檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片的製作方法
2023-10-06 08:10:44 1
專利名稱：檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種低密度蛋白晶片，尤其涉及一種檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片。屬生物晶片技術領域。
背景技術：
近年來，中樞神經系統(Central nervous system，CNS)感染性疾病發病率有所上升，其病原體涉及多種細菌、真菌、病毒、螺旋體等。在臨床上病原學診斷是確診的金標準，病原學診斷一俟確定，鑑別診斷則毋庸再提。目前，病原體診斷仍然靠形態學檢查、病原體分離培養以及酶聯免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測抗體；而對於結核桿菌、螺旋體及各種病毒感染，包括單純皰疹病毒I型(HSV-I)、單純皰疹病毒II型(HSV-II)、水痘一帶狀皰疹病毒(VZV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、風疹病毒(RV)、乙腦病毒(JEV)、腮腺炎病毒(MV)等，其形態學檢查和病原體分離培養常受到限制，臨床上通稱為無菌性腦炎、腦膜炎。由於不同病原體感染的治療原則大相逕庭，如果病原體不明，臨床就難以用藥；而抗病毒藥物的不斷研發和對不同病毒具有的不同的敏感性、耐藥性，也使得對病毒種類的鑑定更為迫切，但迄今為止病原學確診遠遠不能滿足臨床的要求，由此延誤治療使該類疾病死亡率一直居高不下。由於早期治療能降低死亡率，因此，建立一種早期平行快速診斷方法至關重要。
機體受病原體感染後，體液中產生特異性抗體，感染後2-3天內血清中最先出現IgM，然後產生IgG，許多國內外學者將測定腦脊液中的病原體特異性IgM作為早期診斷中樞神經系統感染的實驗依據，認為CSF中病毒特異性抗體檢測比血清檢測特異性高、幹擾小，能特異性地診斷中樞神經系統的病毒性感染，由於血中免疫球蛋白難以通過血腦屏障，尤其是大分子的IgM抗體，因此腦脊液中的IgM被視為局部炎症所產生的免疫反應。但用ELISA技術每次只能檢測一種病原體的IgM，如要對可疑所有病原體進行檢測，則費用昂貴，而且需要腦脊液的量大，實際上無法進行。
生物晶片(Biochip)技術是隨著人類基因組計劃(HGP)的研究發展應運而生，主要指通過平面微細加工技術構建的微流體分析單元和系統，以實現對細胞、蛋白質、核酸以及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測，具有高度平行性、多樣性、微型化和自動化的特點，生物晶片主要包括基因晶片和蛋白晶片兩大類。蛋白晶片(proteinchip)是集微電子、微機械、化學物理技術、計算機技術為一體的一門高新技術，被認為是生命科學研究中的高效工具，是將各種蛋白質有序地固定於載體上成為檢測用的晶片，然後，用標記了特定螢光抗體的蛋白質或其他成分與晶片作用，經漂洗將未能與晶片上的蛋白質互補結合的成分洗去，再利用螢光掃描儀或雷射共聚焦掃描技術，測定晶片上各點的螢光強度，通過螢光強度分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的關係，由此達到測定各種蛋白質功能的目的。利用這項技術可同時對多種蛋白質進行平行檢測分析，使得用常規ELISA技術需上千次才能完成的分析在蛋白質晶片上僅需一次就可以完成，並且檢測到的平行數據誤差更小，更準確。
臨床上進行血液腦脊液抗體的檢測主要是通過酶聯免疫吸附(ELISA)技術，具體地說，當檢測IgG時，酶標板上包被該項目相應的抗原，與血清中相應的IgG孵育結合，然後加入酶標二抗，最後加入酶作用的底物顯色，用酶標儀檢測判斷結果；當檢測IgM時，酶標板上包被該項目相應的二抗，與血清中相應的IgM孵育結合，然後依次加入抗原、酶標抗體，最後加入酶作用的底物顯色，用酶標儀檢測判斷結果。
