壓電基因診斷實時定量分析方法與儀器的製作方法
2023-09-27 06:14:15
專利名稱：壓電基因診斷實時定量分析方法與儀器的製作方法
技術領域：
本發明屬於體外基因檢測方法和實施該方法的儀器。
背景技術：
絕大多數疾病的發生發展都與患者遺傳背景或者其改變有關，基因診斷是指運用基因分析對疾病做出診斷的方法。基因診斷的對象首先是病原生物的侵入，直接檢測病原生物的遺傳物質可以大大提高診斷的敏感性和特異性，而且在無法得到商業化抗體時，基因診斷就成為檢測病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯一手段；其次是先天遺傳性疾患，一些發病原因確定的遺傳性疾患和其它病因尚不清楚的疾病都可能與某個或某些基因的持有或改變有關；再者是後天基因突變引起的疾病，例如腫瘤的發生可以初步認為是由於個別細胞基因如抑癌基因或癌基因發生突變而引起的細胞無限增殖；其它如DNA指紋、個體識別、親子關係識別、法醫物證等。基因診斷不僅對臨床診斷，而且對疾病的病因和發病機理的研究、為病人檢測療效，分析愈後，客觀正確地評價人體的健康狀況都具有重要的意義。基因診斷技術的應用，使許多疑難病的診斷變得簡便、精確，避免了臨床上有些病症靠經驗指導治療的盲目性，達到了最早、最有效、最經濟的治療目的。
但是基因樣品的缺乏是進行基因診斷的一大障礙。聚合酶鏈式反應(PCR)技術的問世，為此提供了有效的手段。PCR技術是利用熱穩定的DNA合成酶-Taq多聚酶在體外合成DNA片段，通過反覆循環的DNA變性、退火和延伸，可使靶DNA得到大量擴增。PCR擴增DNA片段只是一個重要手段，擴增片段的檢測和分析才是目的，因此，PCR擴增後根據研究對象和目的的不同而主要採用以下兩種分析方法凝膠電泳分析法通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯醯胺凝膠電泳，電泳後用溴化乙澱染色，於UV燈下觀察結果並拍照。凝膠電泳可以鑑定產物的大小，檢測擴增的情況。斑點雜交法首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。斑點雜交法有助於檢測突變DNA的突變類型，用於人類遺傳病診斷和某些基因的分型。
PCR技術用於定量基因診斷還需採用特定的方法。《中華檢驗醫學雜誌》2000，23(2):120-121發表的「定量聚合酶鏈反應的研究進展與臨床應用」文章，綜述了幾種傳統定量PCR方法，主要包括內標法在不同的PCR反應管中加入已定量的人工合成內標和-對引物(其一為螢光標記)，在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由於內標與模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳分離開來，分別測定其螢光強度，以內標為對照定量檢測模板。PCR-ELISA法利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再與加入的酶標抗地高辛或抗生物素結合，最終酶使底物顯色。常規的PCR-ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。但上述傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。加入內標後，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，由於在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，PCR反應中存在內標與模板之間的幹擾和競爭，尤其當兩者的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。另外由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。因此，傳統定量方法雖然加入內標，但實際上仍然只是一種半定量的方法。
