編碼豬β幹擾素的基因片段及其應用的製作方法

2023-10-05 15:04:54 1

專利名稱：編碼豬β幹擾素的基因片段及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼豬β幹擾素的基因片段及其應用。
背景技術：
近年來豬病毒性傳染病日益泛濫，已嚴重地威脅著我國畜牧業的持續發展。免疫抑制病及病毒抗原快迅變異，常導致疫苗免疫失敗；加之不斷出現新的病毒病，目前還尚無 成功的疫苗接種預防。另ー方面，疫苗對疾病只有預防作用，治療還有賴於抗生素的使用。而ー些抗藥性菌株的出現，給人類食品和健康帶來極大的威脅，ー些國家已明令禁止在養殖生產中應用某些抗生素和抗菌劑。因此，生產中迫切需要ー種既有效又有利於環保的新方法來防控畜禽疾病。實踐證明，幹擾素作為ー種廣譜的抗病毒劑，在病毒性傳染病的防控方面具有廣闊的應用前景。傳統的生產方法由中草藥等誘生劑誘導產生幹擾素，因純化工藝複雜，產量少、作用緩和等諸多因素影響而極大限制了在臨床和科研的應用。隨著豬幹擾素基因的克隆成功，對其重組產物的臨床應用及作用機理的研究也隨之展開。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大腸桿菌中表達了 PoIFN-α I基因，得到了ー個含189個胺基酸的前體蛋白，去除其N端的含23個胺基酸的信號肽後，得到了具有完全天然PoIFN-α I生物學活性的產物，並且其在豬源性細胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激豬白細胞產生的幹擾素的6倍。Pol JM等(1991)研究發現rPoIFN-a I能夠抑制偽狂犬病毒(PRV)強毒和中等毒力病毒在豬鼻腔黏膜組織stroma細胞層的増殖，PRV接種幹擾素處理的豬成纖維細胞和豬腎細胞，病毒滴度明顯下降。Horisberger MA (1992)比較了重組PoIFN-α (rPoIFN-a )和重組PoIFN-Y (rPoIFN-Y )在豬的細胞中抗病毒活性的區別，發現rPoIFN- a可大大降低豬水泡性ロ炎病毒(VSV)在豬PK-15上引起的病變，井能削弱豬水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒在豬腎細胞中的複製，但rPoIFN-a和rPoIFN-γ對門戈病毒(一種腦心肌炎病毒)都有抗病毒作用。Jordan LT等(1994)發現rPoIFN-α對傳染性胃腸炎病毒(TGEV)有很好的預防作用。Tonomura N等(1996)研究發現HuIFN-α處理Vero後PRV的增殖受到抑制，PRV的立即早期基因的mRNA在幹擾素處理的Vero中降低，瞬時表達試驗表明PRV IE啟動子的轉錄被選擇性抑制。BuddaertW (1998)對rPoIFN-α在體內、外對豬繁殖與呼吸障礙綜合症病毒(PRRSV)的抗病毒活性進行了研究，發現PRRSV在體內、外對rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明顯抑制PRRSV的產量和感染細胞的數量。chinsangaram J.等(2001)人用大腸桿菌表達rPoIFN-α或rPolFN-β並分別進行了抗ロ蹄疫病毒(FMDV)實驗，發現rPoIFN-α和rPoIFN-β抑制FMDV複製是在蛋白質翻譯水平上的，主要是激活雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)作用的結果在細胞中加入PKR抑制劑2_氨基嘌呤後,病毒的產量就會上升；而RNase L和PKR基因缺失的細胞在幹擾素的作用下仍能感染FMDV，這充分說明了 PKR在抑制病毒複製中起作用。我國學者也對豬α幹擾素進行了多項研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一種新的豬IFN-α基因並在大腸桿菌中進行了其成熟蛋白的單純表達，表達產物具有較高的抗病毒活性。杜以軍等利用豬IFN-α的成熟蛋白基因構建了重組腺病毒質粒pAd-PoIFN-a轉染HEK-293A細胞，滴度為107TCID5(l/mL。RT-PCR證明目的基因在mRNA水平上可有效表達；在PK-15細胞上可以檢測到較強的抗豬口蹄疫病毒活性，從而為研究豬口蹄疫免疫防治新技術奠定了重要基礎。謝海燕等(2004)克隆了豬IFN-a基因，構建了原核表達載體，初步對其進行了原核表達研究；我國學者夏春等(2005)報導了用pQE30表達載體在大腸桿菌原核表達的rPoIFN-α在豬源細胞和非豬源細胞系上可顯著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，證 明了原核表達PoIFN-a的可行性及將基因工程原核表達的PoIFN-α真正用於生產實踐中作為抗病毒製劑可行性。