後在第三維中進行非常特異類型的分離或化學 反應的能力。在本發明教導的某些方面中，在第三維後可使用更高維的分析，並且尤其使得 在多維分析過程結束時，將有這樣的情況：1)可將被檢測的每種物質（分析物）單獨地鑑 定和量化，或者2)可一起測定密切相關家族的分析物。
[0052] 現在轉到圖1，其示出了一種根據本公開內容的用於同時分析多種分析物的方案， 該方案基於親和選擇劑（S * )(例如抗體、適配體、凝集素、蛋白G、蛋白A、噬菌體展示蛋 白或結合蛋白）與分析物（A)在第一維分析中複合，形成複合物（S * :A)。雖然根據本公 開內容的某些方面，一般將特異性親和選擇劑用於每種分析物，但是在另一些方面中，也可 以有與多種分析物形成複合物的親和選擇劑，例如，可見靶向與許多糖蛋白偶聯的LewisX 抗原的抗體。
[0053] 關於第一維（或"親和選擇維"），該維中的過程基於親和選擇劑（S * )與分析物 的複合作用。S上的符號（* )指明親和選擇劑或複合物之獨特的結構特徵，所述獨特的結 構特徵可在稍後較高維中用於對其進行選擇。
[0054] 在該第一維中的分析物分析始於溶液中單一複合物的形成，如在下面的式1中所 述：
[0055]

【權利要求】
1. 一種用於同時分析樣品溶液中之多種分析物的多維方法，所述方法包括： 向包含待測量分析物的樣品溶液中添加親和選擇劑，所述親和選擇劑對所述樣品溶液 中的所述分析物中的一種或更多種具有親和力； 允許所述親和選擇劑與所述分析物形成免疫複合物； 在第一維分離中採用選擇性吸附技術將所形成的免疫複合物與所述樣品溶液中的非 分析物物質部分或全部分離； 使所分離的免疫複合物解離； 在第二維分離中採用選擇性吸附技術使所解離的免疫複合物中的所述分析物與所述 親和選擇劑彼此分離；以及 根據所述分析物的質荷比來解析所述分析物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中在柱、筒、移液器吸頭、板或珠形式中進行所述第 一維分離。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中在變性的物質上進行所述第一維分離。
4. 根據權利要求3所述的方法，其中通過還原和烷基化形成所述變性的物質。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中酶促修飾在所述第一維分離之前進行。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中在所述第一維分離之後所述第二維分離之前進行 酶促消化。
7. 根據權利要求6所述的方法，其中使用胰蛋白酶、lys c、glu c、胃蛋白酶、木瓜蛋白 酶、鏈黴蛋白酶、PNG酶F、葡糖醛酸酶或多種其他酶進行所述酶促消化。
8. 根據權利要求1所述的方法，其中在所述第二維分離之後第三維分離之前進行酶促 消化。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中使用胰蛋白酶、lys c、glu c、胃蛋白酶、木瓜蛋白 酶、鏈黴蛋白酶、PNG酶F、葡糖醛酸酶或多種其他酶進行所述酶促消化。
10. 根據權利要求1所述的方法，其中串聯使用兩步酶促修飾，並在它們之間有分離步 驟。
11. 根據權利要求1所述的方法，其還包括基於離子化分子在載氣中的遷移率使用離 子遷移分離器來分離在氣相中的離子化分子。
12. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第一和第二維分離包括以下的至少一種：根 據流體力學體積分離，用捕獲抗體靶向獨特的結構特徵，用固定化的親和素靶向生物素化 的特徵，從疏水表面上吸附和差異洗脫，從帶電錶面上吸附和差異洗脫，從固定化的金屬親 和螯合劑上吸附和差異洗脫，以及從富含硼酸的表面上吸附和差異洗脫。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述獨特的結構特徵包括以下的至少一種：所 述親和選擇劑特有的天然結構特徵、已與所述親和選擇劑綴合的半抗原和與所述親和選擇 劑綴合的免疫原。
14. 根據權利要求1所述的方法，其中所述分析物包括以下的至少一種：分析物片段、 分析物衍生物和分析物同素異構體。
15. 根據權利要求1所述的方法，其中所述分析物包括離子化的分析物。
16. 根據權利要求1所述的方法，其中所述親和選擇劑包括抗體和抗體片段中的至少 一種。
17. 根據權利要求1所述的方法，其中所述親和選擇劑包括以下的至少一種：適配體、 凝集素、噬菌體展示蛋白受體、細菌蛋白質和寡核苷酸。
18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述細菌蛋白質包括以下的至少一種：G蛋白、 A蛋白以及由生物體產生的用於靶向來自另一生物體之蛋白質的蛋白質。
19. 根據權利要求17所述的方法，其中所述寡核苷酸包括RNA、DNA和PNA中的至少一 種。
【文檔編號】G01N33/68GK104160278SQ201380013470
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年1月30日 優先權日:2012年2月2日
【發明者】弗雷德·E·雷尼爾, 尼古拉斯·B·赫羅爾德, 凱文·W·邁爾 申請人:珀菲尼迪生物科學股份有限公司