環脂酸芽孢桿菌顯色培養基及其使用方法和用途的製作方法

2023-09-22 15:07:05

專利名稱：環脂酸芽孢桿菌顯色培養基及其使用方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物顯色培養基，特別涉及一種用於檢測環脂酸芽孢桿菌的顯色培養基，及其使用方法和用途。屬於食品衛生微生物安全檢驗與監測領域，特別是果蔬汁中環脂酸芽孢桿菌的檢測。
背景技術：
環脂酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus spp.)是廣泛存在於自然界中的一群耐熱、 嗜酸並可形成芽孢的桿菌，該類菌在酸性環境(如果蔬汁中)生長良好，其芽孢能經受酸性條件下的巴氏殺菌過程仍能存活。1971年，Barland和Brock在酸熱環境中分離到酸熱脂環芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius)，該菌細胞膜中具有獨特的ω-環己烷脂肪酸結構，且這種菌只在酸熱的環境中存在。1984年Cerny等從腐敗的蘋果汁中也分離出一株細胞膜中含ω-環己烷脂肪酸結構的芽孢桿菌，經研究確認該菌就是導致果汁腐敗的微生物。1992年Wisotzkey等人根據16SrDNA基因序列分析結果，將它們從芽孢桿菌屬 (Bacillus)中劃分出來，創立一個新屬，命名為環脂酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)， 又名脂環酸芽孢桿菌(Wisotzkey J. D.，Peter J. R.，George Ε. F.等，Compatative sequence analyses on the 16SRNA(rDNA) of Bacillus acidocaldariu, Bacillus acidoterrestris,and Bacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new genus, Alicyclobacillus gen.nov.Int J Syst Bacteriol,1992,42 (2) :263 269.)。 儘管該類菌對人類健康並不造成直接危害，但由其形成的芽孢萌發後在代謝過程中產生愈創木酚和滷酚，IX 10_12的含量就能造成果汁風味敗壞並產生輕微沉澱，如何消除該菌引起的果汁腐敗成為果蔬加工業關注的主要問題(Yvette Smit, Michelle Cameron, Pierre Venter Alicyclobacillus spoilage and isolation-A review. Food Microbiology, 2011，28 (3) 331 349.)。目前對環脂酸芽孢桿菌的檢測以傳統方法為主，如日本果汁協會耐酸耐熱菌統一檢測方法、美國庫克實驗室耐熱耐酸菌的檢測方法、國際果汁生產者聯盟推薦的方法等，這些檢測方法差別不大，主要表現在每種方法採用的培養基不相同，涉及到的培養基包括K 氏 京月旨、YSG(yeast starch glucose) 京月旨、ΒΑΤ 京月旨(Bacillus acidoterrestris agar)> BAM 培養基(Bacillus Acidocaldarius medium)、OSA 培養基(orange serum agar)、 PDA(patato destrose agar)等。BAM培養基是分離出第一株環脂酸芽孢桿菌使用的培養基，主要用於分離柑橘環脂酸芽孢桿菌(A.heSperidum)、環脂酸芽孢桿菌基因種1(A. genomic species 1)、環脂酸芽孢桿菌基因種2 (A. genomic species 2)和環庚基環脂酸芽孢桿菌(A. cycloh印tanicus)，也用於生長特性測定實驗；OSA (orange serum agar)用於分離桔汁中的微生物，也包括環脂酸芽孢桿菌；PDA培養基分離的環脂酸芽孢桿菌具有良好再生性，但必須將pH值調至3. 