曹瑞兵等對豬IFN-a I基因進行了改造，在保留編碼蛋白序列的同時，使用了大腸埃希菌的偏愛密碼子，將合成的豬IFN-a I成熟蛋白編碼基因插入原核單純表達載體PRLC中，實現了豬IFN-a I在大腸埃希菌中的高效表達，且重組豬IFN-a I具有較高的抗病毒活性，約為6.4X106U/mg。此外，葛麗等(2005)克隆了豬IFN-α基因，構建了真核表達載體，初步對其做了畢赤酵母分泌表達研究。劉佔通等對丹系長白和法系長白、英系大白和法系大白豬IFN-a基因進行克隆，得到了上述4個品系的豬IFN-a基因，證明核苷酸同源性均在97. 2%以上，胺基酸同源性均在92. 8%以上。在豬β幹擾素基因研究方面，2000年夏春等首次對豬幹擾素β基因進行分子克隆與測序，克隆片段長668個核苷酸，編碼186個胺基酸。其中，76 636位含有I個0RF，蛋白分子量為21.8KU。除此之外，溫納相(2005)和彭貴青(2005)也對豬幹擾素β的基因進行了分子克隆與測序，並檢測其生物活性。在表達方面，曹瑞兵(2004)和吳陽(2006)分別對豬β幹擾素的基因進行了原核表達，表達量分別為17. 3%和18%，表達產物均為融合蛋白。其中曹瑞兵用重組豬β幹擾素處理豬腎傳代細胞ΡΚ-15後，細胞病變抑制法(CPE5tl)測定結果表明，重組豬β幹擾素可顯著抑制豬流行性腹 寫病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的感染。而後，為了研製高活性的重組豬β幹擾素，曹瑞兵(2006)對豬幹擾素β進行畢赤酵母偏嗜性改造並構建了酵母表達質粒PPICZ α A-PIB, pPICZ a A-PIB電轉化導入畢赤酵母菌株Χ_33後經甲醇誘導發酵高產量分泌表達豬IFN-β，其中BI株酵母的IFN-β產量最高，約為2. 5X IO5U/mL,其表達量約為60 μ g/mL,比活為4. 17 X 106U/mg。將發酵上清液用PEG20000濃縮後進行SDS-PAGE和Western-blot檢測，結果表明表達產物是分子量約為28Ku和25Ku蛋白的混合物，兩者均可與豬IFN-β陽性抗血清發生特異反應。表達產物比豬IFN-β理論推導分子量(約20.8KU)大，推測可能是表達產物發生了不同程度的糖基化。重組豬IFN-β對偽狂犬病毒在細胞中増殖可呈現抑制作用，並且豬IFN-β對偽狂犬病毒在牛腎細胞(MadenDarbyBovine Kidney cells, MDBK)上早期增埴的抑制效果最為明顯。在豬Y幹擾素基因研究方面，IFN-Y雖然只有ー種基因，但其結構更為複雜，如編碼人和鼠IFN-Y的基因長約6Kb，各包含有4個外顯子和3個內含子。IFN-Y與I型幹擾素(IFN-α與IFN-β)田在基因和蛋白質水平上沒有明顯的相關性(DeGrado，etal，1991)。雖然IFN-Y具有其它幹擾素大多數的生物學活性，但在特異性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫調節活性方面要高100-10000倍(Pace, etal, 1985)。豬IFN- Y全基因編碼166個胺基酸殘基，其中包括20aa的信號肽(Di jkmans，etal，1990)。信號肽切除後，產生146個胺基酸的IFN-γ単體，分子量為17. 3ku，天然活性狀態的IFN-Y是由兩個IFN-Y單體經非共價交聯形成的同源ニ聚體糖蛋白((Boehm, etal, 1997)。豬 IFN- Y 與人、小鼠、貓和犬的 IFN- Y 分別具有 60%，41%, 72%和 72%的同源性，而與IFN-β及IFN-α家族沒有明顯的同源性(Farrar and Schreiber, 1993)。國外最早於1990年由Roger等從基因水平開展了對豬Y幹擾素的研究，他們以人Y幹擾素的cDNA為探針，克隆了豬Y幹擾素基因，發現與人Y幹擾素在DNA和胺基酸的水平上分別有75%和59%的同源性(Di jkmans et al.，1990)。隨後,Vandenbroeck等利用原核表達系統表達了豬Y幹擾素(Vandenbroeck et al.，1991)。在我國，郭錸軍等於2001年首次克隆報導了豬Y幹擾素基因序列(郭稼軍等，2001)。迄今為止，夏春，曹瑞兵(吳文學等，2002;曹瑞兵等，2003;曹瑞兵等，2004)等人以原核系統表達的幹擾素具有較好的生物學活性。曹瑞兵等從經刀豆蛋白A (ConcanavalinA，ConA)誘導培養的豬外周血白細胞中擴增出豬IFN-Y基因，經改造後插入原核表達載體pRLC，並實現了在大腸桿菌中的高效表達。表達產物以包涵體形式存在，經變性、復性、脫鹽、凝膠層析純化處理，重組豬IFN-Y具有較高的幹擾素活性。