物質的檢測方法

2023-09-27 06:22:50

專利名稱：物質的檢測方法
技術領域：
本發明涉及檢測特定物質的方法、檢測特定物質的試劑以及檢測特定物質的儀器。
作為確認蛋白質功能的方法，是從探索與蛋白質有親和性的物質開始，然後利用生物，從基因上控制該蛋白質的表達，對蛋白質的作用進行推測而進行的，但重要的是待檢測蛋白質和物質的親和性。這樣的方法有將純化的蛋白質固定於載體上，裝到柱子中，使推測與該蛋白質有不同親和性的物質通過柱子，對它們通過還是吸附於柱子上進行檢測的方法。
近年來作為這樣有效的方法開發了固定蛋白質的晶片[BioEssays，21，781(1999)]。該晶片使用半導體技術，使特定的蛋白質結合於晶片上的特定部位，然後通過使樣品接觸該晶片，使物質結合蛋白質，通過標記檢測該結合的方法，使用半導體晶片，往往需要微細加工，另外要想檢測固定於晶片上的蛋白質是通過什麼彼此結合時是不可能的，另外一旦做成晶片，要想很容易地追加其它種類的蛋白質也是不可能的，就需要再製造晶片。
另外晶片目前正被用於檢查基因的變異、疾病診斷、藥物的效果以及副作用的抑制。然而由於基因的變異是多種多樣的，需要準備多種DNA序列，檢測各自雜交的DNA。使用DNA晶片的目的是解決這些問題，但存在著與上述相同的問題。
另外至於微珠陣列(ビ一ズアレイ)已知有如下的方法，即使2～3種螢光色素以不同的比例浸漬數μm大小的微珠(ビ一ズ)，該浸漬微珠發出的螢光用2個波長進行解析，將兩個波長的螢光強度的比作為各個微珠的判別裝置，對應蛋白質、DNA序列等待檢測物質在結合或雜交後在微小的空穴捕獲顆粒之後，通過螢光強度進行解析的方法[美國專利第5843767號，Analytical Chemistry，70(7)，1242(1998)]等。然而由於該方法使用開有微小空穴的特殊裝置，在測定中需要很高的技術，由於通過雙波長的螢光強度比的微妙差別進行識別，所以存在著判別能力低，不能適應於各種各樣的蛋白質或數萬種之多的DNA，以及在微小檢測用微孔納入顆粒時，存在著來自檢測樣品的灰塵或周邊環境掉下的灰塵等混入時成為噪音等問題。就這些方法來說，還存在著藉助什麼裝置或不藉助裝置蛋白質之間具有的親和性也不能直接進行檢測的缺點。
因此期待著廉價且通用性高的特定物質的檢測方法的開發。
本發明人發現在微小載體上加上從外部可讀取的信號A，準備多種可與載體結合的具有與蛋白質或DNA等待檢測物質結合能力的物質(以下稱之為結合子)，使它們與載體混合，與檢測樣品中的物質結合，使新的信號B形成，通過比較簡單的裝置可大致同時檢測信號A和信號B，通過對比進行解析，即使不使用蛋白質或DNA晶片等價格高的裝置，也可以檢測各種蛋白質和DNA序列等待檢測特定物質，使得本發明完成。
就是說，根據本發明方法，通過帶有信號A的載體和檢測裝置，即便沒有高度的蛋白質或DNA晶片技術也可以通過使具有與待檢測物質結合能力的物質結合於載體，獲得與蛋白質或DNA晶片同樣的結果。本發明的特徵是即使在對很多完全不同的物質進行同樣檢測的情況下，準備多個帶有相當於該物質種類的信號的載體簡單，而且信號和序列組合可以由實驗者自由地決定。而使用蛋白質或DNA晶片時，當檢測樣品的種類等改變時，必須要改變蛋白質或DNA晶片，要重新製造，所以無通用性，而本發明的載體可以利用以往方法使所希望的蛋白質或DNA等物質結合於蛋白質或DNA等物質不能結合的載體上來製作，廉價而且簡單地對應於很多種物質。
本發明涉及到以下(1)～(36)項。
(1)樣品中待檢測物質的檢測方法，其特徵為作為懸浮於溶液且貫流於在可檢測信號A和信號B的信號檢測裝置中形成的信號檢測用中空管時，相對於中空管的橫斷面具有不重複移動形狀的載體，藉助或不藉助間隔臂與對待檢測物質有結合能力的物質(以下省略為結合子)結合的帶有可識別信號A的載體與含有待檢測物質的樣品在溶液中混合，使待檢測物質與該結合子結合，通過該結合使信號B在載體上形成後，通過與該中空管連通的溶液供應裝置使該載體懸浮液在該中空管中貫流，利用該信號檢測裝置檢測信號A和信號B，將信號A和信號B聯繫起來。
(2)上述(1)記載的檢測方法，其中待檢測物質是具有特定鹼基序列的物質，結合子是具有與待檢測物質的鹼基序列或其部分序列互補的鹼基序列的物質。
(3)上述(2)記載的檢測方法，其中待檢測物質和結合子的結合是通過互補鹼基序列的雜交進行的。
(4)上述(3)記載的方法，其中可識別的信號A是與結合子鹼基序列有關的信號。
(5)上述(3)記載的方法，其中載體是帶有與結合子的鹼基序列有關的可相互識別的信號A，含有相互不同的信號A的多個載體的混合物。
(6)上述(2)～(5)任一項記載的方法，其中結合子是鹼基數為5～500的DNA、RNA或PNA。
(7)上述(3)～(6)任一項記載的方法，其中載體上信號B的形成是通過使可識別結合子鹼基序列與待檢測物質鹼基序列雜交的帶有標記的化合物結合實現的。
(8)上述(7)記載的方法，其中可識別雜交的帶有標記的化合物是使具有與待檢測物質含有的、與結合子鹼基序列相對應的互補序列以外的剩餘鹼基序列互補的鹼基序列的化合物和標記化合物結合的化合物。
(9)上述(8)記載的方法，其中具有與待檢測物質含有的與結合子鹼基序列相對應的互補序列以外的剩餘鹼基序列互補的鹼基序列的化合物是鹼基數為5～500的DNA、RNA或PNA。
(10)上述(7)記載的方法，其中可識別雜交的帶有標記的化合物是使識別該雜交的抗體和標記化合物結合的化合物。
(11)上述(7)記載的方法，其中可識別雜交的帶有標記的化合物是使識別該雜交的嵌入劑和標記化合物結合的化合物。
(12)上述(11)記載的方法，其中包括將沒有與載體結合的帶有標記的化合物與載體分離的工序。
(13)上述(7)～(12)任一項記載的方法，其中標記化合物是螢光物質、發光物質、酶或通過酶發螢光或發光的化合物。
(14)上述(13)記載的方法，其中載體是使發螢光物質結合的載體，標記化合物是通過能量轉移發螢光的化合物。
(15)上述(7)記載的方法，其中可識別雜交的帶有標記的化合物是通過嵌入生成信號B的化合物。
(16)上述(1)記載的方法，其中結合子是具有與待檢測物質結合能力的蛋白質。
(17)上述(1)～(16)任一項記載的方法，其中可識別信號A是數位訊號。
(18)上述(17)記載的方法，其中數位訊號A是磁學或光學上的信號。
(19)上述(17)記載的方法，其中數位訊號A是條形碼。
(20)上述(1)～(19)任一項記載的方法，其中中空管的形狀是圓柱形，而且載體是具有比中空管的內徑小的外形的圓柱形，該圓柱形的長度比中空管的內徑大。
(21)上述(1)～(20)任一項記載的方法，其中載體是圓柱形或球形。
(22)上述(21)記載的方法，其中載體內部存在磁性粒子。
(23)上述(1)～(22)任一項記載的方法，其中載體是圓柱形，外徑直徑為1μm～2mm，長度為10μm～2cm。
(24)上述(1)～(23)任一項記載的方法，其中載體的比重為0.8～2.0。
(25)上述(1)～(24)任一項記載的方法，其中載體的表面是用樹脂包被的。
(26)一種藉助或不藉助間隔臂和具有與待檢測物質結合能力的結合子結合的帶有可識別信號A的載體。
(27)上述(26)記載的載體，其中結合子是含有與待檢測鹼基序列或其部分序列互補的鹼基序列的物質。
(28)上述(26)的載體，其中結合子是具有與待檢測物質結合能力的蛋白質。
