一種線粒體靶向的粘度螢光探針及其製備方法和應用與流程
2023-10-28 03:40:32
本發明涉及一種線粒體靶向的粘度螢光探針及其製備方法和應用，屬於分析化學技術領域。
背景技術：
粘度是衡量一種濃稠流體的流動性和擴散性的主要因素，同時是流體擴散速率的主要參考指標。微環境的粘度在病理學研究中起到非常重要的作用，因為粘度的變化往往會影響到細胞內環境中各種新陳代謝的進行。從細胞生物力學的角度看，細胞結構可以分為細胞質，細胞膜和細胞骨架。其中細胞骨架被認為是剛性的結構，而細胞膜和細胞質則具有一定的粘彈性。當細胞處於病理狀態時，細胞內粘度就會發生變化。所以粘度就是衡量這種粘彈性的參考指標。粘度極大地影響細胞質內質量和信號的運輸，生物大分子之間的相互作用，以及活性代謝ROS和RNS在細胞內水平上的擴散。
細胞內不同區域的粘度在生物系統中起著非常重要的作用，而不同區域的粘度變化就會引起相應的生理功能的改變或疾病的發生。線粒體是細胞產生能量的倉庫，粘度的改變可以通過降低線粒體膜的流動性，增加ROS的產生。被廣泛證明，增加線粒體粘度可能會導致一些疾病，如阿茲海默症，帕金森病，糖尿病等。因此，量化細胞內線粒體粘度十分重要。
本專利通過分子設計合成了線粒體靶向的粘度螢光探針，隨著粘度的增加，探針的螢光強度顯著增強，具有高度的靈敏性。並且可以對細胞內微環境的粘度進行螢光成像。
技術實現要素：
針對目前粘度螢光探針檢測所面臨的問題的現狀，本發明通過分子設計，合成出一種具有線粒體靶向的粘度螢光探針，本發明還提供了該探針的製備方法和應用。
本發明採用以下技術方案：
一種線粒體靶向的粘度螢光探針，該探針分子的分子式為：C37H43N4O3+，其結構式如下所示：
上述的粘度螢光探針的製備方法，它包括以下步驟：
1)將1eq的N，N-二乙基水楊醛，1eq的米氏酸溶於50mL乙醇中，攪拌過程中加入0.5mL哌啶，常溫反應20min，然後90℃加熱回流反應2h，用TCL板檢測反應，反應完全後，冷卻至室溫，減壓過濾，真空乾燥，得到粗產品，用二氯甲烷溶解後通過柱色譜進行分離純化得到化合物1-1；
2)將1eq的化合物1-1溶於5mLDMF中，然後依次加入1eq的N-羥基琥珀醯亞胺，1.1eq的EDCI，常溫反應12h，反應完全後，將反應液倒入100mL冰水中，有固體析出，減壓過濾，水洗，真空乾燥，得到粗產品，用二氯甲烷溶解，通過柱色譜分離得到化合物1-2；
3)將1eq的化合物1-2溶於10mLDCM中，然後依次加入1.5eq的3-溴丙胺氫溴酸，1.5eq的TEA，黑暗條件下，常溫反應6h，反應完全後，減壓旋幹溶劑得粗產品，並通過柱色譜分離得到化合物1-3；
4)將1eq的化合物1-3和1eq的2,3,3,-三甲基吲哚溶於1mLDMF中，氮氣保護，100℃加熱回流反應12h，反應完全後，二氯甲烷萃取2次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉乾燥，減壓旋幹溶劑得粗產品，並通過柱色譜分離得到化合物1-4；
5)將1eq的化合物1-4和1eq的4-二甲氨基苯甲醛溶於10mL乙醇中，氮氣保護，90℃加熱回流反應10h，反應完全後，二氯甲烷萃取2次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉乾燥，減壓旋幹溶劑得粗產品，並用通過柱色譜分離得到目標探針化合物，簡記為CI-Vis。
所述步驟1)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。
所述步驟2)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:50。
所述步驟3)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:30。
所述步驟4)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。