如果要對單純皰疹病毒I型(HSV-I)、單純皰疹病毒II型(HSV-II)、水痘一帶狀皰疹病毒(VZV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、風疹病毒(RV)、乙腦病毒(JEV)、腮腺炎病毒(MV)、結核分枝桿菌、鉤端螺旋體十種病原體進行檢測，以上述方法就需要二十個試劑盒才能將所有的IgG和IgM檢測完畢，每次反應只能檢測一個指標，速度慢、效率低、費用昂貴、需要樣本的量大，實際上無法進行；而且，目前所用的檢測試劑盒中的抗原均為病原體培養物的粗提抗原，其病毒含量低，成分複雜，本底較高，各病原體之間的交叉反應嚴重，且特異性、敏感性、穩定性相差很大；另外，實驗中所用的底物也是劇毒化學品，對實驗人員的健康也有潛在的威脅。
經檢索，具有能同時檢測上述十種病原體的，用於檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片至今還未見報導。
發明內容
針對現有技術的不足，本實用新型要解決的問題是，提供一種用於檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，目的在於，僅通過一次反應，就可得到涉及上述十種病原體的多種指標的反應結果，力求快速、準確的判斷出不同病原體的感染。
本實用新型涉及的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，由基片和陣列式分布於基片之上的病原體種或型特異性蛋白或多肽抗原以及對照的點塗層組成，其中，所述基片是表面有氨基化修飾層的玻片或表面有醛基化修飾層的玻片或表面有多聚賴氨酸修飾層的玻片；所述點塗層的形狀為圓形，每組陣列設2～6個點塗層，平行緊密排列成兩排；設16組，各組間相互平行排列，每組塗層分別塗布有單純皰疹病毒I型(HSV-I)、單純皰疹病毒II型(HSV-II)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、風疹病毒(RV)、乙腦病毒(JEV)、腮腺炎病毒(MV)、結核分枝桿菌(MT)、鉤端螺旋體(LP)十項指標的13種抗原及陽性對照、陰性對照、空白對照。
其中，上述的基片形狀是長方形，面積是25.4×76.2mm，厚度為0.6～1.2mm。
其中，上述的氨基化修飾層是指經過3-氨基丙基三甲氧基矽烷的丙酮溶液處理的矽化層；所述的醛基化修飾層是指在氨基化玻片基礎上覆蓋有經戊二醛磷酸鹽緩衝液處理的醛基化層；所述的多聚賴氨酸修飾層是指經過10％多聚賴氨酸磷酸鹽溶液處理後的多聚賴氨酸層。
其中，上述的點塗層每組陣列中優選4個圓形點塗層組成，設16組，分列四排，相互平行排列；自上而下，自左至右數，第一排各組塗層分別優選塗布有單純皰疹病毒gD、單純皰疹病毒I-gG、單純皰疹病毒II-gG、水痘—帶狀皰疹病毒抗原；第二排各組塗層分別優選塗布有巨細胞病毒pp150、巨細胞病毒抗原、EB病毒抗原，風疹病毒抗原；第三排各組塗層分別優選塗布有乙腦病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、結核菌素純蛋白衍化物PPD、脂阿拉伯甘露糖；第四排各組塗層分別塗布有鉤端螺旋體、PBS、BSA、IgG/IgM。
其中，上述的點塗層的大小，可以根據圓形點塗層的直徑，各組間的距離變化而變化；陣列的排列和分布數量可以根據待檢樣品的數目而變化。
其中，上述的圓形點塗層直徑為50～100μm，各組間的距離為200～300μm時，抗原陣列的面積為2.0mm～3.5mm×2.0mm～3.5mm，且抗原陣列可同時在一張玻璃基片上設置1～16個。
其中，上述的圓形點塗層直徑優選為100μm，各組間的距離優選為300μm時，抗原陣列的面積為3.5mm×3.5mm，且可同時在一張玻璃基片上優選設置4～8個。
上述點陣於玻璃基片上的抗原是純化的所述病原體的種或型特異性抗原，包括單純皰疹病毒I、II型共同抗原包膜糖蛋白D(HSV-gD)，HSVI、II型特異性抗原包膜糖蛋白G(HSV1-gG、HSV2-gG)；水痘一帶狀皰疹病毒抗原(VZV)；巨細胞病毒外膜磷蛋白pp150(CMV-pp150)及巨細胞病毒抗原(CMV)；EB病毒抗原(EBV)；風疹病毒抗原(RV)；乙腦病毒抗原(JEV)；腮腺炎病毒抗原(MV)；結核分枝桿菌結核菌素純蛋白衍化物(purified protein derivative，PPD)及脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)；鉤端螺旋體抗原(LP)。