5 ；YSG用於分離酸性飲料中的環脂酸芽孢桿菌，是目前日本NDM公司採用的培養基(嶽田利等，脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus)分離鑑定研究進展，2008，29卷，第2期，487-492) ；K氏培養基對環酯酸芽孢桿菌屬內多個種具有較高回收率，是美國庫克實驗室、雀巢公司採用的培養基，經AOAC測試，由於它能更快速地得到目標菌而且對菌株有良好的再生性，成為目前應用最為廣泛的培養基，也是國際果汁生產者聯合會(IFU)標準方法中推薦的培養基(Method on the Detection of Taint Producing Alicyclobacillus in Fruit Juice, International Federation of Fruit Juice Producters，IFU，2007. )。Chang等還對K氏培養基進行了改良，通過優化，改良後的SK瓊脂比K氏培養基具有更高靈敏度和低檢測限(Chang，S. S，Kang，D. H. . Development of novel Alicyclobacillus spp. isolation medium. J. Appl. Microbiol.,2005,99 (5) 1051 1060.)。然而，上述所有培養基的共同點表現在實驗結果判斷主要依據環脂酸芽孢桿菌在pH < 4. 0時生長良好，而在中性pH值時不生長，但是，實際上在除環脂酸芽孢桿菌以外其他某些芽孢桿菌也能在該PH值條件下生長，這容易導致檢測過程中出現假陽性結果；此外，實驗過程中如果汙染其他耐酸菌如酵母菌等生長後會帶來的不必要的後續鑑定工作， 因此，目前檢測環脂酸芽孢桿菌的培養基存在相同缺陷就是缺乏足夠特異性，而且不同培養基在支持環脂酸芽孢桿菌屬的各個種的生長方面表現出很大差異，如，應用最為廣泛的K 氏培養基對引起果汁腐敗的主要菌酸土環脂酸芽孢桿菌(A. acidoterrestris)和酸熱環脂酸芽孢桿菌(A. acidocaldarius)具有較好的生長支持，但對其他環脂酸芽孢桿菌生長支持則較差。因此，本領域需要一種對環脂酸芽孢桿菌生長支持能力強且具有高特異性的檢測
培養基。

發明內容
針對目前用於檢測環脂酸芽孢桿菌的培養基生長支持能力弱和特異性差的缺陷， 本發明提供了一種對於環脂酸芽孢桿菌生長支持能力強且具有高特異性的培養基及其使用方法和用途。—方面，本發明提供了一種用於檢測環脂酸芽孢桿菌的顯色培養基，所述培養基包含A組分、B組分以及C組分，其中，所述A組分包含以重量份計的下述物質
酵母提取物2至4份，
葡萄糖5至10份，
CaCl2. 2H200. 25 至 0. 4 份，
MgSO4. 7H200. 3 至 0. 5 份，
(NH4)2SO40. 1 至 0. 3 份，
KH2PO42. 5 至 3. 5 份，
所述B組分包含以重量份計的下述物質
瓊脂15至20份，
β-半乳糖苷酶底物0. 08 至 0. 12 份，
所述C組分為1個重量份，該c組分包含以3
ZnSO4. 7Η200. 18 XlO-3SO. 2 XlCT3
CuSO4. 5Η200. 16 XlQ-3SO. 18X10-3份，
MnSO4. H2O0. 15 X 1(Γ3 至 0. 17 X 1(Γ3 份，COCl2. 6Η200. 18 X 1(Γ3 至 0· 2 X 1(Γ3 份，H3BO30. 1 X 1(Γ3 至 0· 12 X 1(Γ3 份，NaMoO4. 2Η200· 3 X 1(Γ3 至 0· 5 X 1(Γ3 份。在一種優選的實施方式中，根據上文所述的培養基中包含A組分、B組分以及C組分，其中，糖苷。
所述A組分包括以重量份計的下述物質 酵母提取物3份，
葡萄糖8份，
CaCl2. 2Η200. 3 份，
MgSO4. 7Η200. 4 份，