趙英傑等成功構建了表達重組豬IFN-Y的大腸埃希氏菌基因工程菌株，亞細胞定位分析表明，目的蛋白經原核表達後主要以不溶性包涵體形式存在，其他少量可溶性目的蛋白存在於細胞漿中。其對長白豬Y-幹擾素基因的原核表達與分析，說明幾種我國地方豬IFN-Y在基因的核苷酸以及蛋白的胺基酸水平上不存在差異和突變，同時也證實了長白豬幹擾素-Y基因的正確、完整克隆。為了研究和應用豬重組幹擾素-Y預防和治療病毒性疫病，夏春將大白豬IFN-Y基因插入到酵母整合載體PHIL-S1，構建了重組GSl 15工程菌。經過SDS-PAGE、Western_blot分析和抗水泡性口炎病毒(VSV)活性測定，證實豬IFN-Y分子量為18Ku，在GS115中的表達量為18%，具有抗VSV的活性。用豬IFN- Y處理豬肺巨噬細胞系Marc-145後，經細胞病變抑制法測定，豬IFN-γ可以抵抗豬藍耳病病毒(PorcineReproductive and RespiratorySyndrome Virus, PRRSV)感染。但以上技術均具有原基因密碼子的表達量低、抗病毒活性低的缺陷。

發明內容
本發明的目的是依據畢赤酵母表達系統密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子對豬α、β和Y幹擾素成熟肽核苷酸序列進行基因修飾和改造，並構建出重組酵母表達質粒pPICZ a C-IFN-a、pPICZa C-IFN-β 和 pPICZ a C-IFN-γ，其可以在畢赤酵母中對豬 α、β和Y幹擾素正確且高效表達。密碼子改造後所分泌的蛋白幹擾素具有更好的抗病毒活性。幹擾素具有很高的生物活性，Img即具有I億個活性単位。基因重組豬a、β幹擾素都屬於I型幹擾素，具有廣譜抗病毒活性；基因重組豬Y幹擾素屬於II型幹擾素，具有很好的免疫調節作用。通過基因工程方法，根據密碼子的偏嗜性，重新合成豬α、β、Y三種幹擾素基因核苷酸序列，在優化誘導表達條件的基礎上，提高干擾素蛋白在畢赤酵母菌中的表達量，為大規模發酵生產奠定了基礎。因此，在本發明基礎上，豬a、β、Υ三種幹擾素推廣應用前景廣闊。本發明提供了一種編碼豬α幹擾素的基因片段，其具有如SEQ IDN0. I所示的核苷酸序列。用於擴增其序列的上遊引物Pa1具有如SEQID NO. 2所示的核苷酸序列；下遊引物Pa2具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用於構建可表達豬α幹擾素的重組畢赤酵母。本發明還提供了一種編碼豬β幹擾素的基因片段，其具有如SEQID NO. 4所示的核苷酸序列。用於擴增其序列的上遊引物PP1具有如SEQ ID Ν0.5所示的核苷酸序列；下遊引物Ρβ2具有如SEQ ID Ν0.6所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用於構建可表達豬β幹擾素的重組畢赤酵母。本發明還提供一種編碼豬Y幹擾素的基因片段，其具有如SEQ IDN0.7所示的核苷酸序列。用於擴增其序列的上遊引物P Y1具有如SEQID NO. 8所示的核苷酸序列；下遊引物PY2具有如SEQ ID Ν0.9所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用於構建可表達豬Y幹擾素的重組畢赤酵母。構建重組酵母時，採用的表達載體優選是pPICZ α C，重組質粒優選是 pMD-IFN- α、pMD-IFN- β 和 pMD-IFN- y。與傳統方法的表達的幹擾素相比，本發明通過研究，達到了表達量高，成本較低，效價較高，質量穩定，因此為產品轉化創造了先決條件，具有很好的市場潛カ和較強的市場競爭力，更易在規模化豬場中廣泛推廣應用。基因重組的豬α幹擾素具有很好的抗病毒作用，可以單獨使用治療多種豬病毒性疾病；將表達的豬Y幹擾素作為疫苗佐劑，與不同的疫苗聯合，可以研製出免疫效果更好的新型疫苗，將對豬病毒性疾病防治產生積極的影響。因此，本發明在市場上具有良好的應用前景。在預防和治療豬病毒性疾病方面具有潛在的應用價值。本發明通過精心設計，對豬三種幹擾素進行了基因修飾和改造，經顯示系統表明，密碼子改造後所分泌蛋白豬三種幹擾素具有更好的抗病毒活性。


