用於鑑定草莓種質資源炭疽病抗性的引物序列及其鑑定方法
2023-09-22 06:42:45
用於鑑定草莓種質資源炭疽病抗性的引物序列及其鑑定方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於鑑定草莓種質資源炭疽病抗性的引物序列及其鑑定方法。該方法以甜查理、達賽萊克特為雜交親本進行常規雜交獲得的雜交後代等250份材料的基因組DNA為模板，通過對覆蓋全基因組146對SSR引物和64對AFLP引物進行PCR擴增並結合PAGE膠電泳分析，建立了草莓炭疽病抗性的特異遺傳圖譜，成功獲得10對特異性高、在雜交後代顯性強的SSR引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1~20所示。應用本發明方法獲得的引物序列進行草莓種質資源炭疽病抗性的鑑定，其鑑定結果與田間抗病吻合率高達88.4%，該方法具有簡單、快速、高效，提高育種效率，縮短育種周期等優點，在草莓種質資源炭疽病抗性的鑑定上具有很大的應用價值。
【專利說明】用於鑑定草莓種質資源炭疸病抗性的引物序列及其鑑定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一類用於鑑定草莓種質資源炭疽病抗性的引物序列及其鑑定方法。
【背景技術】
[0002]由炭疽病病菌(Colletotrichumn spp.)引起的草莓炭疽病是一種世界毀滅性病害，截至目前仍有許多國家的草莓生產上存在著該病的大面積危害。炭疽病可以危害草莓的莖、葉柄、葉片、果實、花、花芽、萼片等器官，不僅可造成嚴重的經濟產量的損失，而且有的病殘體含有較多的真菌毒素，嚴重地威脅著人們的食品安全。
[0003]草莓炭疽病於1832年在法國首次發現，距今已180年。有關草莓炭疽病病菌抗性鑑定的研究已經有一些報導。種質資源的抗逆性鑑定對於水果科研育種和生產都非常重要，單一根據田間表型性狀來區分種質資源的抗逆性在多數情況下都很困難。DNA分子標記提供了物種根本的遺傳特徵，是不同物種遺傳變異的直接反映，因此成為種質資源鑑定最有效途徑。目前，有5種常見分子標記技術應用於品種抗逆性鑑定，包括RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SCAR 標記。
[0004]建立在PCR基礎上的分子鑑定技術是鑑定草莓炭疽病快速和準確的方法。Xiao等(2004)通過提取病原菌的 DNA並利用病菌ITS的RAPD分子標記進行病原菌遺傳分析，以感病的草莓和非栽培寄主為材料鑑定了 C.gloeosporioides和C.acutatum的遺傳關係。Denoyes-Rothan等(2005)設計了 8X8因子試驗研究草莓炭疽病C.acutatum種的遺傳特性，認為儘管微效多基因會影響草莓的抗性水平，但高水平抗性仍然被認為單基因控制，屬於質量性狀遺傳。作者分析了 26個不同品種(基因型)，結果發現栽培草莓的炭疽病抗性遺傳為顯性基因，草莓屬其它種 類的遺傳特性相似，對草莓炭疽病抗性育種有指導意義。
[0005]隨著紅顏、章姬、豐香等品質好易感病草莓品種栽培面積的不斷擴大，炭疽病侵害範圍也在蔓延，如今已經成為草莓生產的第一大病害。因此創製與紅顏果實品質媲美的抗病草莓新種質已成為迫在眉睫的問題。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題在於提供一種用於鑑定草莓種質資源炭疽病抗性的引物序列及其鑑定方法。
[0007]自1990年以來，上海農科院草莓課題組一直進行著草莓種質資源收集、評價與種質創製工作，並取得了 440餘份具有潛在應用價值的種質。抗病性品種大都是通過傳統雜交育種獲得，對炭疽病病原菌免疫的種質在雜交後代中不會輕易產生；更重要的是抗病雜交後代攜帶有其它不良性狀基因，特別是多基因控制的抗病性的遺傳，常常造成育種效率較低。抗病性鑑定是抗病育種的重要環節，建立準確可靠的抗病性鑑定方法是提高抗病育種效率的重要途徑。有關草莓炭疽病抗性鑑定方法迄今已經有許多報導，大都是將炭疽病病菌接種在發育植株上，然後依據一定的分級標準統計感病情況進行鑑定。在培育抗病品種時，要正確判斷雜交親本的抗病性，必須有正確的抗性評價鑑定方法。因此，基於上海農科院草莓課題組特異抗性種質的特異分子標記對高抗和高感親本及其雜交後代群體的抗病性分子鑑定，對於育種科學家和草莓的生產管理均具有重要應用價值。