(NH4)2SO40.2 份，
KH2PO43 份，
所述B組分包括以重量份計的下述物質 瓊脂18份，
β-半乳糖苷酶底物 0.1份， 所述C組分包括以重量份計的下述物質 ZnSO4. 7Η200·19Χ1(Γ3 份，
CuSO4. 5Η200·17Χ1(Γ3 份，
MnSO4. H2O0·16Χ1(Γ3 份，
COCl2. 6Η200·19Χ1(Γ3 份，
H3BO30· 11X101，
NaMoO4. 2Η200·4Χ1(Γ3 份。
優選地，本發明使用的β _半乳糖苷酶底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳
另一方面，本發明提供了使用本發明所述的培養基檢測環脂酸芽孢桿菌的方法， 所述方法包括下述步驟(1)製備顯色平板將本發明所述的培養基添加至水中，加熱溶解，調節PH值至 2. 5至6，高壓滅菌，冷卻後制板；(2)樣品接種培養將樣品處理液或經增菌過的樣品處理液塗布或劃線接種於步驟(1)製得的顯色平板上，45至50°C的溫度下培養24至48小時；(3)結果分析若平板上出現淺綠色或綠色菌落，說明樣品中存在環脂酸芽孢桿菌。在一種優選的實施方式中，根據上文所述檢測環脂酸芽孢桿菌的方法中，所述步驟(1)中製備顯色平板的步驟包括下述操作過程將本發明所述的培養基的A組分添加至水中，加熱溶解，調節pH值至2. 5至6，然後高壓滅菌；將本發明所述的培養基的B組分添加至水中，加熱溶解，然後高壓滅菌；按照如下配比配製本發明所述的培養基的C組分的母液
ZnSO4.7Η200. 18 至 0· 2 份，
CuSO4.5Η200. 16 至 0. 18 份，
MnSO4.H2O0. 15 至 0. 17 份，
COCl2.6Η200. 18 至 0. 2 份，
H3BO30. 10 至 0. 12 份，
NaMoO,2H2O0.3 至 0.5 份。
水1000 份，
過濾除菌獲得C組分的母液，
將經高壓滅菌的所述A組分和所述B組分進行混合，然後添加1個重量份的所述
C組分母液，進一步混合，用於制板。優選地，根據上文所述檢測環脂酸芽孢桿菌的方法所述步驟(1)中，將所述培養基的PH值調節至4。優選地，根據上文所述檢測環脂酸芽孢桿菌的方法所述步驟(1)中按照如下配比配製本發明所述的培養基的C組分的母液ZnSO4. 7H20 0. 19 份，CuSO4. 5Η20 0. 17 份，MnSO4. H2O 0. 16 份，COCl2. 6H20 0. 19 份，H3BO30.11 份，NaMoO4. 2Η20 0. 4 份，水1000 份，過濾除菌獲得C組分的母液。優選地，根據上文所述檢測環脂酸芽孢桿菌的方法所述步驟O)中的培養溫度為 50°C和/或培養時間為48小時。又一方面，本發明提供了本發明所述的培養基用於檢測果蔬汁中環脂酸芽孢桿菌的用途。優選地，本發明所述的培養基用於檢測蘋果汁中的環脂酸芽孢桿菌。本發明通過選擇對環脂酸芽孢桿菌具有良好營養支持能力的組分，並根據環脂酸芽孢桿菌在生長代謝過程中會產生半乳糖苷酶的特性，選用半乳糖苷酶底物作為代謝指示劑，與支持環脂酸芽孢桿菌生長的多種營養物質組合使用開發出了對環脂酸芽孢桿菌具有良好支持能力並且具有高特異性的環脂酸芽孢桿菌顯色培養基，使目標菌在分離的同時得到有效鑑別，該培養基操作簡便，價格低廉，具有很好的應用推廣前景。
具體實施例方式本發明所述用於檢測環脂酸芽孢桿菌的顯色培養基中，酵母提取物為環脂酸芽孢桿菌的生長提供豐富的維生素，葡萄糖提供了環脂酸芽孢桿菌生長所需的碳源，痕量礦物質可以進一步刺激環脂酸芽孢桿菌的生長。β-半乳糖苷酶底物為該培養基的特異性指示劑。已知的半乳糖苷酶底物有2-羥苯基-β-D-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷等。