(29)上述(26)～(28)任一項記載的載體，是內部存在磁性粒子的載體。
(30)上述(26)～(29)任一項記載的載體，其中信號A是數位訊號。
(31)上述(30)記載的方法，其中數位訊號A是條形碼。
(32)上述(26)～(31)任一項記載的載體，其中載體是圓柱形或球形的。
(33)上述(26)～(32)任一項記載的載體，其中載體是圓柱形，外徑直徑為1μm～2mm，長度為10μm～2cm。
(34)上述(26)～(33)任一項記載的載體，其中載體的比重為0.8～2.0。
(35)上述(26)～(34)任一項記載的載體，其中載體的表面是用樹脂包被的。
(36)特定物質的檢測裝置，其特徵為具有信號檢測裝置、數據輸入裝置、數據處理裝置和數據輸出裝置，該信號檢測裝置具備信號檢測器A和B，這兩個檢測器可檢測處於載體上的至少兩種信號A和B，該載體藉助或不藉助間隔臂和具有與待檢測的鹼基序列或其部分序列互補的鹼基序列的結合子結合；該信號檢測器A和B具有使該載體貫流的中空管，而該載體具有相對於該中空管的橫斷面不重複移動的結構；該數據處理裝置具備以下功能通過特定與從數據輸入裝置輸入的載體上信號A有關的待檢測特定物質的數據和信號檢測裝置檢測的信號A和B，使載體上信號A和該特定物質建立聯繫，將該相關的數據輸出到數據輸出裝置。
以下對本發明進行詳細地說明。
在本發明中作為載體是懸浮於溶液中且貫流於可檢測信號A和信號B的信號檢測裝置中形成的信號檢測用中空管時，相對於中空管的橫斷面沒有重複移動的形狀的載體，藉助或不藉助間隔臂與具有與待檢測物質結合能力的物質(結合子)結合的帶有可識別信號A的載體。
本發明中使用的載體是不溶於溶液的載體。
作為載體上的信號A只要是可分別識別無論什麼信號都可以，但優選數位訊號。作為數位訊號只要是數位化的信號並沒有特別限制，如條形碼、微小的點、微細的線等的某些組合表示的信號等，優選條形碼。
作為使載體帶有信號A的方法沒有特別限制，例如使用可以印刷微細的條形碼、微小的點、微細的線等的印刷機器的方法，通過微細的雷射光線使表面的反射率或折射率改變成線或點形狀的方法，使用聚焦等使由條形碼、或線、點構成的圖形縮小到光學角度上的微細程度，使光投向的部分表面的性質發生變化，然後通過化學處理或使調色劑吸附等的物理處理加上條形碼的方法，使通過光固化或分解的光敏感的聚合物含有色素或顏料、石墨等，對表面進行覆蓋，然後用光照射表示信號的形狀，之後進行腐蝕加上信號的方法；整個載體用光敏感樹脂做成的方法；使內部存在通過磁記錄法記錄信號的磁性載體的方法等。
作為載體的形狀只要是附帶的數位訊號從外部可讀取的形狀，並沒有特別限制。特別是在貫流中空管時，相對於該中空管的橫斷面不是重複移動的形狀者優選。從操作性、單位體積的表面積大方面來說微小者優選。特別是作為在後敘的使用中空管的檢測方法中使用的具體載體的形狀，相對於該中空管的形狀，可以是球形、多稜柱形、圓柱形等，其中圓柱形者優選。形狀即使是球形也可以使用，例如通過將多個二維條形碼等信號A加到球表面上，信號A從哪一個位置都可以讀取的那樣的場合，或使磁性微粒子存在於載體中檢測時，通過短時間用磁力阻止載體的移動，通過磁力使球的特定面朝向檢測方向進行檢測。
作為載體大小，例如圓柱形時，直徑為1μm～2mm左右優選，長度為10μm～2cm左右優選。球狀時，直徑為1μm～2mm左右優選。
另外載體的比重0.8～2優選，0.85～1.5更優選，0.9～1.1特別優選。載體懸浮液和該載體的比重差在0.1以下優選，在0.05以下更優選，而在0.03以下優選。
使該載體成形的方法有在多稜形、圓柱形的模具中模塑高分子的方法，以及用各種方法切斷多稜形、圓柱形纖維狀物的方法。另外通過使用高分子的單體的懸浮聚合法、乳液聚合法等也可以製造粒子狀載體。在為中空的圓柱形的情況，使遇熱向一個方向收縮的原料和收縮少的原料的薄膜層疊，加上信號A後(裁斷或不裁斷)通過加熱使其只有一個面收縮可以形成圓柱形。
作為遇熱收縮的原料例如可舉出山登理科(株)的2000年塑料科學儀器綜合目錄、塑料編中記載的TFE收縮管、TOF收縮管、聚四氟乙烯收縮管、FEP收縮管等細或纖維狀原料或尼龍收縮管等。
載體或其表面最好是由至少難於吸附蛋白質或含有鹼基序列化合物等待檢測物質構成的物質。理想的載體是親水性載體，但即使載體是疏水性的，由於最終對表面進行物理處理或被覆處理之後，也可以使載體表面的吸附減少，所以也可以使用。作為被覆的天然高分子例如有脫乙醯殼多糖、蛋白質、透明質酸等。
作為載體原料沒有特別限制，但合成化合物最好，例如聚丙烯酸或其酯類、聚甲基丙烯酸或其酯類、聚醚類、聚碳酸酯、聚酯類、聚醯胺類、聚氨酸酯類、聚醯亞胺類、聚苯乙烯類、聚丁二烯、聚氯丁烯以及它們的共聚物、它們的混合物等。一般來說作為塑料或纖維材料使用的合成高分子價廉故理想。
作為用於載體的合成高分子化合物，例如側鏈含有羥基或酯基、羧基、醯胺基、氨基、亞氨基、羥琥珀酸酯基、馬來醯亞胺基、縮水甘油基等的合成高分子化合物比較理想。作為構成這些合成高分子的單體有諸如丙烯酸酐、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯(以上聚合後進行水解)、羥苯乙烯、乙二醇(甲基)丙烯酸酯、三乙烯醇(甲基)丙烯酸酯等含有氧化乙烯的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥甲基酯、(甲基)丙烯酸羥丙酯等含有羥基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸縮水甘油酯等帶有環氧基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯等(甲基)丙烯酸烷基酯、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、二乙醯丙烯醯胺、N-羥甲基丙烯醯胺、乙抱亞胺、丙烯酸羥琥珀酸酯等單乙烯性化合物。
作為該合成高分子化合物如由一種上述單體構成的聚合物以及由2種以上上述單體構成的共聚物。這些合成高分子化合物只要至少形成載體表面層就可以，內部即使是例如聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚醯胺、聚乙烯(polyvinyl)等疏水性高分子也可以。藉助或不藉助間隔臂使結合子結合的表面被製備成含有官能團的表面最好。另外也可以使用通過反應變成親水的高分子化合物。具體來說作為合適的高分子化合物的例子有甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合物。
該高分子化合物的合成因單體的種類和高分子化合物的種類不同而不同，但都可以通過眾所周知的方法合成。
所謂的間隔臂是結合載體和結合子的分子。這樣的間隔臂如聚乙二醇二縮水甘油醚鏈、單鏈DNA、單鏈RNA、單鏈肽核酸(peptidenucleic acid、縮寫為PNA)、肽鏈等。聚乙二醇二縮水甘油醚鏈的長度以1～10個乙烯單元為優選，1～5個單元更優選。而使用單鏈DNA以及單鏈RNA作為間隔臂時該鏈的鹼基序列無論什麼樣都可以，但鹼基中優選末端含有帶有氨基的腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)的鹼基。這些單鏈DNA和單鏈RNA鏈的長度優選為3～40mer，5～20mer長更優選。肽鏈數優選1～50mer，2～30mer更優選。
