申氏桿菌及其在微生物降解對乙醯氨基酚中的應用的製作方法

2023-09-22 06:57:25

專利名稱：申氏桿菌及其在微生物降解對乙醯氨基酚中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株新型高效對乙醯氨基酚降解菌一申氏桿菌(Shinella sp.)HZA2，及其在微生物降解對乙醯氨基酚中的應用。
背景技術：
對乙醯氨基酹(Acetaminophen),藥品名稱為撲熱息痛(Paracetamol, APAP,醋氨酚)。為白色結晶性粉末，有解熱鎮痛作用，常用作抗炎藥和止痛藥等，從20世紀50年代起就得到普遍應用，其分子結構式如式(I)所示。對乙醯氨基酚無臭，味苦，熔點169 171 °C，相對密度I. 293(21 / 4°C )，能溶於酒精、丙酮和熱水，不溶於石油醚及苯，飽和水溶液pH值為5. 5 6. 5。
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(I )對乙醯氨基酚作為一處常規的鎮痛與退燒處方藥，在全世界範圍內被廣泛應用。長期服用對乙醯氨基酚，其代謝產生的毒性中間體會與肝中重要的酶和蛋白質分子進行不可逆結合，可導致肝壞死。當該類藥物在飲酒後使用時，會大大影響到糖類、脂肪、能量和維生素的代謝，加重中毒，過量使用對乙醯氨基酚會導致高鐵血紅蛋白症、DNA鏈的斷裂，會抑制DNA複製和修復系統，還會引起乳腺癌細胞的增生。較大部分對乙醯氨基酚並沒有在體內發生代謝作用，而被直接排出體外，汙染了環境。同時，汙水處理廠並不能完全去除廠對對乙醯氨基酚，一般汙水處理廠去除率僅在85 %左右。環境中暴露的對乙醯氨基酚及其降解中間產物會對人和動物造成危害，對乙醯胺基酚對靶標生物和非靶標生物均存在較大的安全風險。通過生物富集等環境行為會加重對乙醯氨基酚汙染的危害性和風險性。所以，為保證人們的健康和生態安全，在合理用藥的同時，尋求合適可行的去除環境中對乙醯氨基酚汙染物的方法顯得尤為重要。對乙醯氨基酚的化學結構和化學性質比較穩定，若用物理、化學的方法去除，則成本較高，且有害副產品較多，而微生物對芳香烴有機物具有獨到的降解作用，利用微生物代謝方法去除對乙醯氨基酚，不僅成本低，而且有害副產品少，處理效率高，有著廣闊的應用前景。微生物是一類種類多、繁殖快、適應性強、代謝能力強的生物體。若能篩選分離出能高效降解對乙醯氨基酚的微生物，將對乙醯氨基酚降解成羧酸、胺基酸等對人體和環境無毒害的物質，這對維護人類健康和生態安全有著深遠的意義。
發明內容
本發明目的是提供一株新型高效申氏桿菌屬對乙醯氨基酚降解菌HZA2及其應用。本發明採用的技術方案是申氏桿菌(Shinella sp. ) HZA2,保藏於中國典型培養物保藏中心,地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏日期為2012年10月15日，保藏編號為CCTCC No: M2012405。所述申氏桿菌屬HZA2的16S rDNA的Genbank登陸號為JX878616。申氏桿菌屬HZA2 (Shinella sp. HZA2)菌株的篩選與鑑定I)培養基無機鹽培養基終濃度組成為每升培養液中含有NaCl lg, K2HPO4 I. 5g，KH2PO4O. 5g，(MM)2SO4 I. 5g, MgSO4 O. lg，Iml微量元素溶液，溶劑為去離子水，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(12rC，20min)後製得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4 . H2O O. 13g, ZnCl2O. 23g, CuSO4 . H2O O. 03g, CoCl2 . 6H20 0. 42g, Na2MoO4 . 