為此，實時螢光定量PCR技術於1996年提出，由於該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR汙染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。美國Applied Biosystems公司1999年公開的「DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev.AB」報告，介紹了實時螢光定量PCR技術的原理和特點。所謂實時螢光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光探針，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。螢光定量PCR成功的一個關鍵是採用特殊的螢光探針實現了螢光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。實時螢光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次螢光信號的強度。在該技術中，將PCR反應的前15個循環的螢光信號即螢光本底信號作為螢光域值，每個反應管內(即每個模板)的螢光信號到達域值時所經歷的循環數(Ct)與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關係，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。與傳統PCR的內標定量方法比較，實時螢光定量PCR是一種採用外標準曲線定量的方法。由於PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期(對數期)，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性較好，大大提高了定量的準確性和重現性。
另外，近年出現的基因晶片技術也可望應用於基因診斷。基因晶片技術是指將大量基因探針分子(基因探針陣列)固定於支持物上後與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息，實現對基因的準確、快速、大信息量的檢測。基因晶片技術解決了傳統核酸印跡雜交技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的基因診斷應用。《生物工程進展》1999,Vol.19(No.4)45-51發表的「基因晶片技術及應用研究進展」文章，綜述了國內外對基因晶片技術在加工製備、功能和應用方面的主要研究成果。現有基因晶片技術一方面基因晶片的製備主要是採用固相原位合成結合照相平板印刷的技術在玻璃片等載體上合成、固定探針分子陣列；另一方面基因晶片的檢測主要是利用螢光素等標記靶基因，藉助雷射共聚焦顯微掃描技術或電荷藕合器件攝像技術對基因晶片上雜交靶基因的螢光信號進行檢測和分析。
上述實時螢光定量PCR和基因晶片技術，一方面，均是採用螢光檢測，需要大型複雜、精密昂貴的檢測設備，同時需要較長時間(3-4小時)，即需在多次(15次以上)擴增循環後，或完成雜交反應後進行檢測，而且影響分析結果準確性的因素較多，難以控制把握，易產生假陽性結果，並且需對靶基因或探針進行螢光標記，增加了消耗試劑成本；另一方面，一次分析過程包括多步操作，尤其是包括樣品預處理、靶基因獲取和標記等，操作繁瑣，整個分析系統難以集成化、自動化和小型化。這些缺陷是目前推廣普及基因診斷技術的難以逾越的障礙。
發明內容
鑑於此，本發明的目的是針對現有基因診斷技術存在的上述問題，提供一種準確靈敏、快速高效、自動簡便、成本低廉的壓電基因診斷實時定量分析方法與儀器。
為達上述目的，本發明利用多重PCR技術同時擴增多種靶基因，採用基因探針診斷技術與壓電傳感器晶片技術相結合的壓電基因診斷晶片，同時識別雜交多種靶基因，並實時獲取各個探針一靶基因雜交的反應信息，以準確靈敏、快速高效、簡便價廉地進行基因診斷的分析；另一方面，本發明將樣品處理、進樣檢測、結果分析等基因診斷分析過程的各個模塊集成於一個系統，構建壓電基因診斷實時定量分析儀器，採用微機和特定程序，以自動控制進行基因診斷定量分析的各個環節，並動態顯示各環節信息，來實施本發明的基因診斷分析方法。