作為結合子只要具有與待檢測物質結合的能力的物質就可以，並沒有特別限制，例如具有與樣品中待檢測物質含有的鹼基序列或其部分序列互補的物質、具有結合待檢測物質能力的蛋白質、多肽等。
作為待檢測的鹼基序列或其部分序列只要是含有鹼基序列，檢測上並沒有特別限制，但優選來自於與各種性狀有關的基因、與疾病有關的基因等的鹼基序列。例如HCV基因、抑癌基因序列、WT-1。Klotho基因、GyrB基因、抗藥性基因、肥胖基因等都可以。
具有與待檢測物質結合能力的蛋白質可以是各種受體、針對各種抗原的抗體、凝集素蛋白質等。或者作為結合子可以使用與該受體或抗體結合的配體或抗原。作為受體如VEGF受體、IL-2受體、Fc受體等。作為抗體如抗HCV抗體、抗HBs抗體、抗HBe抗體、抗GAD抗體、抗CRP抗體、抗CEA抗體、抗C肽抗體、抗胰島素抗體、抗BNP抗體、抗肌鈣蛋白T抗體、抗氧化LDL抗體、抗TBGL抗體、抗MPB64抗體、抗端粒末端轉移酶抗體等。
結合子是蛋白質時，可以將從組織提取液、菌體提取液、或從將需要的蛋白質基因導入菌體或細胞使其表達的產物等純化的蛋白質直接作為結合子或將導入官能團後的蛋白質作為結合子。而當結合子是低分子化合物時，低分子化合物只要是含有官能團的物質可以直接作為結合子，沒有官能團的加上官能團後作為結合子也可以。當結合子是DNA、RNA時，可以將在末端導入官能團後的DNA、RNA等作為結合子。
具有與樣品中待檢測鹼基序列或其部分序列互補的鹼基序列的物質的鹼基數為5～500個鹼基，10～300個鹼基更優選，15～200個鹼基特別優選，是具有與通常進行檢測的鹼基序列互補的鹼基序列的DNA、RNA或PNA等。
結合子是具有鹼基序列的物質時，該物質的鹼基序列可以根據那些眾所周知的序列進行設計。具有該鹼基序列的物質如單鏈DNA鏈、單鏈RNA鏈、單鏈PNA等。另外作為本發明待檢測物質含有的鹼基序列如已了解到的使已知序列的內部發生點突變的基因的鹼基序列也適用。此時作為與發生變異的鹼基互補的結合子中的位點處於結合子的兩端的3個鹼基以上的內側比較理想，最優選處於結合子中心部位。
具有與樣品中待檢測物質含有的鹼基序列或其部分序列互補的結合子如果該結合子是DNA時，可以通過使用二氧化矽等載體的固相法使DNA的化學合成反應自動化的DNA合成儀等合成。反應底物使用鹼基的氨基和核糖的5』-OH用保護基保護、使核糖的3』-OH結合二異丙基磷醯胺化物的核苷酸衍生物。作為鹼基的氨基的保護基如苯甲醯基或異丁基，而作為核糖5』-OH的保護基如二甲氧三苯甲基等。根據鹼基序列以氨基以及5』-OH被保護的腺嘌呤、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶、鳥嘌呤的任一個核苷酸通過3』-OH固定於固相載體上的柱子作為初始材料，用酸除去三苯甲基(形成5』-OH)後，將3』末端帶有磷醯胺基的上述核苷酸衍生物加到四唑等適當的縮合劑中。通過碘和水將兩者的鍵轉變成穩定的磷酸三酯鍵。反覆進行脫三苯甲基和縮合反應循環，最後通過氨處理脫保護基和從固相載體上切下來。通過以上操作可以合成作為結合子的DNA。另外間隔臂是單鏈DNA時，可以進一步連續合成該序列，其長度優選在3個鹼基以上，由此可以合成帶有DNA間隔臂的DNA結合子。
以下對藉助或不藉助間隔臂使結合子結合的帶有可識別信號A的載體的製備方法進行說明。
作為使結合子例如使蛋白質結合在載體表面的方法，希望在載體表面存在側鏈或末端的羧基或氨基、縮水甘油基、巰基、羥基、醯胺基、亞氨基、羥基琥珀酸酯基、馬來醯亞胺基等經反應後可以化學結合的基團，當不存在這樣的情況時，也可以使用通過紫外線、放射線等物理或化學處理使可以進行這些反應的基團暴露出來的方法。另外在表面上包被其它的聚合物，製作官能團也是可能的。
作為使蛋白質等結合於該載體的可反應基團的方法有一般都知道的化學方法，例如已知的作為使蛋白質的氨基或羧基結合於載體上的官能團的方法有通過碳化二亞胺等縮合和使羰基變成活性酯之後與氨基反應的方法，或將巰基或馬來醯亞胺預先掛到載體上，然後使它與結合子的馬來醯亞胺或巰基反應的方法以及將異硫氰酸酯基、縮水甘油基、N-羥基琥珀醯亞胺基等預先掛到載體上，使它與結合子的氨基反應的方法，可以使用上述任一種方法。另外這樣做成的載體為抑制非特異性吸附或反應，也可以用BSA等處理之後進行封閉。
間隔臂是聚乙二醇二縮水甘油，結合子是蛋白質、載體表面有環氧基時，蛋白質與載體的結合可以象以下那樣進行。向載體粒子中加入氫氧化銨或己二胺鹽酸鹽，加入的量是環氧基的10～100倍摩爾量，於60～70℃、pH10～12條件下反應0.5～2天，使粒子表面氨基化。反應後，通過離心分離洗淨，根據需要通過離子交換水進行透析，除去未反應的氫氧化銨或己二胺鹽酸鹽。嚮導入了氨基的載體中加入氨基的50～200倍摩爾量的聚乙二醇二縮水甘油，於pH10～12、溫度20～40℃條件下，反應0.5～2天，使間隔臂與載體結合。間隔臂帶有的環氧基與蛋白質的結合按照前面方法進行。
使DNA等結合於載體表面而使用的載體可以直接使用在載體表面存在有側鏈或末端的羧基或氨基、縮水甘油基、巰基、羥基、醯胺基、羥基琥珀酸酯基、馬來醯亞胺基等基團經反應後可以化學結合的載體，當不存在這樣的基團時，也可以使用通過放射線等物理或化學處理使可以進行這些反應的基團暴露出來的方法。另外在表面上包被其它的聚合物，形成官能團也是可能的。
使DNA等結合於該載體可反應基團的方法有一般都知道的化學方法，例如作為使DNA等結合於載體表面上的氨基或羧基的方法已知有通過碳化二亞胺等縮合和使羰基變成活性酯之後與氨基反應的方法，或將巰基或馬來醯亞胺預先掛到載體上，然後使帶有馬來醯亞胺或巰基的載體與DNA等反應的方法以及將異硫氰酸酯基、碳化二亞胺基、N-羥基琥珀醯亞胺基預先掛在載體上，然後使它與氨基反應的方法，可以使用上述任一種方法。另外也可以使用已知的DNA合成法使核酸的鹼基一個一個地聚合在載體表面合成DNA等方法。
具體來說，根據間隔臂的種類、載體的種類和結合子的種類確定載體、間隔臂和結合子的各結合方法。例如結合子是DNA時一般都是通過使DNA結合子末端的鹼基帶有的氨基與載體或間隔臂的環氧基、羰基、醛基、羥基等結合來使載體和結合子結合。
間隔臂和結合子是單鏈DNA時，載體表面帶有環氧基時，該DNA結合子和載體的結合例如按如下方式進行。
按照上述的DNA合成法合成帶有DNA的間隔臂的DNA結合子以及含有與該結合子互補序列的單鏈DNA且沒有間隔臂序列的單鏈DNA。然後使兩者雜交，做成雙鏈，保護含有待檢測鹼基序列的鹼基中的氨基，使游離的間隔臂部分中的鹼基中的氨基(根據需要末端可導入氨基)與載體的環氧基結合。與該載體結合後，使含有與結合子互補的序列且不合有間隔臂的單鏈DNA解離，可以製備目的載體結合DNA結合子。
這樣做成的載體為抑制非特異性吸附或反應，所以可以BSA等處理之後進行封閉。
雜交根據需要可以在含有甲醯胺、鹽、蛋白質、穩定劑、緩衝劑的水溶液中進行。以下將該溶液稱為雜交液。甲醯胺濃度為0～60％。鹽可以使用氯化鈉、氯化鉀等無機鹽，檸檬酸鈉、草酸鈉等有機酸鹽，鹽濃度為0～2.0M、優選0.15～1.0M。蛋白質可以使用血清白蛋白等。穩定劑可用フイコ-ル。緩衝劑可用磷酸緩衝液，濃度為1～100mM優選。上述互補的2種DNA的雜交是在雜交液中加入分別合成的等摩爾濃度的單鏈DNA，於50～90℃下加熱1分鐘～6小時後，慢慢冷卻來進行的。