所述步驟5)中柱色譜分離用洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:15。
上述的粘度螢光探針的合成路線如下：
本發明所述的線粒體靶向的粘度螢光探針的用途，該螢光探針可以應用於水環境和生物細胞體系中粘度變化的傳感檢測；所述的傳感檢測包含螢光檢測，目視定性檢測，細胞成像檢測。
本發明的優點在於：(1)探針的合成只需要幾步就可以完成，且後處理過程相對簡單；(2)本發明實現了粘度探針的高靈敏性，靶向性好的特點。此外，用肉眼就可以觀察到隨著溶液粘度的增加而發生的顏色的變化，伴隨著紫外燈下同樣可以觀察到螢光顏色變化，是一種具有生色傳感功能的螢光探針。基於其特異性且顯著的顏色變化，該試劑可作為顯示水溶液中和生物細胞內粘度變化的指示劑，可進行實時定性及定量的目視比色法檢測。故而，本發明是一種簡單，快速，靈敏的粘度特異性檢測試劑，在生物分子檢測領域具有廣闊的應用前景。其性能將在實施例中結合附圖給予詳細說明。
附圖說明
圖1是實施例1中探針CI-Vis的1H NMR圖譜；
圖2是探針CI-Vis隨粘度的增加螢光譜圖的變化情況；
圖3是探針CI-Vis溶液在粘度(甘油0％)和粘度(甘油95％)的溶液顏色的變化；
圖4是探針CI-Vis溶液在粘度(甘油0％)和粘度(甘油95％)溶液用紫外燈照射後螢光顏色的變化；
圖5是探針CI-Vis應用於細胞中粘度進行螢光成像，圖中a)探針濃度為5μM加入到HeLa細胞中培養30min後明場圖；b)對a的藍通道螢光成像圖；c)對a的紅通道螢光成像圖；d)紅通道對藍通道的比率成像圖；e)經過制菌黴素刺激30min再與5μM探針培養30min後的明場圖；f)對e的藍通道螢光成像圖；g)對e的紅通道螢光成像圖；h)紅通道對藍通道的比率成像圖。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發明做進一步說明，但本發明不受下述實施例的限制，實施例中化合物的號碼對於上述方案中化合物的號碼。
實施例1
化合物CI-Vis粘度螢光探針的合成
化合物1-1的合成：
將N，N-二乙基水楊醛(3.0g,15.5mmol,1eq)，米氏酸(2.24g,15.5mmol,1eq)溶於50mL乙醇中，攪拌過程中加入0.5mL哌啶，常溫反應20min，然後90℃加熱回流反應2h。用TCL板檢測反應，反應完全後，冷卻至室溫，減壓過濾，真空乾燥，得到粗產品，用二氯甲烷溶解，並用矽膠柱進行分離，矽膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。產率為85％。
化合物1-2的合成：
將化合物1-1(940mg，3.76mmol，1eq)溶於5mLDMF中，然後依次加入N-羥基琥珀醯亞胺(432.4mg，3.76mmol，1eq)EDCI(793mg，4.14mmol，1.1eq)，常溫反應12h。用TCL板檢測反應，反應完全後，將反應液倒入100mL冰水中，有固體析出，減壓過濾，水洗，真空乾燥，得到粗產品。用二氯甲烷溶解，並用矽膠柱進行分離，矽膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:50。產率為81％。
化合物1-3的合成：
將化合物1-2(1.17g，3.36mmol，1eq)溶於10mLDCM中，然後依次加入3-溴丙胺氫溴酸(1.15g，5.04mmol，1.5eq)TEA(509mg，5.04mmol，1.5eq)，黑暗條件下，常溫反應6h，TCL板檢測反應，反應完全後，減壓旋幹溶劑得粗產品，並用矽膠柱進行分離，矽膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:30。產率為72％。
化合物1-4的合成：