本發明的壓電基因診斷實時定量分析方法，對某類疾病的基因診斷定量分析，採用有至少一種疾病基因的探針的壓電基因診斷晶片，將有至少一種靶基因、相應的引物、Taq-DNA多聚酶、三磷酸脫氧核苷的樣品與壓電基因診斷晶片接觸，進行雜交-延伸-變性的溫度循環，雜交溫度為30-70℃，延伸溫度為65-80℃，變性溫度為85-99℃；溫度循環起點為變性溫度10-60秒，然後雜交溫度10-60秒，終點為延伸溫度10-60秒；在雜交階段，樣品中的各靶基因與對應的疾病基因的探針及引物基於序列互補進行雜交結合；在延伸階段，雜交的探針和引物以靶基因為模板在Taq-DNA多聚酶的作用下進行多聚酶鏈反應，使探針和引物得到延伸，直至兩者的鏈長與靶基因相同；在變性階段，探針-靶基因、引物-靶基因雜合物解離，並根據第一個雜交階段的頻率變化即本底噪聲設置頻率變化的域值，當頻率變化超過域值時，停止循環，再根據頻率變化達到域值所需的循環次數與樣品中靶基因濃度的對數存在線性關係，用外標準曲線進行靶基因的定量分析。
上述探針、引物為20-30個鹼基、序列與靶基因互補、且兩者序列不重複的寡核苷酸；本底噪聲(G)為預定的時間內頻率變化的標準偏差，或為預定的時間內頻率變化的極差(最大頻率與最小頻率之差)，頻變域值(fR)設為本底噪聲(G)的2-10倍；頻率變化達到域值所需的循環次數(Nt)與樣品中靶基因濃度(CT)的關係為Nt=AlogCT+B，式中A和B對某一傳感器和靶基因在同一溫度循環下為與CT無關的常數；外標準曲線是通過測定2-10個含已知濃度靶基因的標準溶液，測出對應的各Nt對logCT作圖得出的標準曲線；樣品中靶基因的濃度是根據標準曲線和樣品達到域值所需的循環次數測得。
實施本發明的基因診斷分析方法的壓電基因診斷實時定量分析儀(參見附圖1、2)，包含殼體(10)，殼體上的控制面板、顯示器，殼體中的電源(20)及其相聯接的電路、微型計算機的主板模塊(60)、分析軟體，其特徵在於殼體中有與電路和主板模塊相聯接的能一次提取至少一個臨床DNA樣品的樣品製備模塊(30)、選擇並輸送樣品的定位液流模塊、擴增並檢測靶基因的壓電基因診斷晶片檢測模塊(50)。
上述的樣品製備模塊(30)有由2-100個、容積為0.2-2cm3的放置試管的微孔構成的微孔板(31)，有由加熱與製冷器件及其相聯接的溫度傳感器構成的溫度控制器(32)。
上述的定位液流模塊，有由驅動機驅動的機械臂(41)及其相連的吸針(42)，吸針、蠕動泵(43)、壓電基因診斷晶片檢測模塊(50)、廢液儲存瓶(47)依次連通，壓電基因診斷晶片檢測模塊的進口和出口分別有液位傳感器(44、45)。
上述的壓電基因診斷晶片檢測模塊(50)有微體積流通型檢測池(52)和封裝在其中的由壓電基因傳感器陣列構成的壓電基因診斷晶片(51)，與電路及主板模塊(60)中壓電基因診斷晶片檢測電路相連。微體積流通型檢測池(52)有在檢測池上的半導體加熱與製冷器件及其相聯接的溫度控制器(53)。
使用本發明的壓電基因診斷實時定量分析儀(參見附圖)，首先，根據臨床診斷對象，選擇相應的壓電基因診斷檢測模塊和基因診斷試劑試管，將壓電基因診斷晶片檢測模塊置入壓電基因診斷實時定量分析儀中，將配備好的樣品溶液和標準溶液加入基因診斷試劑試管並置入樣品製備模塊。然後，通過分析軟體設置標準溶液濃度、樣品序列及其待檢靶基因組、以及樣品製備、定位液流和壓電基因診斷晶片檢測模塊的參數。最後，由程序控制自動實施並動態顯示樣品製備、定位液流和壓電基因診斷晶片檢測模塊的狀態，以及壓電基因診斷晶片的檢測信號(頻率變化)，當頻率變化達到設定的頻變域值時，停止循環，壓電基因診斷晶片檢測模塊保持在變性階段，同時開始吸取清洗溶液，壓電基因診斷晶片各位點頻率指示各位點恢復檢測前頻率後，排空檢測池溶液，測定下一個樣品。完成所有樣品測定後，進入數據分析界面，給出各靶基因的標準曲線及其線性參數(斜率、截距和相關係數)，以及各樣品中各待測靶基因的濃度。
本發明與已有基因診斷技術比較，具有如下的優點和效果。