2H20 0. 15g, AlCl3 . 6H20 0. 05g,溶劑為去離子水。富集培養液在無機鹽培養基中加入對乙醯氨基酚，使得對乙醯氨基酚的終濃度為 200mg/L。LB液體培養基每升培養液中含有酵母粉10g，蛋白腖5.0g，氯化鈉lO.Og，溶劑為去離子水，自然PH值，高壓蒸汽滅菌(12rC，20min)後製得。 LB固體培養基每升培養中含有酵母粉10g，蛋白腖5.0g，氯化鈉10. 0g，瓊脂15. Og,溶劑為去離子水，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(121°C，20min)後製得。2)菌株分離純化汙泥樣品採自杭州汙水處理廠，取5ml汙泥樣品置於250ml錐形瓶中，加入IOOml富集培養液，黑暗振蕩培養(30°C，150rpm) I周，取5ml上層濁液於新鮮的富集培養液100ml中，繼續黑暗振蕩培養(30°C，150rpm) I周，重複上述操作過程3次，每次培養的接種物均取自於上次培養所得的培養液。取最後一次培養所得的培養液5 ml進行梯度稀釋(10_3，10_4、10_5、10_6)，取各個稀釋後的培養液100 μ I塗布於含200mg/L對乙醯氨基酚的LB固體培養基平板上，置於恆溫培養箱(30°C)中培養，待平板上長出菌落後，挑取各菌落於含200mg/L對乙醯氨基酚的LB固體培養基平板上反覆純化，直至菌落單一，將純化後的各菌落分別接至LB液體培養基試管中振蕩培養(30°C，150rpm)過夜，將培養好的菌液離心(6000rpm，5min)後接至富集培養液中30°C培養3d，通過高效液相色譜法(HPLC)檢測各富集培養液中對乙醯氨基酚的殘留量，最後篩選獲得一株能高效降解對乙醯氨基酚的菌株，命名為HZA2。3)菌株鑑定將上述獲得的菌株進行形態特徵和分子生物學鑑定，該菌株的電鏡照片如圖I所示。該菌株的主要生物學特徵為菌體杆狀，端生鞭毛，無芽孢，大小約為(0.5 1.0) X(I. 5^2. 0) μ m,菌落平坦，中間凸起，邊緣擴散，呈淡黃色，革蘭氏染色反應陰性，能利用澱粉、葡萄糖，乙醯甲基甲醇試驗陰性，V. P.反應陰性，抗氨苄青黴素、卡那黴素，不抗慶大黴素。該菌株最適宜的生長條件pH值為7. 0，溫度30°C。該菌株經16S rDNA序列分析鑑定為Shinella屬，因此命名為申氏桿菌(Shinella sp. ) HZA2。本發明還涉及所述的申氏桿菌HZA2在微生物降解對乙醯氨基酚中的應用。具體的，所述降解在20 40 pH 5.5 8. 5、黑暗條件下進行，一般需振蕩(100 200 rpm)。優選的，所述降解在30°C，pH 7. 0、150rpm、黑暗條件下進行。在對乙醯氨基酚終濃度為200mg/L的無機鹽培養基，加入含申氏桿菌HZA2的細胞懸液構成反應體系，在20 40°C、pH值為5. 5 8. 5的條件黑暗振蕩培養6 10h，即可使反應液中對乙醯氨基酚的質量殘留量小於O. 1% ;所述含申氏桿菌HZA2的細胞懸液加入量使反應體系中申氏桿菌HZA2終濃度為1Χ1(Τ5Χ107個/ml。實際應用中，所述菌株通常需要經過活化和擴大培養，具體過程如下 (I)斜面培養將申氏桿菌HZA2接種於斜面培養基，2(T 40°C培養3飛天，獲得菌體斜面；所述斜面培養基的終濃度組成為酵母粉10g/L，蛋白腖5. Og/L，氯化鈉10. Og/L，瓊脂20g/L，溶劑為去離子水。(2)種子培養從步驟(I)菌體斜面上挑取一接種環菌體接種至無機鹽培養基中，20 40°C培養3飛天，獲得種子液；所述無機鹽培養基終濃度組成為每升培養液中含有NaCl lg, K2HPO4 I. 5g，KH2PO4 O. 5g，(NH4) 2S04 I. 5g，MgSO4 0. lg, Iml 微量元素溶液，溶劑為去離子水，自然PH值，高壓蒸汽滅菌(12rC，20min)後製得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4 . H2O O. 13g, ZnCl2 O. 23g, CuSO4 . H2O O. 03g, CoCl2 . 