在本實用新型涉及的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片中，所述的空白對照採用pH7.4的磷酸鹽緩衝液PBS，配方是0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/LKH2PO4，8g/L NaCl；陰性對照採用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)；陽性對照採用人類免疫球蛋白G或M(IgG/IgM)，其中在檢測IgG的陣列裡採用IgG，在檢測IgM的陣列裡採用IgM作為陽性對照。
上述基片上的抗原是通過化學鍵連接於修飾基團上而被固定，具體地說是利用高速全自動點樣機器人把十種病原體的十三種抗原以及陽性對照、陰性對照和空白對照點陣於玻片上。
上述的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，其抗體檢測指標包括IgG抗體和IgM抗體兩部分，在測IgG的陣列裡，二抗採用抗人IgG二抗；在測IgM的陣列裡，二抗採用抗人IgM二抗。
上述晶片由特異性IgG和IgM抗體檢測區域構成，檢測區域採用螢光標記的抗人IgG及IgM與血液腦脊液中特異性IgG和IgM反應，其抗體的濃度與螢光強度成正比，以此進行掃描檢測。用這種蛋白晶片可分別檢測到樣本中針對上述十種病原體的IgG和IgM。
本實用新型涉及的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片以及應用方法，反應條件一致，避免了交叉反應和酶反應底物的潛在危害和汙染，大大提高了檢測的速度和效率，具有快速、高效、準確、平行診斷的特點，為臨床用藥、治療提供重要依據。
利用本實用新型涉及的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片具有以下優越性1)實現了把不同的病原體抗原同時點陣於一張玻片上，進行細菌、病毒、螺旋體多項指標同時檢測，所需樣本量少(3μL)，僅通過一次反應就可得到多指標的反應結果，大大提高了檢測速度和效率，可為臨床提供更多的指標。
2)可同時在一張玻片上檢測多人份樣品的IgG和IgM，簡便快速，又降低了檢測費用。
3)保留了ELISA技術的高度特異性，檢測結果穩定，可靠性高，有利於臨床早期的診斷治療。
4)製作工藝簡單，操作安全，實用性強。
總之，使用本實用新型進行血液腦脊液病原體抗體的檢測，具有樣品用量少、省時、省力、準確度高的特點。
圖1檢測血液腦脊液病原體抗體蛋白晶片的外觀圖。
圖2檢測血液腦脊液病原體抗體蛋白晶片點樣陣列圖，其中第一排為單純皰疹病毒gD、單純皰疹病毒I-gG、單純皰疹病毒II-gG、水痘一帶狀皰疹病毒抗原；第二排為巨細胞病毒pp150、巨細胞病毒抗原、EB病毒抗原、風疹病毒抗原；第三排為乙腦病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、結核菌素純蛋白衍化物PPD、脂阿拉伯甘露糖；第四排為鉤端螺旋體、PBS、BSA、IgG/IgM。
圖3單純皰疹病毒II-IgM檢測陽性圖示。
圖4結核分枝桿菌IgG檢測陽性圖示。
具體實施方式
實施例1下面結合圖1檢測血清腦脊液病原體抗體蛋白晶片的外觀圖，圖2檢測血清腦脊液病原體抗體蛋白晶片的點樣陣列圖，對本實用型的檢測血清腦脊液病原體抗體蛋白晶片作進一步的描述。
本實用型的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，由基片和陣列式分布於基片之上的病原體種或型特異性蛋白或多肽抗原以及對照的點塗層組成，其中，所述基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片，形狀是長方形，面積是25.4×76.2mm，厚度為1.0mm；所述點塗層的形狀為圓形，每組陣列中由4個圓形點塗層組成，平行緊密排列成兩排；設16組，各組間相互平行排列，分列四排，相互平行排列；自上而下，自左至右數，第一排各組塗層分別塗布有單純皰疹病毒gD、單純皰疹病毒I-gG、單純皰疹病毒II-gG、水痘-帶狀皰疹病毒抗原；第二排各組塗層分別塗布有巨細胞病毒pp150、巨細胞病毒抗原、EB病毒抗原、風疹病毒抗原；第三排各組塗層分別塗布有乙腦病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、結核菌素純蛋白衍化物PPD、脂阿拉伯甘露糖；第四排各組塗層分別塗布有鉤端螺旋體、PBS、BSA、IgG/IgM。