首先，本發明壓電基因診斷實時定量分析方法，採用壓電傳感器晶片與基因診斷技術相結合的壓電基因診斷晶片，一方面具有壓電傳感技術高靈敏、實時監測晶片上探針-靶基因雜交反應的獨特優勢，實現了在壓電基因診斷晶片上同時進行雜交反應與信號檢測兩個步驟，使本發明分析方法簡便快捷；另一方面，又具有基因診斷晶片大信息量、高效率的優勢，使本發明分析方法可一次同時對多個靶基因進行檢測。
其次，本發明壓電基因診斷實時定量分析方法，一方面，建立在動態跟蹤分析探針-靶基因雜交反應的基礎上，消除了終點檢測方法中影響分析結果準確性的因素，使本發明分析方法更為準確可靠；另一方面，通過探針雜交確定靶基因，因探針的序列具有特異性，故避免了假陽性，也保證了本發明分析結果的可靠性。
再次，本發明壓電基因診斷實時定量分析方法，一方面，所用探針和靶基因都不需標記，也不另加標記物，既降低了試劑費用，又對環境無汙染；另一方面，與通常PCR用螢光檢測基因需擴增至50-100ng數量級相比，只需擴增至pg數量級，大大減少了循環次數，縮短了檢測時間，同時還大大減少了試劑如Taq酶的用量，節省了診斷檢驗的消耗費用。
最後，本發明構建的壓電基因診斷實時定量分析儀，一方面，壓電基因診斷晶片的檢測即頻率測量精度高而相關電路簡單，價廉且易於小型化；另一方面，將包括樣品製備、基因擴增和檢測、數據分析的整個分析過程集成化，操作簡便，自動高速，可在一個系統、短時間內完成從原始樣品到獲取所需分析結果的全套操作，而且，全分析過程的集成化同時使分析體系與外界嚴密隔離，有效避免了汙染，對外界環境無須嚴格的潔淨要求。
本發明適於臨床疾病診斷及分子機理的研究、監測流行病和傳染病擴散、監測有害微生物的發生和擴散等，具有廣泛的應用前景。
下面，再用實施例及其附圖對本發明作進一步地說明。
附圖的簡要說明。
圖1是本發明的一種壓電基因診斷實時定量分析儀的結構示意圖。
圖2是圖1的結構原理圖。
圖3是使用圖1進行基因診斷分析時壓電基因診斷檢測模塊的溫度循環圖。
圖4是使用圖1進行基因診斷分析時壓電基因診斷晶片一個位點與圖3對應的頻率變化-時間關係圖。
圖5是使用圖1進行基因診斷分析時對同一靶基因濃度多次測定的頻率變化-循環次數關係圖。
圖6是本發明壓電基因診斷實時定量分析法的一種靶基因的標準曲線圖。
具體實施例方式
實施例1本發明的一種壓電基因診斷實時定量分析儀，如附圖1、2所示。由殼體10、電源20、樣品製備模塊30、定位液流模塊、壓電基因診斷晶片檢測模塊50、電路及主板模塊60、以及壓電基因診斷實時定量分析儀軟體等構成。
上述殼體10，和殼體中的電源20，採用通常分析儀器的殼體和電源結構。殼體提供內裝結構和外觀造型，使儀器內部各模塊間緊湊且無幹擾，外型美觀。殼體面上有與微機相連的控制面板11和顯示器12，控制面板上有通常的數字鍵、上下左右鍵以及確認和消除鍵，顯示器為通常分析儀器的顯示器。電源向各模塊提供工作電源。
上述樣品製備模塊30，實現多個樣品的同時製備，即一次完成多個臨床樣品的DNA提取，由微孔板31和溫度控制器32構成。上述的微孔板31用熱導性良好的金屬材料，如金、銀、銅、鋁等，製成矩形或圓形板，板上開制有多個微孔，微孔體積為0.2-2cm3，微孔數為2-100，微孔的數量和體積，以及由此而定的板的大小，視實際應用的需要而定。上述的溫度控制器32由用半導體製成的加熱與製冷器件和溫度傳感器構成，與主板及電路模塊60中相應電路相連，受相應子程序控制，上述溫度控制的精度為±0.1℃以下，加熱和製冷速度在1.5℃/sec以上，恆溫時每分鐘的波動小於±0.1℃。
上述定位液流模塊，實現自動選擇進樣，選定吸取待測溶液並送入檢測池，由通常結構的機械臂41、吸針42、蠕動泵43、液位傳感器44、45、連接膠管46構成。上述的機械臂41，包含X、Y二坐標數控聯動及Z坐標驅動機械結構，與主板及電路模塊60中相應電路相連，受相應子程序控制。上述的吸針42，用耐熱、耐化學腐蝕的材料，如不鏽鋼、聚四氟乙烯等製成，固定在機械臂41上。上述的蠕動泵43，採用通常蠕動泵的殼體和結構，與主板及電路模塊60中相應電路相連，受相應子程序控制。上述的液位傳感器44、45採用光電式液體位置傳感器，分別安置在壓電基因診斷晶片檢測池52的前後，與電路及主板模塊60中相應電路相連。上述的連接膠管46，採用耐熱、耐熱、耐化學腐蝕的彈性材料，如聚四氟乙烯等製成，與吸針42和檢測池52相連，通向廢液儲存瓶47。