這樣一來製備出了帶有單鏈多核苷酸間隔臂的部分雙鏈DNA。
與載體結合的過程如下用1～100mM磷酸緩衝液洗帶有環氧基的載體粒子，使粒子平衡後，在與洗淨用緩衝液同樣的溶液中將載體和帶有用上述方法製作的單鏈DNA間隔臂的部分雙鏈DNA混合，於20～50℃下保溫5～50小時。通過用含有1～3M氯化鈉等鹽類的水溶液洗，除去未反應的DNA後，對於存在於載體上的未反應的環氧基加Tris-HCl緩衝液於室溫下保溫50小時使其開環。這樣就可製備結合於載體上的雙鏈DNA。
通過將該結合載體雙鏈DNA在雜交用溶液中洗淨，可以製備使沒有間隔臂的單鏈DNA解離的結合於載體的單鏈DNA。使用雜交溶液，於50～90℃下，經千～10萬g的離心分離，反覆數次進行洗淨。
當間隔臂是聚乙二醇二縮水甘油醚鏈，結合子是DNA鏈，載體表面含有環氧基時，DNA結合子和載體的結合可以與上述的間隔臂和結合子是單鏈DNA，載體表面含有環氧基情形一樣進行。
除了使用這樣的合成高分子的化學固定法以外，也可以利用Haun，M和Wasi，S的方法[Anal.Biochem.，191，337(1990)]將鏈黴抗生物素固定於載體上後，利用鏈黴抗生物素和生物素的親和性固定含有生物素的間隔臂、或末端被生物素標記的結合子本身。另外也可以利用在使載體和間隔臂、或載體與結合子各自分別結合後，利用兩者的親和性使生物學上具有親和性的兩類物質結合的方法。
在使結合子結合於帶有上述信號A的載體時，使特定的結合子S1結合於帶有信號A的A1載體上。同樣可以使其它的結合子S2結合於帶有信號A的A2載體上。例如，可以使特定結合子S1結合於分配條形碼號01的載體上，其它的特定結合子S2結合於分配條形碼號02的載體上。在本發明中，只要可以對應識別特定結合子和信號A，一次反應可檢測的結合子的種類的上限就沒有特別限定。
在本發明中由於通過使用多個藉助或不藉助間隔臂使含有特定鹼基序列的S1、S2、…Sn的結合子分別與帶有信號A的A1、A2…An的載體結合的載體，可以使特定鹼基序列與信號A對應識別，所以在一次反應中可檢測的鹼基序列的種類上限沒有特別限制。
以下就待檢測物質的製備方法進行說明。用於檢測的生物體樣品可以是直接來自各種臟器、組織、血液等的未經純化的樣品，或是利用低分子化合物、蛋白質、DNA、RNA等核酸分子的提取、純化方法製備的樣品。
以下就含有待檢測鹼基序列的樣品的製備方法進行說明。
例如當用於檢測的樣品是DNA或RNA時，可以通過眾所周知的DNA或RNA提取方法從各種臟器、組織、血液等製備。分離的DNA或RNA用特定的限制酶進行酶切，製備成含有待檢測特定鹼基序列為5～500mer長的、優選是10～300mer長的單鏈DNA片段或單鏈RNA片段。樣品中的DNA等鹼基序列也可以使用通過PCR、TMA或NASBA法擴增的產物。在本發明中，在檢測生物體樣品中的鹼基序列時只要將DNA等做成片段就可以。不只是生物體樣品、含有通過合成等製造的鹼基序列的化合物也可以用作樣品。
樣品中待檢測物質與結合子的結合根據需要可以在含有鹽、蛋白質、穩定劑、緩衝劑、表面活性劑等的水溶液中進行。使用的鹽有氯化鈉、氯化鉀等無機鹽，檸檬酸鈉、草酸鈉等有機酸鹽，鹽濃度為0～2.0M。使用的蛋白質有血清白蛋白等。緩衝劑有磷酸緩衝劑等，濃度優選為1～100mM。作為結合的條件可以於10～70℃下加熱1～60分鐘後，根據需要進行冷卻來進行。
以下敘述將藉助或不藉助間隔臂使結合子結合的帶有可識別信號A的載體與含有待檢測物質的樣品在溶液中混合，使待檢測物質和該載體上的結合子結合，通過結合使得新的信號B在載體上形成的方法。
例如結合子是蛋白質時，可以按以下那樣過程進行。信號B只要是由待檢測蛋白質等物質和該載體上的蛋白質等物質(無論哪一方都是蛋白質)的結合產生的信號無論什麼樣的信號都可以，可以利用與振子等振動有關的共振現象直接測定重量增加；使標記化合物結合於識別待檢測物質的抗體等，以該標記作為信號B的方法；以及使標記化合物結合於識別結合子的抗體等，待檢測物質結合結合子時，該抗體不與結合子結合，將沒有結合的抗體的標記作為信號B進行檢測也是有可能的。另外結合子之間藉助於蛋白等待檢測物質連接的那樣情況下，可以將一方含有結合子的信號A作為信號B進行檢測。
作為使待檢測蛋白和結合子結合的條件是在通常水溶液中蛋白不變性的條件下進行的。例如在具有pH3-11左右緩衝能力的水溶液(也可以含有表面活性劑或用於維持蛋白的功能的輔助劑)中，溫度為1～90℃，優選5～60℃左右。
然後沒有與結合子結合的標記化合物和樣品中的殘餘物質根據需要可以通過離心分離操作或過濾操作等除去。
作為標記化合物如螢光物質、發光物質、酶、或通過酶產生螢光、發光的化合物等。作為螢光物質如螢光素異硫氰酸酯(鹽)(以下縮寫為FITC)和德克薩斯紅(Texas Red)等。
作為螢光標記如吖啶鎓衍生物和釕配位化合物。具體來說，美國專利第4918192號、4946958號、4950613號或Clin.Chem.29(8)，1474-1479(1983)報導的吖啶鎓類優選。而釕配位化合物以Clin.Chem.37(9)，1534-1539(1901)報導的優選，該化合物可作為電子供體的同時，還能進行電化學發光。
以通過酶產生螢光、發光的化合物作為底物例如作為過氧化物酶的底物有氨基苯二醯肼化合物、光澤精(ルミグニン)化合物等。或者作為鹼性磷酸酶的底物如3-(2』-金剛烷基)-4-甲氧基-4-(3」磷醯氧基)苯基-1，2-二氧雜環丁烷(dioxetane)鹽、吖啶鎓的磷酸衍生物APS2，APS3，APS5等[以上為Lumigen Inc的發光化合物，H.Akhavan-Tafti，Z.Arghavani等，John Wiley and Sons，Chichester，497-500(1997)]。
標記化合物是螢光物質時，使螢光物質也結合於載體上，遇到光時，也可以利用通過來自一方螢光物質的能量轉移使結合的另一方螢光物質發螢光的現象進行標記。
在檢測信號B時，如果是螢光，將含有載體溶液通過的微小空管部分置於螢光檢測儀的檢測部位。現在細胞分類器中使用的那樣的方法也適用。檢測螢光時雖然不需要光源，但如有必要最好加上使發光開始的試劑或提供能量的裝置。作為發光的檢測裝置使用高靈敏度的光子計數儀比較合適，當發光強時螢光檢測儀的光學部分也可以使用。
以下就諸如使藉助或不藉助間隔臂使含有與待檢測的鹼基序列或與其部分序列互補的結合子結合的帶有可識別信號A的載體和含有待檢測鹼基序列的樣品在溶液中混合，使待檢測鹼基序列和該載體上含有的互補鹼基序列的鹼基序列雜交，由此在載體上形成的新信號B的方法進行敘述。
信號B只要是通過待檢測鹼基序列和該載體上含有的互補鹼基序列的鹼基序列雜交形成的雙鏈產生的信號無論什麼樣的信號都可以，可以直接測定雙鏈的吸收，但使可識別形成雙鏈的雜交的帶有標記的化合物結合的方法比較理想。作為可識別該結合子的鹼基序列和樣品的鹼基序列雜交的帶有標記的化合物有諸如使標記化合物和與樣品中特定鹼基序列除去對應於結合子互補序列以外的其餘鹼基序列互補的鹼基序列結合的化合物(以下縮寫為標記結合子)，使標記化合物與識別結合子的鹼基序列和樣品的鹼基序列的雜交的抗體結合的化合物，以及使標記化合物和識別結合子的鹼基序列和樣品的鹼基序列的雜交的嵌入劑結合的化合物等。