本發明使用的β -半乳糖苷酶底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(Χ-β-D-gal)，菌落色澤對比明顯，通用性較強，在國內外未曾用於環脂酸芽孢桿菌的檢測。另外，在檢測過程中低PH—方面滿足環脂酸芽孢桿菌對低pH的需求，同時也可抑制其他細菌的生長。另外，本發明還使用了三種培養基(BAT、YSG以及K氏)作為對照以驗證本發明顯色培養基的效果，該三種培養基均為目前使用較廣泛且對於環脂酸芽孢桿菌營養支持能力較強的培養基。本發明使用了如下實驗材料與設備所有環脂酸芽孢桿菌均來自美國模式培養物集存庫(American type culture collection,縮寫ATCC)。
酵母提取物北京奧博星(注用於配製培養基的其他來源的酵母
提取物均可以用於本發明)葡萄糖SigmaΧ-β-D-galSigmaCaCl2.2H20SigmaMgSO4.7H20Sigma(NH4)2SO4SigmaKH2PO4Sigma瓊脂浙江洞頭長坑化工廠BAT肉湯北京奧博I■生物技術有限公司YSG肉湯北京奧博I■生物技術有限公司TSB肉湯北京奧博屋I生物技術有限公司對照用培養基BAT北京奧博星生物技術有限公司YSG北京奧博星生物技術有限公司K氏培養基北京奧博星生物技術有限公司上述BAT肉湯、YSG肉湯以及三種對照用培養基均根據製造商提供的說明書進行配製。培養箱日本三洋下面結合實施例來描述本發明。實施例實施例1 本發明環脂酸芽孢桿菌顯色培養基的配製按下表1所列的A組分各亞組分物質用量數據來配製四份A組分(分別編為1-4 號)，分別添加去離子水至終體積為500mL，加熱溶解，用INH2SO4或者IN NaOH調節pH值至
9表2中所述數值，然後121°C高壓滅菌15分鐘後取出備用。表1:A組分用量
權利要求
1. 一種用於檢測環脂酸芽孢桿菌的顯色培養基，其特徵在於，所述培養基包含A組分、 B組分以及C組分，其中，所述A組分包含以重量份計的下述物質酵母提取物葡萄糖 CaCl2. 2H20 MgSO4. 7H20 (NH4)2SO4 KH2PO42至4份， 5至10份， 0. 25 至 0. 4 份， 0. 3 至 0. 5 份， 0. 1 至 0. 3 份， 2. 5 至 3. 5 份， 所述B組分包含以重量份計的下述物質 瓊脂15至20份，β -半乳糖苷酶底物 0. 08至0. 12份， 所述C組分為1個重量份，該C組分包含以重量份計的下述物質0. 18Χ10-3 至 0.2Χ10-3 份， 0. 16 XlO-3SO. 18 XlCT3 份， 0. 15X10-3 至 0. 17 XlCT3 份， 0. 18X10-3 至 0.2X10-3 份， ο. ιχ (Γ3 至 ο. 12 Xicr3 份， 0.3X10-3 至 0.5X10-3 份。
2.根據權利要求1所述的培養基，其特徵在於，所述培養基包含A組分、B組分以及C 組分，其中，所述A組分包括以重量份計的下述物質ZnSO4. 7Η20 CuSO4. 5Η20 MnSO4. H2O COCl2. 6Η20 H3BO3NaMoO4. 2Η20酵母提取物葡萄糖 CaCl2. 2Η20 MgSO4. 7Η20 (NH4)2SO43份， 8份，KH2PO40. 3 份， 0. 4 份， 0.2 份，3份，其所述B組分包括以重量份計的下述物質 瓊脂18份，β -半乳糖苷酶底物 0. 1份，所述C組分為1個重量份，該C組分包含以重量份計的下述物質ZnSO4.7Η200.19X10—3份，CuSO4.5Η200.17X10—3份，MnSO4.H2O0.16X10—3份，COCl2.6Η200.19X10—3份，H3BO30.11X10—3份，NaMoOi」 2Η200.4Χ1(Γ3份。
3.根據權利要求1或2所述的培養基，其特徵在於，其中所述半乳糖苷酶底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷。