上述圓形點塗層直徑為100μm，各組間的距離為300μm時，抗原陣列的大小為3.5mm×3.5mm，且同時在一張玻璃基片上設置4個。
實施例2玻片的多聚賴氨酸修飾與抗原的固定，如圖1為檢測血清腦脊液病原體抗體蛋白晶片的外觀圖，如圖2為檢測血清腦脊液病原體抗體蛋白晶片的點樣陣列圖。
將玻片置玻片架上，放入盛有350ml清潔液(NaOH 100g，乙醇600ml，水400ml)的玻璃缸內，置搖床上60轉/分，平搖2小時；倒掉清潔液，充分水洗4次，每次3分鐘；將玻片浸泡於盛有350ml多聚賴氨酸PBS溶液(多聚賴氨酸35ml，PBS 35ml，水280ml)的玻璃缸內，置搖床60轉/分，平搖1小時；將玻片浸於水中，上下洗5次；放離心機中，800轉/分離心5分鐘後，置一乾淨塑料盒中，垂直放置2周或烘箱烤片後點樣用。
做2份血清樣品檢測，選擇2×2的微陣列晶片，(如圖1)其中上排2個陣列為IgG，下排2個陣列為IgM，左數第一列為第一份樣品(單純皰疹病毒-II IgM陽性)、第二列為第二份樣品(結核分枝桿菌IgG陽性)；用Pixsys 5500晶片自動點樣儀，接觸式點樣，以PBS甘油為點樣液(80％PBS，20％甘油)，點樣針從384孔板吸出病原體抗原及對照後直接點印於多聚賴氨酸玻片上，點陣形式為四點矩形陣列，點直徑為100μm，點間距為300μm，抗原陣列的大小為3.5mm×3.5mm；點樣後室溫放置24小時或37℃2小時，使蛋白質的氨基與玻片上的賴氨酸發生反應，以固定抗原；最後將晶片室溫自然乾燥、包裝後於4℃保存。
用於檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，是將純化的十三種抗原以及空白對照、陰性對照、陽性對照點陣於玻片上，蛋白質通過化學鍵連接於固相載體上而被固定，玻片上每一個陣列均點陣了上述十三種抗原，其中空白對照用PBS，陰性對照採用牛血清白蛋白BSA，陽性對照採用人類免疫球蛋白G或M(IgG或IgM)，如圖2所示。
實施例3抗原抗體反應及檢測加封閉液(1％BSA，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/L KH2PO4，8g/L NaCl，0.1％Tween-20，)封閉於點好抗原的晶片上，37℃1小時，封閉基片表面非特異性位點；用PBST(0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/L KH2PO4，8g/L NaCl，0.1％Tween-20)洗滌3次，每次10秒種後，用PBS(0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/L KH2PO4，8g/LNaCl)衝洗，於離心機以800轉/分離心3分鐘，去除多餘封閉液；將血清用PBS稀釋10倍後取3μL加於陣列上，第一份樣本加在第一列上下兩個陣列中；第二份樣本加在第二列上下兩個陣列中，置於雜交盒內37℃30分鐘，使抗原與抗體充分反應；用PBST洗滌3次，每次10秒種後，用PBS衝洗，於離心機以800轉/分離心3分鐘，去除多餘樣品；將螢光標記的二抗用封閉液稀釋至應用濃度，每個陣列加3μL，只是上排陣列中，二抗採用抗人IgG，下排陣列中，採用抗人IgM二抗，37℃避光溫育15分鐘；用PBST洗滌3次，每次10秒種後，用PBS衝洗，於離心機以800轉/分離心3分鐘；用雷射共聚焦掃描儀掃描並收集信號，依據掃描顯示陽性對照有螢光信號，陰性對照和空白對照無螢光信號，分析檢測結果。
如圖3單純皰疹病毒II-IgM檢測陽性圖示，圖4結核分枝桿菌IgG檢測陽性圖示。