雜交是使用上述的雜交溶液在嚴格條件下進行的。例如，將DNA結合子結合載體和含有DNA片段的樣品添加到該雜交溶液中，於50～90℃，最好是在60～75℃下加熱1分鐘～24小時，最好是加熱5～15分鐘。
接下來，根據需要通過離心分離或過濾操作對以下化合物進行分離沒有雜交的、含有與樣品中結合子互補的鹼基序列的化合物，以及沒有與帶有信號A的載體形成複合物的、與樣品中特定鹼基序列除去對應於結合子互補序列以外的其餘鹼基序列互補的鹼基序列結合的化合物，使標記化合物和識結合子鹼基序列與樣品鹼基序列的雜交的抗體結合的化合物，以及使標記化合物與識別結合子鹼基序列和樣品鹼基序列的雜交的嵌入劑結合的化合物。
使標記化合物和樣品中標記結合子、標記化合物與識別結合子鹼基序列和樣品鹼基序列的雜交的抗體結合的化合物、標記化合物與識別結合子鹼基序列和樣品鹼基序列的雜交的嵌入劑結合的化合物等的檢測可以根據該化合物的標記種類進行。
作為標記化合物如上述的螢光物質、發光物質、或通過酶產生螢光、發光的化合物等。
另外由於已雜交的部分變成了雙鏈，如添加嵌入劑，可使其嵌入。此時如果是通過嵌入發螢光的化合物，只有存在已雜交的化合物時發螢光，所以互補鹼基序列沒有處於載體表面的鹼基序列不顯螢光，由於不必除去剩餘嵌入劑或沒有雜交的物質，所以特別理想。
在嵌入劑中有溴化乙錠等化合物或4』，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽n-水合物(DAPI)SYBR Green 1(Molecular Probe公司生產)、Pico Green(Molecular Probe公司生產)、2-甲基-4，6-雙-(4-N，N-二甲氨基苯酚)吡啶鎓(MBP佳能公司生產)、2-甲基-4，6-雙-(4-N，N-二甲氨基苯基)硫吡啶鎓(佳能公司生產)等嵌入劑。另外也適用若未雜交則在鹼性條件下不分解發光的吖啶鎓酯等發光化合物。
使用標記結合子時，優選另外添加具有與靠近雜交部位附近的部分序列互補序列的DNA標記物之後，使它們雜交，然後除去沒有雜交的標記結合子之後，標記結合子形成只與雜交的部位結合的狀態。作為除去沒有雜交的標記結合子的方法使用離心分離或過濾的方法比較合適。除了除去沒有雜交的標記結合子的方法以外，使沒有雜交的標記結合子鈍化也可以。
標記化合物是螢光物質時，使螢光物質也結合於載體上，遇到光時，也可以利用通過來自一方螢光物質的能量轉移而使雜交的另一方的螢光物質發螢光的現象進行標記。此時添加含有與靠近樣品中DNA或RNA雜交部位附近序列互補的DNA序列的螢光物質結合的標記物，使其雜交。一遇到光，能量從一方螢光物質轉移到另一方螢光物質，由於只有雜交的產物發螢光，所以如果互補的DNA序列或RNA沒有在載體上，則螢光弱或沒有螢光，而互補的DNA或RNA處於載體上時螢光強或有螢光。
在檢測信號B時，如果是用螢光，將含有載體溶液通過的微小空管部分置於螢光檢測儀的檢測部位。現在細胞分類器中使用的方法也適用。檢測螢光時雖然不需要光源，但如有必要加上引起發光的試劑或提供能量的裝置也可以。作為發光的檢測裝置使用高靈敏度的光子計數儀比較好，當發光強時也可以使用螢光檢測儀的光學部分。
中空管為由細管形成的圓柱形時，載體能夠每次一個通過圓柱長方向的形狀的中空管最好。而與中空管連接的溶液供給裝置最好是具有逐漸變窄與微小空管連接的中空管。在使載體通過逐漸變窄的溶液供給裝置的管中，使載體最終與直徑範圍被設定為一次不能通過2個載體的中空管連通的方法最好。由於逐漸變窄，可以防止載體彼此堵塞管子。
反應後，可以使與DNA或RNA等雜交後的載體和沒有雜交的載體通過中空管，雜交的載體通過時，由於產生螢光或產生發光或者發光或螢光強度相對於背景很強時，與各個載體信號同時或前後對有無螢光或發光，或其強弱進行檢測，將檢測的信號依次輸入計算機，將各個載體的信號與相應的鹼基序列聯繫起來，顯示有無檢測對象DNA或RNA序列。結果可以檢測出存在於檢測樣品中的相當於帶有螢光或發光(或螢光或發光強度強)的載體顯示出信號的鹼基序列。由於檢測部位小，要使整個載體通過需要較長時間時，可使用多個信號和螢光或發光的檢測部位，將流路並列設置，將各個檢測部位檢測的信息匯集到數據處理裝置，進行解析。
使該溶液通過具有可使上述載體一個一個通過的那樣的微小中空管的管子，通過時載體帶有的信號A和樣品中存在待檢測鹼基序列時載體上形成的信號B可大致同時檢測出來，信號A和信號B只要是從同一載體發出的，如果可以判別，也可以分別檢測。在檢測數位訊號時，近年來可確切讀出數位訊號的儀器已經開發了很多，只要具有讀出微小信號能力的儀器無論用哪一種都可以。例如作為讀出微小數位訊號的方法有通過光學擴大，如通過條形碼觸摸掃描儀那樣的原理讀出的方法，或通過CCD照相機等以影像一旦獲得，通過放大或直接讀出的方法，或用微小的雷射照射到載體上後，通過反射光或透射光讀出的方法等。在通過CD等使用的磁光學記錄的情況下，用與通過CD等使用一樣的雷射進行光學讀出的方法優選。
在本發明中通過使用預先已知量的樣品DNA等對待檢測物質做成標準曲線，也可以對樣品中的DNA等待檢測物質的濃度進行定量。
本發明有可能有例如以下那樣的應用。
以傳染病患者的血清作為檢測樣品，使各種傳染病病原的適當抗原結合於載體上，使用作為標記使螢光標記化合物或發光標記化合物結合於抗人免疫球蛋白抗體，無論傳染病患者感染什麼種類的傳染病通過一次操作就可判明。
以過敏患者的血清作為檢測樣品，使各種過敏原的適當抗原結合於載體上，使用作為標記使螢光標記化合物或發光標記化合物結合於抗人免疫球蛋白抗體，無論患者感染什麼種類的過敏原通過一次操作就可判明。
以某一細胞的溶胞產物(ライゼ-ト)作為樣品，使各種蛋白質或低分子化合物結合於載體上，作為標記使用在針對結合於載體上的各種蛋白質或低分子化合物的抗體上結合了螢光標記化合物或發光標記化合物者，如果樣品中存在對結合在載體上的各種蛋白質或低分子化合物有親和性的物質，被標記的抗體就不能反應，那麼樣品中應該存在與沒有結合螢光標記化合物或發光標記化合物的載體相當的結合物有親和性的物質，細胞中該物質的探索通過一次操作就可判明。這種情況下，在載體上結合DNA的時候，也有可能檢出與該DNA有親和性的蛋白，例如與DNA啟動子結合的蛋白質。另外在此情況下，當樣品中存在使結合在載體上的蛋白質彼此有結合的物質的時候，2個載體就會在有結合子存在處面對面接合。在可以判定這種結合的檢測之時，通過調整條形碼的方向或檢測時間間隔，可以檢測該物質。
另外由於近年來基因克隆、基因序列解析技術的進步，得到了很多新的基因，其中的很多基因它們具有什麼樣的功能還不清楚。本發明也可以應用於那樣功能不清楚的基因序列編碼的蛋白質的功能解析中。例如，將該基因片段配置在5』上遊之後，在其3』下遊連接編碼綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein)(以下稱為GFP)的基因序列，將該基因編碼的蛋白質作為與GFP的融合蛋白表達，通過將這樣螢光標記的功能未知的基因編碼的蛋白質固定於載體上後，與帶有固定了各種已知物質的條形碼的載體溫育，通過監測條形碼和螢光信號，監測與功能未知基因編碼的蛋白質結合的物質，對與該物質結合的物質進行篩選是有可能的。就是說，通過使用本方法，使對功能未知基因編碼的蛋白質的機能很容易地進行解析成為可能。另外如果利用有變異的GFP，由於各種變異基因具有不同的螢光，通過使具有各種不同螢光的GFP結合於希望解析的目的基因的3』下遊，對多個功能未知基因的解析同時有效地進行也是有可能的。
