附加唾液酸化糖鏈的多肽的製作方法

2023-10-05 18:59:19

附加唾液酸化糖鏈的多肽的製作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供附加有高均一性的唾液酸化糖鏈且具有幹擾素β活性的多肽。所述附加糖鏈的多肽是在選自下述(1)至(4)：(1)由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽，(2)在由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽中，刪除、置換或附加1個或多個胺基酸而成的多肽，(3)為幹擾素β的類似物的多肽，以及(4)相對於由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽具有80％以上同源性的多肽，所構成的組中的任一多肽中，有4至6處的胺基酸以附加糖鏈的胺基酸置換，且該糖鏈的非還原末端皆被唾液酸化的附加糖鏈的多肽。
【專利說明】附加唾液酸化糖鏈的多肽

【技術領域】
[0001] 本發明是關於附加唾液酸化糖鏈的多肽。更具體而言，是關於附加有高均一性的 唾液酸化糖鏈且具有幹擾素 β活性的多肽。

【背景技術】
[0002] 天然的人類幹擾素 β (IFN-β)是由166個胺基酸殘基所構成的糖蛋白質。已知 幹擾素 β屬於細胞激素（cytokine)家族，參與免疫調節作用、抗病毒活性、細胞增殖抑制 作用。此外，人類幹擾素 β，於天然的胺基酸序列中的第17位、31位、141位具有3個Cys， 於第80位的Asn具有1個複合型之N連接型寡糖。此外，已知於第31位及第141位的Cys 處具有二硫鍵。
[0003] 作為藥物的幹擾素 β利用細胞表達系統來製造，依使其表達的宿主的不同而分 類為IFN-P-Ia或IFN-β-lb。IFN-β-la，在使用中國倉鼠的卵巢（CHO)細胞的表達系統 中表達，與天然幹擾素 β同樣，為具有糖鏈的糖蛋白質。另一方面，IFN-P-Ib在大腸桿菌 中表達，為不具有糖鏈的蛋白質。
[0004] 已知IFN-β -la，與IFN-β -Ib相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗腫瘤特性方面， 具有更強的效能。而且，已知在糖蛋白質中所含的糖鏈結構對於藥物動力學具有強影響力。
[0005] 此外，已知若使聚乙二醇（PEG)等水溶性聚合物結合於蛋白質，則將帶來蛋白質 的物理穩定性、熱穩定性、血漿中穩定性的提高等效果。目前存在有關以PEG修飾的IFN- β 的報導，這些效果受到期待。例如，有關於對IFN-β -Ib的N末端施行PEG修飾而得到的 IFN- β複合物的報導（專利文獻1、2)。此外，也存在有關對IFN- β -Ia的N末端施行PEG 修飾而得到的IFN-β複合物的報導（專利文獻3)。這些修飾，雖然也許確實可賦予蛋白質 上述穩定性等，但另一方面擔心會使作為藥物的IFN-β的活性降低。例如，據報導在PEG 的分子量為2萬以上的情況，活性急劇地降低（非專利文獻1)。
[0006] 考慮PEG修飾的上述擔心，而選擇縱使結合高分子量的PEG亦可維持IFN- β的活 性的位置，施行部位特異性PEG修飾的報導（專利文獻4)亦存在。但是，PEG是不存在於 活體內的化合物，有關長期施用PEG修飾IFN-β的情況的蓄積性、安全性、有效性尚未被充 分研究而未被確立。
[0007] 同時，亦存在有關部位特異性地施行糖鏈修飾而得到的IFN-β複合物的報導 (專利文獻5)。在專利文獻5中，對於天然型IFN-β的胺基酸序列，以使其具有共有序列 (Asn-X-Ser/Thr)的方式導入胺基酸突變，並使用CHO細胞來表達，其中該共有序列為N連 接型糖鏈的識別部位。但是，在該方法中，為了導入共有序列，在附加糖鏈的胺基酸以外之 處亦發生胺基酸突變。此外，已知在CHO細胞中表達時，一般會發生糖鏈的不均一性。
[0008] [先前技術文獻]
[0009] [專利文獻]
[0010] [專利文獻1]美國專利申請案公開第2009/0214472號說明書
[0011] [專利文獻2]美國專利第7829659號說明書
[0012] [專利文獻3]美國專利第7446173號說明書
[0013] [專利文獻4]國際公開第2005/019260號
[0014] [專利文獻5]國際公開第02/074806號 [0015][非專利文獻]
[0016][非專利文獻 1]J. Control. Rel.第 88 卷，第 35-42 頁（2003)