6H20 0. 42g, Na2MoO4 . 2H200. 15g, AlCl3 · 6H20 0. 05g，溶劑為去離子水。(3)擴大培養將步驟(2)獲得的種子液以體積濃度1(Γ20%的接種量接種至LB液體培養基中，30 0C、150rpm振蕩養至對數生長期，獲得菌液，將菌液離心，棄上清，沉澱用pH值為7. O的磷酸緩衝液懸浮，獲得含申氏桿菌HZA2的細胞懸液，該細胞懸液可投加於水體或土壤中用於對乙醯氨基酚的降解；所述LB液體培養基終濃度組成為每升培養中含有酵母粉IOg,蛋白腖5. Og,氯化鈉10. Og,溶劑為去離子水，自然pH值。本發明菌體生長量採用紫外分光光度計來檢測，通過測量菌體(即含菌細胞培養液)在600nm處的吸光度值來表示。本發明採用反相高效液相色譜法檢測無機鹽培養基中對乙醯氨基酚的殘留量。反相高效液相色譜檢測條件流動相為甲醇H20=15:85 (體積比)，分析柱為Grace AlltimaC18色譜柱(4·6Χ250_，5μπι)，流速為O. 8ml/min，進樣量為20 μ 1，柱溫為30°C。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在本發明所述申氏桿菌HZA2可通過直接投加的方式應用於水體和土壤中對乙醯氨基酚的降解，能安全、高效、快速的降解水體、土壤等物體上殘留的對乙醯氨基酚，含有該菌株的菌劑製備工藝簡單，成本低廉，使用方便，具有很好的應用前景。


圖I為本發明申氏桿菌HZA2的電鏡圖；圖2為對乙醯氨基酚的標準曲線圖；圖3為本發明的申氏桿菌HZA2在純培養條件下對濃度為200mg/L的對乙醯氨基酚的降解曲線圖4為本發明的申氏桿菌HZA2在對乙醯氨基酚濃度為200mg/L純培養條件下的生長曲線圖。圖5為溫度對降解率的影響圖。圖6為pH值對降解率的影響圖。圖7為對乙醯氨基酚初始濃度對降解率的影響圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例I :菌株的篩選與鑑定 I)培養基無機鹽培養基的配製=NaCllg, K2HPO4 I. 5g，KH2PO4 O. 5g，(NH4) 2S04 I. 5g，MgSO40. lg，Iml微量元素溶液，去離子水補足至1000ml，混合後攪拌均勻，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(121°C，20min)後製得，其中每升微量元素溶液中含MnSO4 · H2O O. 13g,ZnCl2 O. 23g,CuSO4 · H2O O. 03g, CoCl2 · 6H20 0. 42g, Na2MoO4 · 2H20 0. 15g, AlCl3 · 6H20 0.05g，用去離子水補足至1000ml。富集培養液在無機鹽培養基中加入對乙醯氨基酚，使得對乙醯氨基酚的終濃度為 200mg/L。LB液體培養基的配製酵母粉IOg,蛋白腖5. Og,氯化鈉10. Og,去離子水補足至1000ml，混合後攪拌均勻，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(121°C，20min)後製得。LB固體培養基的配製酵母粉IOg,蛋白腖5. Og,氯化鈉10. Og,瓊脂15. Og,去離子水足至1000ml,混合後攪拌均勻，自然pH值,高壓蒸汽滅菌(12rC,20min)後製得。2)菌株分離純化汙泥樣品採自杭州汙水處理廠，取5ml汙泥樣品置於250ml錐形瓶中，加入IOOml富集培養液，黑暗振蕩培養(30°C，150rpm)l周，取5ml上層濁液於新鮮的富集培養液中，繼續黑暗振蕩培養(30°C，150rpm) I周，重複上述操作過程3次，每次培養的接種物均取自於上次培養所得的培養液。