而上述例子中使用的標記化合物不一定非得用GFP，只要是有可能通過基因工程技術由基因表達蛋白，其本身帶有任何信號都可以利用。例如，水母發光蛋白和蟲螢光素酶那樣的酶也可以用於檢測系統中。
某一蛋白質和與該蛋白結合的蛋白質或低分子物質或啟動子等作用於蛋白質的物質在接近生物體內條件的溶液中相互作用、結合。例如將預先該蛋白質掛在載體上，然後添加與它相互作用的物質，通過溫育使載體上的該蛋白質和與其相互作用的物質生成複合體。當存在有能力使結合於載體上的蛋白質之間結合的物質時，使兩個載體進行結合的面面對面會合。為了闡明生成的複合體是什麼樣，使結合於複合體上其種類已闡明的標記化合物進一步反應，檢測有無標記。這樣可以判定某一蛋白質和與該蛋白質其相互作用的物質是否存在。
圖2表示本發明裝置的概圖。
(2)載體結合單鏈DNA(載體結合結合子)的製備將含有條形碼01的載體50條分散於HEPES緩衝液10ml中，添加1μmol的寡DNA，該寡DNA含有由5』末端帶有氨基的15個鹼基組成的序列號1鹼基序列。然後再添加WSC[水溶性碳化二亞胺Watersolublecarbodiimide，化合物名稱為1-乙基-3-(-二甲氨基丙基)碳化二亞胺，鹽酸鹽，同仁化學公司製造]50μmol，將含有序列1鹼基序列的寡DNA通過氨基固定於該載體上。結合了含有序列1鹼基序列的寡DNA的載體在1％BSA溶液中進行封閉，用蒸餾水洗淨，製備出帶有結合了含有序列1鹼基序列的寡DNA的條形碼01的載體。序列1鹼基序列中的5』末端的AAA是作為間隔臂插入的。
同樣使含有由5』末端帶有氨基的15個鹼基組成的序列號2鹼基序列的寡DNA結合於含有條形碼02的載體50條上進行同樣處理，製備出帶有結合了含有序列2鹼基序列的寡DNA的條形碼02的載體。
(3)結合螢光的單鏈DNA(結合螢光的結合子)的製備使FITC(螢光素異硫氰酸鹽)與含有序列3鹼基序列的寡DNA的3』末端反應，製備螢光標記的寡DNA 2nmol/ml的溶液。
(4)檢測樣品DNA的製備製備含有與序列1鹼基序列和序列3鹼基序列互補的序列4鹼基序列的寡DNA，溶解於TE緩衝液(10mmol/L Tris、1mmol/L EDTA)製備成濃度為1nmol/l的檢測溶液。
製備含有與序列1鹼基序列和序列3鹼基序列不互補的序列5鹼基序列的寡DNA，溶解於TE緩衝液製備成濃度為1nmol/ml的檢測溶液。
(5)雜交向含有分別帶有上述(2)製備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7、含有1mol/L NaCl)10ml中添加上述(3)製備的結合螢光的單鏈DNA(結合螢光的結合子)100μL和含有上述(4)製備的序列4鹼基序列的檢測樣品DNA、含有序列5鹼基序列的檢測樣品DNA或TE緩衝液100μL，分別於50℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。
然後用東洋濾紙公司生產的醋酸纖維素的0.8μm濾膜(C080A047A)過濾，用0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7、含有1mol/LNaCl)洗淨，再將載體分散於10ml同樣的緩衝液中。
(6)檢測製作

圖1所示的檢測裝置，一邊使上述(5)製備的各個溶液通過信號檢測裝置中的中空管，一邊進行條形碼和螢光的檢測。條形碼讀出器使用日榮インテツク公司生產的Hand Laser Scanner SL-114型。螢光檢測機使用日立F-4000型螢光分光光度計，用激發波長495nm、螢光波長520nm測定螢光強度。中空管是石英玻璃管，內徑為2mm、流速為0.6cm/秒。由於條形碼的信號和螢光的信號檢測的時間差為36秒，按照時間差使含有特定條形碼的載體上的螢光信號對應。
螢光強度考慮到噪音，將檢測到的螢光強度的最大值作為螢光強度，將鹼基序列一樣的5個條形碼02載體具有的螢光強度的平均值作為1。
表1給出了檢測結果。
表1

結果可以確認對應於條形碼01的載體的螢光值明顯高。而在含有與條形碼01的結合子DNA的鹼基序列不互補的序列5鹼基序列的DNA檢測樣品以及只有載體(無DNA)的樣品中，與帶有任一條形碼信號載體對應的螢光值都低，由此表明利用本發明方法可以對特定序列進行特異檢測。
實施例2向含有分別帶有實施例1(2)製備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7、含有1mol/L NaCl)10ml中添加含有實施例1(4)製備的鹼基序列4鹼基序列的檢測樣品DNA、含有序列5鹼基序列的檢測樣品DNA或TE緩衝液100μL，分別於50℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。然後添加用TE緩衝液稀釋了5000倍的SYBR GreenI溶液10mL，於室溫下緩慢攪拌，加熱30分鐘後，象實施例1那樣使用圖1的裝置進行測定。而在螢光檢測中，用激發波長254nm、螢光波長520nm進行測定。
螢光強度與實施例1一樣將鹼基序列一樣的5個條形碼02的載體具有的螢光強度的平均值作為1。
表2給出了檢測結果。
表2

結果可以確認對應於條形碼01的載體的螢光值明顯高。而在含有與條形碼01的結合子DNA的鹼基序列不互補的序列5鹼基序列DNA檢測樣品以及只有載體(無檢測樣品)的樣品中，與帶有任一個條形碼信號的載體對應的螢光值都低，由此表明利用本發明方法可以對特定序列進行特異檢測。另外利用本發明的方法進行雜交操作後，不需要載體和未結合標記的分離操作就可通過簡便操作進行測定。
實施例3使吖啶鎓-I(同人化學公司製造)與在具有序列3鹼基序列的寡DNA的5』末端開始的第6位鳥嘌呤導入氨基的寡DNA結合，製備2nmol/ml的溶液(以下簡寫為吖啶鎓標記結合子)。
向含有分別帶有實施例1(2)製備的01和02條形碼的載體各5條的0.1mol/L的琥珀酸鋰緩衝液(pH5)、20％月桂基硫酸鋰，0.4mol/LLiCl，20mmol/L EGTA、20mmol/L EDTA 500μl中添加含有實施例1(4)製備的具有序列4鹼基序列的檢測樣品DNA、含有序列5鹼基序列的檢測樣品DNA或TE緩衝液10μL，再添加上述吖啶鎓標記結合子溶液(終濃度為0.1pmol/L)，分別於60℃下緩慢攪拌，加熱30分鐘進行雜交反應。然後添加1500μL的0.6mol/L的四硼酸鹽緩衝液(pH8.5)、5％Triton X-100、TETRA溶液，於60℃下加熱20分鐘，對未反應的吖啶鎓標記結合子進行水解，將加有樣品的反應容器浸入水中3分鐘進行急劇冷卻。
檢測是使用圖2的裝置(由圖1的信號檢測裝置改造的)進行的。使本反應後的樣品流過管子，用條形碼讀出器檢測信號後，再通過圖2所示的試劑供給裝置導入含有0.03％H2O2的2mol/L NaOH溶液，在管中與該樣品混合，直接利用光計數器2500發光檢測器(マイクロテツク·ニチオン公司製造)的檢測部分測定發光計數，在帶有01條形碼的載體中，只有使含有序列4鹼基序列的DNA反應的樣品可以檢測出明顯的化學發光計數。
實施例4(1)帶有信號A的載體的製作象實施例1(1)那樣製作含有信號A的載體。