[0008]本發明在對覆蓋栽培草莓全基因組210對標記引物(146對SSR引物和64對AFLP引物)篩選的基礎上獲得65份材料中可產生特異、穩定多態性、帶型組合易識別、在其後代顯性好的10對SSR引物，應用這10對引物以寶交早生、甜查理、達賽萊克特等為雜交親本及其常規雜交獲得的245份隨機後代群體為材料，成功鑑定出炭疽病抗性後代。
[0009]本發明利用與抗性基因連鎖的分子標記進行基因型驗證，使受鑑定材料成為可以用於草莓炭疽病抗性育種的種質材料。為了進行寶交早生、甜查理、達賽萊克特及其雜交後代群體材料中炭疽病抗性的快速鑑定評價，本發明致力於全基因組範圍篩選特異SSR標記指紋和AFLP分子標記，成功獲得了能夠鑑別親本及其雜交後代群體的高度特異、穩定遺傳的SSR、AFLP分子標記圖譜。依據這些圖譜，僅需應用散布於全基因組的10對特異SSR引物，針對樣品DNA進行PCR擴增，後經PAGE電泳分析，即可快速鑑別是否親本及其雜交後代品系的炭疽病抗性。利用獲得的這10對特異SSR引物對親本及其雜交群體共245份隨機材料進行草莓炭疽病抗性的分子鑑定，結合田間抗感遺傳表型的一致性，結果發現獲得的這10對特異SSR引物可將供試材料中抗病品種或優系與感病品種或優系區分開來，與室內接種鑑定、田間遺傳表型的一致性可達到88.4%。
[0010]本發明所述的草莓種質資源炭疽病抗性的鑑定方法的工藝流程如圖1所示，具體包括以下步驟:
[0011]I)首先，從草莓基因組資料庫網站 GDR(Genome Database for Rosaceae, http://WWW.rosaceae.0rg/)與全基因組範圍、遵循平均分布原則設計分子標記引物,共設計併合成了 210對標記引物,包括64個AFLP標記，146個SSR標記,具體參看表1。
[0012]表1草莓炭疽病抗性篩選SSR和AFLP分子標記引物及序列
`[0013]
【權利要求】
1.用於鑑定草莓種質資源炭疽病抗性的引物序列，由上遊引物和下遊引物組成，其特徵在於，上下遊引物的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1、2所示，或如SEQ ID N0.3、4所示，或如SEQ ID N0.5、6所示，或如SEQ ID N0.7、8所示，或如SEQ ID N0.9、10所示，或如SEQID N0.11、12 所示，或如 SEQID N0.13、14 所示，或如 SEQ ID N0.15、16 所示，或如 SEQ IDN0.17、18 所示，或如 SEQ ID N0.19,20 所示。
2.—種草莓種質資源炭疽病抗性的鑑定方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)草莓全基因 組SSR/AFLP引物的設計與合成以及草莓基因組DNA提取； 2)確定SSR/AFLP引物的最優PCR條件、電泳展示差異時間及染色顯色方法並進行預篩選; 3)針對預篩選獲得的14對SSR標記引物進行PCR擴增並結合PAGE電泳分析進行全面篩選； 4)對預篩選獲得的14對SSR標記引物進行PCR擴增電泳分析進行重複篩選以驗證遺傳穩定性； 5)將全面篩選獲得的10對SSR標記引物分別進行草莓炭疽病抗性的鑑定。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的14對SSR標記引物分別由上遊引物和下遊引物組成，上下遊引物的核苷酸序列分別如⑴SEQID N0.1、2K*，(2)SEQ IDN0.3、4所示，(3)SEQ ID N0.5、6所示，(4)SEQID N0.7、8所示，(5)SEQ ID N0.9、10所示，(6)SEQID N0.11、12 所示，(7) SEQID N0.13、14 所示，(8) SEQ ID N0.15、16 所示，(9) SEQ ID N0.17、18 所示，(10) SEQ ID N0.19、20 所示，(11) SEQ ID N0.21、22 所示，(12) SEQ ID N0.23、24 所示，(13)SEQ ID N0.25、26 所示，(14) SEQ ID N0.27、28 所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667427SQ201210330786
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月7日 優先權日:2012年9月7日
【發明者】高清華, 葉正文, 段可, 鄭宏清, 李靜, 劉建成, 傅弘平 申請人:上海市農業科學院