取最後一次培養所得的培養液5ml進行梯度稀釋((10_3、10_4、10_5、10_6)，取各個稀釋後的培養液100 μ I塗布於含200mg/L對乙醯氨基酚的LB固體培養基平板上，置於恆溫培養箱(30°C)中培養，待平板上長出菌落後，挑取各菌落於含200mg/L對乙醯氨基酚的LB固體培養基平板上反覆純化，直至菌落單一，將純化後的各菌落分別接至LB液體培養基試管中振蕩培養(30°C，150rpm)過夜，將培養好的菌液離心後接至富集培養液中培養3d，通過反相高效液相色譜法檢測各富集培養液中對乙醯氨基酚的殘留量，最後篩選獲得一株能高效降解對乙醯氨基酚的菌株，命名為HZA2。3)菌株鑑定將上述獲得的菌株進行形態特徵和分子生物學鑑定，該菌株的電鏡照片如圖I所示。該菌株的主要生物學特徵為菌體杆狀，端生鞭毛，無芽孢，大小約為(0.5 1.0) X(I. 5^2. O) μ m，菌落平坦，中間凸起，邊緣擴散，呈淡黃色，革蘭氏染色反應陰性，能利用澱粉、葡萄糖，乙醯甲基甲醇試驗陰性，V. P.反應陰性，抗氨苄青黴素、卡那黴素，不抗慶大黴素。該菌株最適宜的生長條件pH值為7. O，溫度30°C。該菌株經16S rDNA序列分析鑑定為 Shinella 屬，因此命名為申氏桿菌(Shinella sp. ) HZA2 (CCTCC No: M 2012405)。實施例2 :含菌細胞懸液的製備(I)斜面培養將申氏桿菌HZA2接種於斜面培養基，30°C培養3飛天，獲得菌體斜面；所述斜面培養基的終濃度組成為酵母粉10g，蛋白腖5. 0g，氯化鈉10. 0g，瓊脂20g，去離子水IOOOml ；(2)種子培養從步驟(I)菌體斜面上挑取一接種環菌體接種至無機鹽培養基中，30°C培養3飛天，獲得種子液；所述無機鹽培養基終濃度組成同實施例I ;(3)擴大培養將步驟(2)獲得的種子液以體積濃度1(Γ20%的接種量接種至LB液體培養基(100 mL)中，30°C、150rpm振蕩培養至對數生長期，獲得菌液，將菌液離心(6000rpm，5min)，棄上清，沉澱用pH值為7. O的磷酸緩衝液懸浮，獲得含申氏桿菌HZA2細 胞懸液100 mL，其中細胞懸液中的申氏桿菌HZA2濃度為5X IO8個/ml ;所述LB液體培養基終濃度組成同實施例I ;pH值為7. O的O. 2 mol/L的磷酸緩衝液的配方為取O. 2 mol/L的磷酸二氫鈉39ml和0. 2mol/L的磷酸氫二鈉61ml，用去離子水定容至1000ml，高壓蒸汽滅菌(121°C、20min)後即得。實施例3 :對乙醯氨基酚的降解實驗I)無機鹽培養基中菌體濃度與對乙醯氨基酚含量的檢測菌體生長量採用紫外分光光度計來檢測，通過測量培養液中菌體在600nm處的吸光度值來表不。本實驗採用反相高效液相色譜法檢測無機鹽培養基中對乙醯氨基酚的殘留量。反相高效液相色譜檢測條件流動相為甲醇H20=15:85 (體積比)，分析柱為Grace AlltimaC18色譜柱(4·6Χ250_，5μπι)，流速為0. 8ml/min，進樣量為20 μ 1，柱溫為30°C。2)對乙醯氨基酚降解實驗取4個250ml錐形瓶，加入IOOml無機鹽培養基，高壓蒸汽滅菌(121°C，20min)後加入對乙醯氨基酚，使對乙醯氨基酚濃度均為200 mg/L，各取實施例2方法獲得的含菌細胞懸液5ml (細胞濃度5X IO8個/ml)，分別接種於此無機鹽培養基中，使申氏桿菌HZA2終濃度約為2. 5X IO7個/ml，分別於25，30，35，40°C培養搖床(pH值為7. 0，150rpm)，每小時定時取樣測定殘殘留對乙醯氨基酚濃度。