(2)載體結合蛋白(載體結合抗體)的製備將含有條形碼01的載體50條分散於HEPES緩衝液10ml中，添加100μmol的羥基琥珀醯亞胺(關東化學生產)，然後再添加WSC[水溶性碳化二亞胺Water soluble carbodiimide，化合物名稱為1-乙基-3-(-二甲氨基丙基)碳化二亞胺，鹽酸鹽，同仁化學公司製造]100μmol，使羧基琥珀醯亞胺化，然後用相同緩衝液洗淨載體後，立刻添加含有抗人免疫球蛋白γ抗體1μmol/ml的緩衝液10ml，使抗體固定。再於1％BSA溶液中進行封閉，用蒸餾水洗淨，製備出帶有結合了抗人免疫球蛋白γ鏈抗體的條形碼01的載體。
同樣使抗人免疫球蛋白μ鏈抗體結合於含有條形碼02的載體50條上進行同樣處理，製備出帶有結合了抗人免疫球蛋白μ鏈抗體的條形碼02的載體。
(3)結合螢光的抗原的製備使FITC(螢光素異硫氰酸鹽)與人IgG反應，製備螢光標記的2nmol/ml的溶液A。同樣使FITC(螢光素異硫氰酸鹽)與人IgA和IgM反應，製備螢光標記的2nmol/ml的溶液(分別稱為溶液B、溶液C)。
(4)蛋白的反應向含有分別帶有上述(2)製備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7)10ml中添加上述(3)製備的結合螢光的抗原溶液A 100μL以及溶液B 100μL，分別於37℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。
然後用0.8μm醋酸纖維素濾膜(東洋濾紙公司生產的C080A047A)過濾，用0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7)洗兩次，再將載體分散於10ml同樣緩衝液中。將該溶液定為檢測樣品X。
另外向含有分別帶有上述(2)製備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7)10ml中添加上述(3)製備的結合螢光的抗原溶液C 100μL以及溶液B 100μL，分別於37℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。
然後用0.8μm醋酸纖維素濾膜(東洋濾紙公司生產的C080A047A)過濾，用0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7)洗兩次，再將載體分散於10ml同樣緩衝液中。將該溶液定為檢測樣品Y。
(5)檢測製作圖1、圖2所示的檢測裝置，一邊使上述(4)製備的X、Y溶液通過信號檢測裝置中的中空管，一邊進行條形碼和螢光的檢測。條形碼讀出器使用日榮インテツク公司生產的Hand Laser Scanner SL-114型，螢光檢測機使用日立F-4000型螢光分光光度計，用激發波長495nm、螢光波長520nm測定螢光強度。中空管是石英管玻璃管，內徑為2mm、流速為0.6cm/秒。由於條形碼的信號和螢光的信號檢測的時間差為36秒，按照時間差使含有特定條形碼的載體上的螢光信號對應。
表3給出了檢測結果。
表3

螢光強度考慮到噪音，將檢測到的螢光強度的最大值作為螢光強度，將鹼基序列一樣的5個條形碼02載體具有的螢光強度的平均值作為1。
結果可以確認檢測樣品為X時，對應於條形碼01的載體的螢光值明顯高。即在含有與條形碼01的抗人IgG反應的人IgG檢測樣品X中可檢測出對應於條形碼01的很強螢光，而檢測樣品為Y時，對應於條形碼02的載體的螢光值明顯高。即在含有與條形碼01的抗人IgM反應的人IgM檢測樣品Y中可檢測出對應於條形碼02的很強螢光。由於在無樣品時螢光值沒有升高，所以可以利用本發明方法檢測對特定蛋白質(抗體)具有特異反應的蛋白質(抗原)。
實施例5(1)帶有條形碼標記的抗生物素蛋白結合載體以及鼠免疫球蛋白結合載體的製作使用與實施例1同樣的方法以聚甲基丙烯酸甲酯作為材料，向其表面導入羧基，製作帶有條形碼01、以及條形碼02的長15mm的載體。與實施例1一樣，將含有條形碼01的載體50條分散於HEPES緩衝液10ml中，添加100μmol的羥基琥珀醯亞胺，然後再添加WSC 100μmol，使羧基琥珀醯亞胺化，然後用相同緩衝液洗淨載體後，立刻添加含有抗生物素蛋白1μmol/ml的緩衝液10ml，使抗生物素蛋白固定於載體上。再於1％BSA溶液中進行封閉，用蒸餾水洗淨，製備出帶有結合了抗生素蛋白的條形碼01的載體。
同樣使含有條形碼02的載體50條結合鼠免疫球蛋白G，進行同樣處理，製備出帶有結合了鼠免疫球蛋白G的條形碼02的載體。
(2)檢測樣品多肽溶液的製備合成由在氨基末端含有具有FITC的抗生物素蛋白結合特性的肽序列的15個胺基酸構成的序列6胺基酸序列的FITC標記多肽，溶解在含有0.1％BSA的PBS中，濃度為2nmol/ml，製備檢測溶液。
另外合成由在氨基末端不含有具有FITC的抗生素蛋白結合特性的肽序列的15個胺基酸構成的序列7胺基酸序列的FITC標記多肽，溶解在0.1％BSA/PBS中，濃度為2nmol/ml，製備檢測溶液。
(3)檢測樣品多肽溶液與載體的反應向含有分別帶有上述(2)製備的01和02條形碼的載體各5條的0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7)10ml中添加上述(2)製備的含有序列6胺基酸序列的檢測樣品、含有序列7胺基酸序列的檢測樣品，或不含有多肽的0.1％BSA/PBS 100μL，分別於37℃緩慢攪拌下，加熱30分鐘。
然後用0.8μm醋酸纖維素濾膜(東洋濾紙公司生產的C080A047A)過濾，用0.05mol/L的HEPES緩衝液(pH7)洗兩次，再將載體分散於10ml同樣緩衝液中。
(4)檢測製作圖1、圖2所示的檢測裝置，一邊使上述(3)製備的各個溶液通過信號檢測裝置中的中空管，一邊進行條形碼和螢光的檢測。條形碼讀出器使用日榮インテツク公司生產的Hand Laser Scanner SL-114型。螢光檢測機使用日立F-4000型螢光分光光度計，用激發波長495nm、螢光波長520nm測定螢光強度。中空管是石英管玻璃管，內徑為2mm、流速為0.6cm/秒。由於條形碼的信號和螢光的信號檢測的時間差為36秒，按照時間差使含有特定條形碼的載體上的螢光信號對應。表4給出了檢測結果。表4

螢光強度考慮到噪音，將檢測到的螢光強度的最大值作為螢光強度，將鹼基序列一樣的5個條形碼02的載體具有的螢光強度的平均值作為1。
結果，當檢測樣品為序列1檢測樣品時，可以確認對應於條形碼01的載體的螢光值明顯高。即在含有與條形碼01的抗生物素蛋白反應的多肽序列的序列1檢測樣品中可檢測出對應於條形碼01的很強螢光，而在序列2檢測樣品、以及無檢測樣品時，與具有任一個條形碼信號的載體相對應的螢光值都沒有升高，所以利用本發明方法可以對特定蛋白質(抗生物素蛋白)具有特異反應的多肽序列進行檢測。
工業實用性本發明可以提供應用方便、適用性高的檢測特定鹼基序列的方法，檢測特定鹼基序列的試劑和檢測特定鹼基序列的儀器。