將化合物1-3(400mg，1.05mmol，1eq)和2,3,3,-三甲基吲哚(156mg，1.05mmol，1eq)溶於1mLDMF中,氮氣保護，100℃加熱回流反應12h。用TCL板檢測反應，反應完全後，二氯甲烷萃取2次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉乾燥。減壓旋幹溶劑得粗產品，並用矽膠柱進行分離，矽膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:20。產率為42％。
探針化合物CI-Vis的合成：
將化合物1-4(100mg，0.217mmol，1eq)和4-二甲氨基苯甲醛(32.4mg，0.217mmol，1eq)溶於10mL乙醇中,氮氣保護，90℃加熱回流反應10h。用TCL板檢測反應，反應完全後，二氯甲烷萃取2次，飽和食鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉乾燥。減壓旋幹溶劑得粗產品，並用矽膠柱進行分離，矽膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲烷＝1:15。產率為60％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.82(t,J＝5.7Hz,1H),8.57(s,1H),8.31(d,J＝15.5Hz,1H),7.96(d,J＝9.2Hz,2H),7.77(dd,J＝11.7,7.6Hz,2H),7.63(d,J＝9.0Hz,1H),7.54(t,J＝7.2Hz,1H),7.47(t,J＝7.4Hz,1H),7.15(d,J＝15.6Hz,1H),6.79(dd,J＝9.1,2.3Hz,1H),6.70(d,J＝9.1Hz,2H),6.62(d,J＝2.0Hz,1H),4.57(t,J＝7.1Hz,2H),3.54–3.47(m,3H),3.47–3.39(m,3H),3.07(s,6H),2.20–2.07(m,2H),1.76(s,6H),1.15(t,J＝7.0Hz,7H).如圖1所示。
實施例2
化合物CI-Vis粘度螢光探針隨粘度的增加螢光譜圖的變化
取實施例1製備的CI-Vis粘度螢光探針溶於二甲基亞碸(DMSO)中，製成1mmol/L儲備液。從儲備液中取出100μL加入到10mL的離心管當中，用乙醇和甘油配成不同比例的粘度值，以420nm為激發光，測量其螢光性質。螢光光譜如圖2所示。由圖2可見，隨著粘度的增加螢光逐漸增強。
實施例3
化合物CI-Vis螢光探針對粘度的可視化檢測
從實施例2中螢光探針儲備液中取出分別40μL加入到兩個5mL的樣品管當中，一個加入3mL乙醇，一個加入3mL 95％的甘油，觀察溶液發生明顯的顏色變化，溶液顏色從玫紅色變成粉紅色(圖3)。伴隨著紫外燈下肉眼可視的粘度螢光探針發出明亮的紅色螢光(圖4)，說明是一種具有生色傳感功能的螢光探針。
實施例4
化合物CI-Vis螢光探針對細胞的螢光成像
我們將本發明探針應用於HeLa細胞中對線粒體中的粘度的變化進行螢光成像應用，結果如圖5所示。具體操作步驟如下：將5μM探針DMSO溶液加入到育有HeLa細胞的培養液中在二氧化碳培養箱中在37度條件下培養30min後用共聚焦顯微鏡進行成像。通過對HeLa細胞進行明場、藍通道(λex＝405nm；λem＝425-475nm)和紅通道(λex＝561nm；λem＝570-620nm)進行螢光成像。並進行紅通道/藍通道的比率成像。我們利用制黴菌素作為刺激物來改變細胞中線粒體內的粘度，並利用CI-Vis探針進行螢光成像，來研究粘度變化前後藍通道和紅通道螢光強度的變化，並通過兩個通道的比率成像，進一步說明探針可以應用於細胞線粒體中對其粘度的變化進行螢光成像的應用。將10μM的制黴菌素加入到育有HeLa細胞的培養液中在二氧化碳培養箱中在37度條件下培養30min後加入5μM探針DMSO溶液，並繼續孵育30min。通過對HeLa細胞進行明場、藍通道和紅通道進行螢光成像，並進行紅通道/藍通道的比率成像。發現制黴菌素刺激前後比率成像圖有了明顯的改變，說明探針可以對細胞線粒體中粘度變化進行螢光成像。