取6個250ml錐形瓶，加入IOOml無機鹽培養基，高壓蒸汽滅菌(121°C，20min)後加入對乙醯氨基酚，使對乙醯氨基酚濃度均為200 mg/L，各取實施例2方法獲得的含菌細胞懸液5ml (細胞濃度5X IO8個/ml)，分別接種於此無機鹽培養基中，使申氏桿菌HZA2終濃度約為 2. 5X IO7個/ml，分別於pH 5. 5,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0，8. 5 培養搖床(30°C，150rpm)，每小時定時取樣測定殘留對乙醯氨基酚濃度。取3個250ml錐形瓶，均加入IOOml無機鹽培養基，高壓蒸汽滅菌(121°C，20min)後加入對乙醯氨基酚，使對乙醯氨基酚濃度均為200 mg/L，各取實施例2方法獲得的含菌細胞懸液5ml (細胞濃度5X IO8個/ml)，分別接種於此無機鹽培養基中，使申氏桿菌HZA2終濃度約為2. 5 X IO7個/ml，相應的設置3個不含該菌種的實驗作為空白對照，然後一同置於搖床(30°C，pH值為7. 0,150rpm)中黑暗振蕩培養。在培養時間為O、l、2、3、4、5、6、7、8h時定時取樣，根據上述檢測方法來檢測無機鹽培養基中菌體的生長量與對乙醯氨基酚的殘留量。將對乙醯氨基酚標準品用無菌水溶解，在反相液相色譜測試標準曲線，對乙醯氨基酚標準曲線如圖2所示，標準曲線方程為y=13. 606X+5. 2807, R2=O. 9994，y為峰面積，x為對乙醯氨基酚濃度)。本發明菌株對200 mg/L濃度的對乙醯氨基酚的降解曲線如圖3所示，菌體的生長曲線如圖4所示，圖4可以看出OD6qq從O. 20增加到O. 65，說明菌體生長良好，觀察圖3，可以發現，培養6h後，本發明的對乙醯氨基酚降解菌對200 mg/L的對乙醯氨基酚的降解率接近為100%，反應液中對乙醯氨基酚的質量殘留量分別為O. 1%，O. 08%和O. 05%所有未加菌的空白對照在6h後的水解率均小於5%。實驗結果表明該菌種對中、高濃度(見圖7)的對乙醯氨基酚具有非常好的降解能力，而且此菌種為新型對乙醯氨基酚降解菌，因此，該菌對研究對乙醯氨基酚的降解途徑與 降解基因具有非常大的促進作用，對環境中對乙醯氨基酚的降解尤其是對對乙醯氨基酚的集中修復具有較大的積極意義。
權利要求
1.申氏桿菌(Shinellasp. ) HZA2，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏日期為2012年10月15日，保藏編號為CCTCC No: M2012405。
2.如權利要求I所述的申氏桿菌HZA2在微生物降解對乙醯氨基酚中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述降解在20 40°C、pH5. 5 8. 5、黑暗條件下進行。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述降解在30°C，pH7. 0、150rpm、黑暗條件下進行。
全文摘要
本發明提供了一株新型高效對乙醯氨基酚降解菌——申氏桿菌(Shinella sp.)HZA2，及其在微生物降解對乙醯氨基酚中的應用。該菌株保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏日期為2012年10月15日，保藏編號為CCTCC No: M 2012405。本發明所述申氏桿菌HZA2可通過直接投加的方式應用於水體和土壤中對乙醯氨基酚的降解，能安全、高效、快速的降解水體、土壤等物體上殘留的對乙醯氨基酚，含有該菌株的菌劑製備工藝簡單，成本低廉，使用方便，具有很好的應用前景。
文檔編號C12R1/01GK102965310SQ20121046068
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者馬雲, 劉學虎 申請人:浙江工業大學