上述壓電基因診斷晶片檢測模塊50，實現靶基因的擴增和檢測，由壓電基因診斷晶片51、微體積流通型檢測池52、溫度控制器構成。上述的壓電基因診斷晶片51，由壓電基因傳感器陣列構成，上述壓電基因診斷晶片封裝於微體積流通型檢測池52中，與電路及主板模塊60中的壓電基因診斷晶片檢測電路相連。上述的微體積流通型檢測池52，由檢測池52和安裝在檢測池上的半導體加熱與製冷器件及其溫度控制器53構成，與電路及主板模塊60中溫度檢測與控制電路相連。上述壓電基因診斷晶片檢測電路頻率測量的精度為1Hz以下、每分鐘的波動小於±1Hz，上述溫度測量的精度為±0.1℃以下，加熱和製冷速度在1.5℃/sec以上，恆溫時每分鐘的波動小於±0.1℃。
上述電路及主板模塊60，為各模塊提供工作電路及接口電路，以及微機功能，由上述各模塊的電路和微機主板構成，微機主板採用奔騰Ⅱ以上，有良好的穩定性和可擴展性，如華碩2000年標準主板P3V133。各模塊電路通過接口與微機主板相連。
上述壓電基因診斷實時定量分析軟體，實現系統總控以及數據分析。分析軟體由總控界面以及數據分析界面構成。上述的總控界面由與上述各模塊子程序通信、進行系統總控、系統初始化與檢測模式設置、各模塊功能顯示、檢測數據調用和動態曲線顯示等子程序構成。上述的數據分析界面給出標準曲線及其線性參數(斜率、截距和相關係數)，和靶基因濃度。
使用本發明的上述壓電基因診斷實時定量分析儀實施本發明的壓電基因診斷實時定量分析方法的工作過程如下首先，在潔淨的、通常的試管如Ependoff管中，加入10-100μl準備好的標準溶液系列和樣品溶液。標準溶液系列為兩種或兩種以上包括空白(靶基因濃度為0)和已知濃度待檢靶基因組的溶液，如靶基因濃度為0、0.1×10-5mol/L的兩個標準溶液，或0、0.1×10-5、1×10-5mol/L的三個標準溶液，或0、0.1×10-5、0.5×10-5、1×10-5mol/L的四個標準溶液等。在上述各溶液試管中加入含引物、Taq-DNA多聚酶、三磷酸脫氧核苷的基因診斷試劑，使待檢靶基因與相應的引物、Taq-DNA多聚酶、三磷酸脫氧核苷的樣品與壓電基因診斷晶片接觸，隨後，分別放入樣品製備模塊的微孔板的各微孔中。然後，通過總控界面和控制面板輸入而設置標準溶液濃度、樣品序列及其待檢靶基因組、樣品製備的溫度與時間、以及溫度循環的溫度與時間等參數。
然後，由微機主板的程序控制下實施並動態顯示下列步驟①由溫度控制器控制，加熱樣品製備模塊而預製樣品，即加熱溫度85-99℃，並保持時間10-100秒。
②機械臂將吸針運動至預定的微孔板中的一個樣品試管內，開啟蠕動泵吸取樣品並注入檢測池，當液位傳感器指示檢測池充滿樣品後，停止吸取、停止注入。
③按進行雜交-延伸-變性的溫度循環，溫度循環的溫度和時間為變性階段85-99℃、10-60秒，雜交階段30-70℃、10-60秒，延伸階段65-80℃、10-60秒，如附圖3所示。在溫度循環的同時在顯示器上實時顯示壓電基因診斷晶片各與預定待檢靶基因組對應的位點頻率變化-時間曲線，如附圖4所示，並根據各位點在第一個雜交階段的頻率變化確定該位點的頻變域值，如10-100Hz，當各位點頻率變化達到或超過設定的頻變域值時，停止溫度循環，並確定各位點達到頻變域值時的循環次數。
④將檢測池加熱並保持在變性溫度，同時由吸針開始吸取清洗溶液清洗檢測池，待壓電基因診斷晶片各位點頻率指示各位點恢復檢測前頻率後，排空檢測池溶液並送至廢液儲存瓶。
重複第②～④步操作，測定其餘樣品。
⑤完成所有溶液的檢測後，通過數據分析界面，程序處理數據，由標準溶液系列的結果得出各靶基因檢測循環次數-靶基因濃度對數的標準曲線，如附圖6所示，再根據樣品靶基因檢測的循環次數得出樣品靶基因的濃度。
如前所述，本發明僅需較少的循環次數，通常少於10次，就可達到靶基因檢出所需的頻率變化，如附圖5所示，對同一濃度靶基因的溶液，多次測定頻率變化與溫度循環次數的關係，結果表明，達到頻變域值的循環次數有極好的重現性，但此後隨溫度循環次數的增加，不同測定下的頻率變化相差越大。因此，與實時螢光定量PCR技術循環次數通常在15次以上相比，本發明基因定量分析具有更高的準確性和重現性，且時間更短的優點。