序列表序列1-人工序列的說明合成DNA序列2-人工序列的說明合成DNA序列3-人工序列的說明合成DNA序列4-人工序列的說明合成DNA序列5-人工序列的說明合成DNA序列6-人工序列的說明合成多肽序列7-人工序列的說明合成多肽序列表110協和梅迪克斯株式會社120物質的檢測方法13011275WO1140141150JP 2000-0298301512000-02-071607170PatentIn Ver.2.0210121115212DNA213人工合成序列220223人工序列的說明合成DNA4001aaattgagta gttgc 15210221115212DNA213人工合成序列220223人工序列的說明合成DNA4002aaaaacatct ccggg 15210321114212DNA213人工合成序列220223人工序列的說明合成DNA4003ggtcaggaac aaaa14210421124212DNA213人工合成序列220223人工序列的說明合成DNA4004ttgttcctga ccgcaactac tcaa 24210521124212DNA213人工合成序列220223人工序列的說明合成DNA4005tacgatatgg ctccttggaa ctcg 24210621124212peptide213人工合成序列220223人工序列的說明合成多肽4006Ile Ser Phe Glu Asn Thr Trp Leu Trp His Pro Gln Phe Ser Ser1 5 10210721124212peptide213人工合成序列220223人工序列的說明合成多肽4007Ile Ser Phe Glu Asn Thr Trp Leu Trp Thr Ser Pro Phe Ser Ser1 5 10
權利要求
1.樣品中待檢測物質的檢測方法，其特徵為作為懸浮於溶液且貫流於在可檢測信號A和信號B的信號檢測裝置中形成的信號檢測用中空管時，相對於中空管的橫斷面具有不重複移動形狀的載體，藉助或不藉助間隔臂使對待檢測物質有結合能力的物質(以下省略為結合子)結合的帶有可識別信號A的載體與含有待檢測物質的樣品在溶液中混合，使待檢測物質與該結合子結合，通過該結合使信號B在載體上形成後，通過與該中空管連通的溶液供應裝置使該載體懸浮液在該中空管中貫流，利用該信號檢測裝置檢測信號A和信號B，將信號A和信號B聯繫起來。
2.權利要求1記載的檢測方法，其中待檢測物質是具有特定鹼基序列的物質，結合子是具有與待檢測物質的鹼基序列或其部分序列互補的鹼基序列的物質。
3.權利要求2記載的檢測方法，其中待檢測物質和結合子的結合是通過互補鹼基序列的雜交進行的。
4.權利要求3記載的方法，其中可識別的信號A是與結合子的鹼基序列有關的信號。
5.權利要求3記載的方法，其中載體是具有與結合子的鹼基序列有關的相互識別的信號A，含有相互不同的信號A的多個載體的混合物。
6.權利要求2～5任一項記載的方法，其中結合子是鹼基數5～500的DNA、RNA或PNA。
7.權利要求3～6任一項記載的方法，其中載體上的信號B的形成是通過使可識別結合子的鹼基序列和待檢測物質的鹼基序列雜交的帶有標記的化合物結合實現的。
8.權利要求7記載的方法，其中可識別雜交的帶有標記的化合物是使具有與待檢測物質含有的、與結合子鹼基序列相對應的互補序列以外的剩餘鹼基序列互補的鹼基序列的化合物和標記化合物結合的化合物。
9.權利要求8記載的方法，其中具有與待檢測物質含有的、與結合子鹼基序列相對應的互補序列以外的剩餘鹼基序列互補的鹼基序列的化合物是鹼基數為5～500的DNA、RNA或PNA。
10.權利要求7記載的方法，其中可識別雜交的帶有標記的化合物是使識別該雜交的抗體和標記化合物結合的化合物。
11.權利要求7記載的方法，其中可識別雜交的帶有標記的化合物是使識別該雜交的嵌入劑和標記化合物結合的化合物。
12.權利要求11記載的方法，其中包括將沒有與載體結合的帶有標記的化合物與載體分離的工序。
13.權利要求7～12任一項記載的方法，其中標記化合物是螢光物質、發光物質、酶或通過酶發螢光或發光的化合物。
14.權利要求13記載的方法，其中載體是使發螢光的物質結合的載體，標記化合物是通過能量轉移發螢光的化合物。
15.權利要求7記載的方法，其中可識別雜交的帶有標記的化合物是通過嵌入生成信號B的化合物。
16.權利要求1記載的方法，其中結合子是具有與待檢測物質結合能力的蛋白質。
17.權利要求1～16任一項記載的方法，其中可識別信號A是數位訊號。
18.權利要求17記載的方法，其中數位訊號A是磁學或光學上的信號。
19.權利要求17記載的方法，其中數位訊號A是條形碼。
20.權利要求1～19任一項記載的方法，其中中空管的形狀是圓柱形，而且載體是具有比中空管的內徑小的外形的圓柱形，該圓柱形的長度比中空管的內徑大。
21.權利要求1～20任一項記載的方法，其中載體是圓柱形或球形。
22.權利要求21記載的方法，其中載體內部存在磁性粒子。
23.權利要求1～22任一項記載的方法，其中載體是圓柱形，外徑直徑為1μm～2mm，長度為10μm～2cm。
24.權利要求1～23任一項記載的方法，其中載體的比重為0.8～2.0。
25.權利要求1～24任一項記載的方法，其中載體的表面是用樹脂包被的。
26.一種藉助於或不藉助於間隔臂和具有與待檢測物質結合能力的結合子結合的帶有可識別信號A的載體。
27.權利要求26記載的載體，其中結合子是含有與待檢測鹼基序列或其部分序列互補的鹼基序列的物質。
28.權利要求26的載體，其中結合子是具有與待檢測物質結合能力的蛋白質。
29.權利要求26～28任一項記載的載體，是內部存在磁性粒子的載體。
30.權利要求26～29任一項記載的載體，其中信號A是數位訊號。
31.權利要求30記載的方法，其中數位訊號A是條形碼。
32.權利要求26～31任一項記載的載體，其中載體是圓柱形或球形的。
33.權利要求26～32任一項記載的載體，其中載體是圓柱形，外徑直徑為1μm～2mm，長度為10μm～2cm。
34.權利要求26～33任一項記載的載體，其中載體的比重為0.8～2.0。
35.權利要求26～34任一項記載的載體，其中載體的表面是用樹脂包被的。
36.特定物質的檢測儀器，其特徵為具有信號檢測裝置、數據輸入裝置、數據處理裝置和數據輸出裝置，該信號檢測裝置具備信號檢測器A和B，這兩個檢測器可檢測處於載體上的至少兩種信號A和B，該載體藉助或不藉助間隔臂和具有與待檢測的鹼基序列或其部分序列互補的鹼基序列的結合子結合；該信號檢測器A和B含有使該載體貫流的中空管，而該載體具有相對於該中空管的橫斷面不重複移動的結構；該數據處理裝置具備以下功能通過特定與從數據輸入裝置輸入的載體上信號A有關的待檢測特定物質的數據和信號檢測裝置檢測的信號A和B，使載體上信號A和該特定物質建立聯繫，將該相關的數據輸出到數據輸出裝置。
全文摘要
本發明涉及樣品中待檢測物質的檢測方法，其特徵為作為懸浮於溶液且貫流於在可檢測信號A和信號B的信號檢測裝置中形成信號檢測用中空管時，相對於中空管的橫斷面具有不重複移動形狀的載體，藉助或不藉助間隔臂使對待檢測物質有結合能力的物質(以下省略為結合子)結合的帶有可識別信號A的載體與含有待檢測物質的樣品在溶液中混合，使待檢測物質與該結合子結合，通過該結合使信號B在載體上形成後，通過與該中空管連通的溶液供應裝置使該載體懸浮液在該中空管中貫流，利用該信號檢測裝置檢測信號A和信號B，將信號A和信號B聯繫起來。
文檔編號G01N33/58GK1397020SQ01804454
公開日2003年2月12日 申請日期2001年2月7日 優先權日2000年2月7日
發明者三池彰, 森秀治 申請人:協和梅迪克斯株式會社