權利要求1.一種檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，由基片和陣列式分布於基片之上的病原體種或型特異性蛋白或多肽抗原以及對照的點塗層組成，其特徵在於，所述基片是表面有氨基化修飾層的玻片或表面有醛基化修飾層的玻片或表面有多聚賴氨酸修飾層的玻片；所述點塗層的形狀為圓形，每組陣列設2～6個點塗層，平行緊密排列成兩排；設16組，各組間相互平行排列，每組塗層分別塗布有單純皰疹病毒I型(HSV-I)、單純皰疹病毒II型(HSV-II)、水痘－帶狀皰疹病毒(VZV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、風疹病毒(RV)、乙腦病毒(JEV)、腮腺炎病毒(MV)、結核分枝桿菌(MT)、鉤端螺旋體(LP)十項指標的13種抗原及陽性對照、陰性對照、空白對照。
2.如權利要求1所述的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，其特徵在於，所述的基片形狀是長方形，面積是25.4×76.2mm，厚度為0.6～1.2mm。
3.如權利要求1所述的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，其特徵在於，所述的氨基化修飾層是指經過3-氨基丙基三甲氧基矽烷的丙酮溶液處理的矽化層；所述的醛基化修飾層是指在氨基化玻片基礎上覆蓋有經戊二醛磷酸鹽緩衝液處理的醛基化層；所述的多聚賴氨酸修飾層是指經過10％多聚賴氨酸磷酸鹽溶液處理後的多聚賴氨酸層。
4.如權利要求1所述的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，其特徵在於，所述的點塗層每組陣列中由4個圓形點塗層組成，設16組，分列四排，相互平行排列；自上而下，自左至右數，第一排各組塗層分別塗布有單純皰疹病毒gD、單純皰疹病毒I-gG、單純皰疹病毒II-gG、水痘－帶狀皰疹病毒抗原；第二排各組塗層分別塗布有巨細胞病毒pp150、巨細胞病毒抗原、EB病毒抗原、風疹病毒抗原；第三排各組塗層分別塗布有乙腦病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、結核菌素純蛋白衍化物PPD、脂阿拉伯甘露糖；第四排各組塗層分別塗布有鉤端螺旋體、PBS、BSA、IgG/IgM。
5.如權利要求1或4所述的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，其特徵在於，所述的點塗層的大小，可以根據圓形點塗層的直徑，各組間的距離變化而變化；陣列的排列和分布數量可以根據待檢樣品的數目而變化。
6.如權利要求5所述的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，其特徵在於，所述的圓形點塗層直徑為50～100μm，各組間的距離為200～300μm時，抗原陣列的面積為2.0mm～3.5mm×2.0mm～3.5mm，且抗原陣列可同時在一張玻璃基片上設置1～16個。
7.如權利要求6所述的檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，其特徵在於，所述的圓形點塗層直徑為100μm，各組間的距離為300μm時，抗原陣列的面積為3.5mm×3.5mm，且可同時在一張玻璃基片上設置4～8個。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測血液腦脊液病原體抗體的蛋白晶片，該晶片由基片和陣列式分布於基片之上的病原體種或型特異性蛋白或多肽抗原以及對照的點塗層組成，其中，所述基片是表面有氨基化修飾層的玻片或表面有醛基化修飾層的玻片或表面有多聚賴氨酸修飾層的玻片；所述點塗層的形狀為圓形，每組陣列設2～6個點塗層，平行緊密排列成兩排；各組間相互平行排列，設16組，每組塗層分別塗布有13種抗原及陽性對照、陰性對照、空白對照。本實用新型的晶片可同時平行檢測多種病原體的感染，具有快速、高效、準確、平行診斷的特點。
文檔編號G01N33/53GK2771864SQ20052008161
公開日2006年4月12日 申請日期2005年3月22日 優先權日2005年3月22日
發明者韓金祥, 劉毅 申請人:山東省醫藥生物技術研究中心