【發明內容】

[0017][發明所要解決的問題]
[0018] 為了使幹擾素 β的物理的穩定性、熱穩定性、血漿中穩定性等提高，如上述，存在 以PEG修飾幹擾素 β的多肽的例子。但是，在以PEG修飾的情況中，如上述，幹擾素 β作 為藥物的活性有時會降低。此外，由於PEG不是存在於活體內的物質，所以有在活體內蓄積 而造成藥害的擔心。
[0019] 另一方面，亦存在以糖鏈修飾幹擾素 β的多肽的例子。但是，例如，通過在CHO細 胞中的表達而製造附加糖鏈的幹擾素 β的情況，如上述，已知在所附加的糖鏈的種類或附 加的位置方面發生不均一性。在糖鏈為不均一的情況中，作為醫藥品時，亦有可能造成各批 次間藥效上有所差異；此外，就天然型附加糖鏈的幹擾素 β而言，有所謂血中滯留時間短 的缺點。
[0020] [用於解決問題的手段]
[0021] 本發明的發明人等為了解決上述問題而反覆深入研究的結果，發現對於幹擾素 β 的多肽，通過以其中的糖鏈的所有的非還原末端皆被唾液酸化的附加糖鏈的胺基酸，置換4 至6處的胺基酸，可得到與天然人類幹擾素 β相比血中滯留性更為優異，且抗腫瘤活性更 為優異的附加糖鏈的多肽。
[0022] 亦即，在本發明的一方面中，是關於具有幹擾素 β活性的附加糖鏈的多肽，其特 徵為該附加糖鏈的多肽是在選自下述（1)至（4):
[0023] (1)由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽，
[0024] (2)在由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽中，刪除、置換或附加1個或多 個胺基酸而成的多肽，
[0025] (3)為幹擾素 β的類似物的多肽，以及
[0026] (4)相對於由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性 (homology)的多肽，
[0027] 所構成的組中的任一多肽中，有4至6處的胺基酸以附加糖鏈的胺基酸置換，且該 糖鏈的所有的非還原末端皆被唾液酸化的附加糖鏈的多肽。
[0028] 在本發明的一方面中，該各附加糖鏈的胺基酸，可各自獨立地為附加糖鏈的Cys 或附加糖鏈的Asn。
[0029] 在本發明的一方面中，該各附加糖鏈的胺基酸中的糖鏈，皆可各自獨立地選自二 唾液酸糖鏈、三唾液酸糖鏈、及四唾液酸糖鏈所構成的組。
[0030] 在本發明的一方面中，該各附加糖鏈的胺基酸中的糖鏈，皆可各自獨立地選自下 述式（1)、式（2)、式（3)及式（4)所構成的組：
[0031]

【權利要求】
1. 附加糖鏈的多肽，所述附加糖鏈的多肽具有幹擾素0活性，其特徵為所述附加糖鏈 的多肽是在選自由下述（1)至（4)所構成的組中的任一多肽中，有4至6處的胺基酸以附 加糖鏈的胺基酸置換，且所述糖鏈的所有的非還原末端皆被唾液酸化的附加糖鏈的多肽： (1) 由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽， (2) 在由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽中，刪除、置換或附加1個或多個氨 基酸而成的多肽， ⑶為幹擾素@的類似物的多肽，以及 ⑷相對於由序列編號1所示的胺基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性的多肽。
2. 如權利要求1所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的胺基酸各自獨立地 為附加糖鏈的Cys或附加糖鏈的Asn。
3. 如權利要求1或2所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的胺基酸中的糖 鏈，皆各自獨立地選自二唾液酸糖鏈、三唾液酸糖鏈及四唾液酸糖鏈所構成的組。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的胺基酸 中的糖鏈，皆各自獨立地選自下述式（1)、式（2)、式（3)及式（4)所構成的組：

5. 如權利要求1至4中任一項所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的胺基酸 中的糖鏈皆相同。
6. 如權利要求1至5中任一項所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的氨基 酸中的至少一個存在於序列編號1所示的胺基酸序列中，與選自第1位、3位、7位、24位、 25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、 70 位、75 位、79 位、99 位、103 位、106 位、107 位、109 位、112 位、115 位、123 位、130 位、136 位、139位及164位所構成的組中的位置相當的位置。
7. 如權利要求6所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的胺基酸中的至少一 個存在於序列編號1所示的胺基酸序列中，與選自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、 107位、112位、123位、及第136位所構成的組中的位置相當的位置。
8. 如權利要求6所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的胺基酸中的至少3個 存在於序列編號1所示的胺基酸序列中，與選自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、107 位、112位、123位及136位所構成的組中的位置相當的位置。
9. 如權利要求6所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的胺基酸皆不存在於 序列編號1所示的胺基酸序列中，與第2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、 23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、 64 位、65 位、68 位、69 位、73 位、78 位、83 位、86 位、87 位、90 位、93 位、94 位、100 位、124 位、 125 位、128 位、131 位、132 位、138 位、141 位、142 位、145 位、148 位、149 位、152 位、153 位、 156位、159位、160位或163位的位置相當的位置。
10. 如權利要求6所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述各附加糖鏈的胺基酸皆存在於序 列編號1所示的胺基酸序列中，與選自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、 35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、 103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位及164位所構成 的組中的位置相當的位置。
11. 如權利要求1至10中任一項所述的附加糖鏈的多肽，其中，所述附加糖鏈的多肽是 化學合成的。
12. 醫藥組合物，其特徵為所述醫藥組合物包含： (1) 如權利要求1至11中任一項所述的附加糖鏈的多肽及/或其藥學上可接受的鹽； 以及 (2) 藥理學上可接受的載體。
13. 如權利要求12所述的醫藥組合物，其中，所述醫藥組合物用於與幹擾素 P相關的 疾病的治療或預防。
14. 如權利要求13所述的醫藥組合物，其中，所述與幹擾素 P相關的疾病選自腦腫瘤、 皮膚惡性黑色素瘤、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性 肝硬化及多發性硬化症所構成的組。
【文檔編號】A61K38/00GK104334574SQ201480001384
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年3月24日 優先權日:2013年3月29日
【發明者】大內政輝, 西原三佳, 手塚克成, 前田政敏, 梶原康宏, 坂本泉 申請人:株式會社糖鎖工學研究所