4.一種使用權利要求1至3任一項所述的培養基檢測環脂酸芽孢桿菌的方法，其特徵在於，所述方法包括下述步驟(1)製備顯色平板將權利要求1至3任一項所述的培養基添加至水中，加熱溶解，調節ρΗ值至2. 5至6，高壓滅菌，冷卻後制板；(2)樣品接種培養將樣品處理液或經增菌過的樣品處理液塗布或劃線接種於步驟 (1)製得的顯色平板上，45至50°C的溫度下培養24至48小時；(3)結果分析若平板上出現淺綠色或綠色菌落，說明樣品中存在環脂酸芽孢桿菌。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中製備顯色平板的步驟包括下述操作過程將權利要求1至3任一項所述培養基的A組分添加至水中，加熱溶解，調節ρΗ值至2. 5 至6，然後高壓滅菌；將權利要求1至3任一項所述培養基的B組分添加至水中，加熱溶解，然後高壓滅菌；按照如下配比配製權利要求1至3任一項所述培養基的C組分的母液ZnSO4. 7H20 0. 18 至 0. 2 份，CuSO4. 5H20 0. 16 至 0. 18 份，MnSO4. H2O 0. 15 至 0. 17 份，COCl2. 6H20 0. 18 至 0. 2 份，H3BO30. 1 至 0. 12 份，NaMoO4. 2Η20 0. 3 至 0. 5 份，水1000份，過濾除菌獲得C組分的母液，將經高壓滅菌的所述A組分和所述B組分進行混合，然後添加1個重量份的所述C組分母液，進一步混合，用於制板。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中將所述培養基的ρΗ 值調節至4。
7.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中製備顯色平板的步驟包括按照如下配比配製權利要求1至3任一項所述培養基的C組分的母液ZnSO4. 7H20 0. 19 份， CuSO4. 5Η20 0. 17 份， MnSO4. H2O 0. 16 份， COCl2. 6H20 0. 19 份， H3BO30.11 份，NaMoO4. 2Η20 0. 4 份， 水1000份，過濾除菌獲得C組分的母液。
8.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中的培養溫度為50°C 和/或培養時間為48小時。
9.權利要求1至3任一項所述的培養基用於檢測果蔬汁中環脂酸芽孢桿菌的用途。
10.根據權利要求9所述的用途，其特徵在於，所述果蔬汁為蘋果汁。
全文摘要
本發明涉及用於檢測環脂酸芽孢桿菌的顯色培養基及其使用方法和用途，該培養基包含A組分、B組分以及C組分，其中，所述A組分包含以重量份計的下述物質酵母提取物2至4份，葡萄糖5至10份，CaCl2.2H2O0.25至0.4份，MgSO4.7H2O 0.3至0.5份，(NH4)2SO4 0.1至0.3份，KH2PO4 2.5至3.5份，所述B組分包含以重量份計的下述物質瓊脂15至20份，β-半乳糖苷酶底物0.08至0.12份，所述C組分為1個重量份，該C組分包含以重量份計的下述物質ZnSO4.7H2O 0.18×10-3至0.2×10-3份，CuSO4.5H2O0.16×10-3至0.18×10-3份，MnSO4.H2O 0.15×10-3至0.17×10-3份，COCl2.6H2O0.18×10-3至0.2×10-3份，H3BO3 0.1×10-3至0.12×10-3份，NaMoO4.2H2O0.3×10-3至0.5×10-3份。本發明的顯色培養基對環脂酸芽孢桿菌具有良好的生長支持能力，並且能夠以高特異性檢測出目標菌。
文檔編號C12Q1/04GK102251015SQ201110179218
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者勞華均, 張琦, 楊海榮, 趙勇勝, 趙貴明, 陳穎 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院