圖I是本發明實施例的PoIFN-α改造前後的胺基酸序列關聯性； 圖2是本發明實施例的PoIFN- α改造前後的鹼基序列關聯性；圖3是本發明實施例的PoIFN-β改造前後的胺基酸序列關聯性；圖4是本發明實施例的PoIFN- β改造前後的鹼基序列關聯性；圖5是本發明實施例的PoIFN- Y改造前後的胺基酸序列關聯性；圖6是本發明實施例的PoIFN- Y改造前後的鹼基序列關聯性。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進ー步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。(一)基因改造應用DNASTAR (Version 5. O)基因分析軟體，參照NCBI GenBank上登載的豬幹擾素α基因成熟肽核苷酸序列(ΑΥ331298)、豬幹擾素β基因成熟肽核苷酸序列(S41178)和豬幹擾素Y基因成熟肽序列(EU249804)，參照趙翔等畢赤酵母菌的密碼子用法分析以及TaKaRa公司的Pichia酵母密碼子表等，按照該序列胺基酸順序不變，因此表達的蛋白質不發生變化，同時根據畢赤酵母表達系統密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子重新設計新序列，送由大連寶生物工程有限公司重新合成序列。I、豬α幹擾素新序列，如SEQ ID NO. I所示，共501bp ;編碼166個胺基酸，如SEQID NO. 10 所示。引物Pa1 (SEQ ID N02) CG GAATTCCTGTGACTTGCCACAAACCCACT(標有下劃線處為EcoRI限制性內切酶)Pa2 (SEQ ID NO. 3) GG GGTACC TTACTCCTTCTTTCTCAATCTG(標有下劃線處為KpnI限制性內切酶)上、下遊引物的理論跨幅為518bp，退火溫度58°C2、豬β幹擾素新序列，如SEQ ID NO. 4所示，共498bp ;編碼165個胺基酸，如SEQID NO. 11 所示。P^1 (SEQ ID NO. 5) CG GAATTC CATGTCCTACGACGTCT(標有下劃線處為EcoRI限制性內切酶)Ρβ2 (SEQ ID NO. 6) GG GGTACC TTAGTTTCTCAAGTAGTCG(標有下劃線處為KpnI限制性內切酶)上、下遊引物的理論跨幅為513bp，退火溫度52°C3、豬Y幹擾素新序列，如SEQ ID NO. 7所示，共432bp ;編碼143個胺基酸，如SEQID NO. 12 所示。Py1 (SEQ ID NO. 8) CG GAATTC CCAG GCT CCA TTT TTC AA(標有下劃線處為EcoRI限制性內切酶)Py2 (SEQ ID NO. 9) GGGGTACC TTA CTT GGA GGC TCT CTG AC(標有下劃線處為KpnI限制性內切酶)上、下遊引物的理論跨幅為449bp，退火溫度50. 7V(ニ)重組表達質粒的構建(以 pPICZ a C-IFN- α 為例，pPICZ a C-IFN- β、pPICZ a C-IFN- y 與此相同)I、重組質粒與表達載體的雙酶切對重組質粒pMD-IFN-α進行EcoR I和Kpn I雙酶切，雙酶切反應體系如下
權利要求
1.一種編碼豬β幹擾素的基因片段，其特徵在於，具有如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。
2.如權利要求I所述的基因片段，其特徵在於，用於擴增其序列的上遊引物Ρβi具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；下遊引物P β2具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的基因片段，其特徵在於，用於擴增其序列的PCR方法的退火溫度為 52。。。
4.權利要求f3所述的基因片段在構建可表達豬β幹擾素的重組畢赤酵母中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於，採用的表達載體是pPICZα C，重組質粒是pMD-IFN-β 。
6.一種豬β幹擾素，其特徵在於，其具有如SEQ ID NO. 11所示的胺基酸序列。
7.權利要求6所述的豬β幹擾素在製備抗病毒藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述的抗病毒藥物為抗豬病毒性疾病的藥物。
9.一種抗病毒藥物，其特徵在於，含有權利要求6所述的豬β幹擾素。
全文摘要
本發明依據畢赤酵母表達系統密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子重新設計合成新的豬β幹擾素成熟肽核苷酸序列。成功地構建了重組酵母表達質粒pPICZαC-IFN-β，不僅在畢赤酵母中對豬β幹擾素實現了正確表達，而且使豬β幹擾素在畢赤酵母菌中表達更容易，表達量更高，為基因工程大規模生產發酵奠定了基礎。
文檔編號C12N15/22GK102978213SQ20121052975
公開日2013年3月20日 申請日期2010年3月26日 優先權日2010年3月26日
發明者羅滿林, 陳瑞愛, 劉健, 張欣, 唐明森 申請人:華南農業大學, 廣東大華農動物保健品股份有限公司