權利要求
1.壓電基因診斷實時定量分析方法，其特徵在於採用壓電基因診斷晶片和頻率檢測儀，在壓電基因診斷晶片的電極陣列上固定有至少一種疾病基因的探針，將已加入含至少一種靶基因的引物、Taq-DNA多聚酶、三磷酸脫氧核苷的基因診斷試劑的樣品與壓電基因診斷晶片接觸，進行雜交-延伸-變性的溫度循環，其雜交溫度為30-70℃，延伸溫度為65-80℃，變性溫度為85-99℃，溫度循環的起點為變性溫度10-60秒，然後雜交溫度10-60秒，終點為延伸溫度10-60秒；在雜交階段，靶基因與探針、引物基於序列互補進行雜交結合，在延伸階段，雜交的探針和引物以靶基因為模板在Taq-DNA多聚酶的催化作用下進行多聚酶鏈反應，使探針和引物得到延伸，在變性階段，探針-靶基因、引物-靶基因雜合物解離，隨溫度循環次數的增加，樣品中靶基因濃度增大，與探針結合的靶基因量擴增，使電極表面質量增加而各檢測位點的頻率發生變化，在溫度循環全過程中監測頻率變化，將第一個雜交階段的頻率變化即本底噪聲設置為頻率變化的域值，當頻率變化超過域值時，停止溫度循環，根據頻率變化達到域值所需的循環次數與樣品中靶基因濃度的對數存在的線性關係，用外標準曲線對靶基因進行定量分析。
2.根據權利要求1所述的壓電基因診斷實時定量分析方法，其特徵在於所說的探針和引物均為20-30個鹼基、序列與靶基因互補、且兩者序列不重複的寡核苷酸；本底噪聲即G為預定的時間內頻率變化的標準偏差，或為預定的時間內頻率變化的最大頻率與最小頻率之間的極差；頻率變化的域值即fR為本底噪聲的2-10倍；頻率變化達到域值所需的循環次數即Nt與樣品中靶基因濃度即CT的關係為Nt=AlogCT+B，式中A和B為常數；外標準曲線是經測定2-10個含已知濃度靶基因的標準溶液所得對應的各Nt對logCT作圖得出的曲線。
3.實施權利要求1或2所述方法的壓電基因診斷實時定量分析儀，包含殼體(10)，殼體上的控制面板、顯示器，殼體中的電源(20)及其相聯接的電路、微型計算機的主板模塊(60)、分析軟體，其特徵在於殼體中有與電路和主板模塊相聯接的能一次提取至少一個臨床DNA樣品的樣品製備模塊(30)、選擇並輸送樣品的定位液流模塊(40)、擴增並檢測靶基因的壓電基因診斷晶片檢測模塊(50)。
4.根據權利要求3所述的壓電基因診斷實時定量分析儀，其特徵在於所說的樣品製備模塊(30)有由2-100個、容積為0.2-2cm3的放置試管的微孔構成的微孔板(31)，有由加熱與製冷器件及其相聯接的溫度傳感器構成的溫度控制器(32)。
5.根據權利要求3所述的壓電基因診斷實時定量分析儀，其特徵在於所說的定位液流模塊有由驅動機驅動的機械臂(41)及其相連的吸針(42)，吸針、蠕動泵(43)、壓電基因診斷晶片檢測模塊(50)、廢液儲存瓶(47)依次連通，壓電基因診斷晶片檢測模塊的進口和出口分別有液位傳感器(44、45)。
6.根據權利要求3所述的壓電基因診斷實時定量分析儀，其特徵在於所說的壓電基因診斷晶片檢測模塊(50)有微體積流通型檢測池(52)和封裝在其中的由壓電基因傳感器陣列構成的壓電基因診斷晶片(51)，有在檢測池上的半導體加熱與製冷器件及其相聯接的溫度控制器(53)。
全文摘要
本發明的壓電基因診斷實時定量分析方法與儀器屬於基因的體外檢測方法和實施該方法的儀器。旨在解決已有技術準確性差、操作繁雜等問題。本方法是採用壓電基因診斷晶片和頻率檢測儀,利用多重PCR技術進行雜交—延伸—變性的溫度循環擴增靶基因,監測並獲得頻率變化與靶基因濃度的的線性關係,再用外標準曲線進行定量分析。本儀器包含殼體、電源及其相聯接的電路和主板模塊、分析軟體、樣品製備模塊、定位液流模塊、壓電基因診斷晶片檢測模塊。適於臨床疾病診斷及分子機理的研究、監測流行病和傳染病擴散、有害微生物的發生和擴散等。
文檔編號G01N33/53GK1325028SQ0110861
公開日2001年12月5日 申請日期2001年7月10日 優先權日2001年7月10日
發明者莫志宏, 吳中福, 靳萍, 田學隆, 郭剛 申請人:重慶大學