一種貝類毒素快速檢測試紙條的製備方法與流程
2023-10-06 00:33:04
本發明涉及一種膠體金檢測試劑板，具體是一種貝類毒素快速檢測試紙條的製備方法。
背景技術：
當前，我國用於腹瀉性貝類毒素的檢測方法主要有小鼠生物法及酶聯免疫吸附檢測法。小鼠生物法的檢測原理：貝類樣品用丙酮、乙醚提取後，經減壓蒸乾，以1％吐溫-60生理鹽水溶解後注射入小鼠腹腔，觀察小鼠存活情況，計算其毒力。ELISA的檢測原理：測定的基礎是抗原抗體反應，微孔板包被有針對大田軟海綿酸(DSP的主要成分)抗體的捕捉抗體，加入標準或樣品溶液及OA酶標記物，游離OA與OA酶標記物競爭OA抗體，同時OA抗體與捕捉抗體連接。洗滌後，將底物和發色劑加入到孔中並且孵育。加入終止液後，在450nm波長下測定吸光度值。小鼠生物法是當前我國腹瀉性貝類毒素的標準檢測方法，但其不足之處顯而易見，如：(1)動物使用帶來的倫理問題，受到動物保護組織的強烈反對；(2)靈敏度低，可比性和重複性差，檢測結果與小鼠的品系、體重及狀態等有關，難以形成統一的檢測標準；(3)準確性差，該方法只能檢測出毒力的大小，無法確定毒素的成分和含量，容易因高濃度的鋅或不飽和脂肪酸的存在導致假陽性；(4)樣品提取過程複雜。
ELISA法主要存在以下不足：(1)抗體往往只針對主要成分，其類似物可能會產生交叉反應，從而出現假陽性或對毒性的估計不準確；(2)單克隆抗體的製備困難，試劑盒價格昂貴；(3)我國目前尚無商品化ELISA試劑盒可售。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種靈敏度高、操作簡單的貝類毒素快速檢測試紙條的製備方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
一種貝類毒素快速檢測試紙條的製備方法，包括以下步驟：
（1）貝類毒素半抗原的製備：取貝類毒素標準品1mg，N-甲基己內醯胺0.70mL，3,5-二氯苯胺1.20mL及1-乙醯-4-（2-羥乙基）哌嗪0.25mL加入3mL的3-氧代環丁烷基羧酸中，作為A液；取5-三氟甲基尿嘧啶25mg溶解於1.5mL乾燥的3-氧代環丁烷基羧酸中，作為B液；10℃條件下緩慢滴加B液於A液中，滴加完畢後進行搖勻，蒸除溶劑，柱層析純化後，即得；
（2）貝類毒素免疫原的製備：取2mg貝類毒素半抗原，溶解於0.74mL 3-氧代環丁烷基羧酸中；取3-甲基嗎啉鹽酸鹽溶液0.4mL，加入貝類毒素半抗原溶液中，低溫攪拌2h，即得反應液A；稱取牛血清白蛋白（BSA）17mg，使之充分溶解在5.25mL磷酸鹽緩衝液中，隨後將反應液A逐滴緩慢滴加到BSA溶液中，並於室溫下攪拌24h，超濾後分裝，於-20℃保存備用；
（3）包被原的製備：取3mg貝類毒素半抗原，溶解於2mL 3-氧代環丁烷基羧酸中；取氰基吡咯烷酮溶液0.4mL，加入貝類毒素半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即得反應液A；稱取牛血清白蛋白（BSA）25mg，使之充分溶解在5.25mL磷酸鹽緩衝液中，將反應液A逐滴緩慢滴加到BSA溶液中，並於室溫下攪拌24h，超濾後分裝，於-20℃保存備用；
（4）單克隆抗體的製備：
將上述步驟（2）中製得的貝類毒素免疫原注入昆明小鼠體內，免疫劑量為200μg/只，隨後每隔2天注射不完全佐劑量，使其產生抗血清；隨後將免疫昆明小鼠肝細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選後進行克隆化和擴增，以備凍存保存；隨後將融合後的骨髓瘤細胞與慢病毒HIV-1進行再次融合，進行擴大培養；
（5）兔抗鼠抗體的製備：以兔作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體兔進行免疫，得到兔抗鼠抗體；
（6）免疫膠體金標記物的製備：以氯金酸為基體，將單克隆抗體進行包覆在氯金酸上，柱層析純化後即得；
（7）試紙條的製備：準備基板、襯板、金標墊、樣品墊、硝酸纖維素膜，其中金標墊中塗抹有單克隆抗體，硝酸纖維素膜上設有檢測線和質控線，檢測線上塗抹包被原，質控線上包被兔抗鼠抗體；接著，將硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊依次按照從下到上的順序粘附在襯板上；最後，將襯板和基板進行壓制，即得。
作為本發明進一步的方案：步驟（2）中3-甲基嗎啉鹽酸鹽溶液為含EDTA的鹽溶液。
作為本發明進一步的方案：步驟（6）中氯金酸的質量百分比濃度為1%。
作為本發明進一步的方案：步驟（7）中基板採用有機玻璃製成。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：
本發明的試紙板具有靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點，操作簡單、快速、安全，將反應所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣後，抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短檢樣時間，且樣品無需特殊處理，成本低，易推廣，生產成本低廉，投資少，收效快。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本專利的技術方案作進一步詳細地說明。
一種貝類毒素快速檢測試紙條的製備方法，包括以下步驟：
（1）貝類毒素半抗原的製備：取貝類毒素標準品1mg，N-甲基己內醯胺0.70mL，3,5-二氯苯胺1.20mL及1-乙醯-4-（2-羥乙基）哌嗪0.25mL加入3mL的3-氧代環丁烷基羧酸中，作為A液；取5-三氟甲基尿嘧啶25mg溶解於1.5mL乾燥的3-氧代環丁烷基羧酸中，作為B液；10℃條件下緩慢滴加B液於A液中，滴加完畢後進行搖勻，蒸除溶劑，柱層析純化後，即得；
（2）貝類毒素免疫原的製備：取2mg貝類毒素半抗原，溶解於0.74mL 3-氧代環丁烷基羧酸中；取3-甲基嗎啉鹽酸鹽溶液0.4mL，加入貝類毒素半抗原溶液中，低溫攪拌2h，即得反應液A；稱取牛血清白蛋白（BSA）17mg，使之充分溶解在5.25mL磷酸鹽緩衝液中，隨後將反應液A逐滴緩慢滴加到BSA溶液中，並於室溫下攪拌24h，超濾後分裝，於-20℃保存備用；
（3）包被原的製備：取3mg貝類毒素半抗原，溶解於2mL 3-氧代環丁烷基羧酸中；取氰基吡咯烷酮溶液0.4mL，加入貝類毒素半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即得反應液A；稱取牛血清白蛋白（BSA）25mg，使之充分溶解在5.25mL磷酸鹽緩衝液中，將反應液A逐滴緩慢滴加到BSA溶液中，並於室溫下攪拌24h，超濾後分裝，於-20℃保存備用；
（4）單克隆抗體的製備：
將上述步驟（2）中製得的貝類毒素免疫原注入昆明小鼠體內，免疫劑量為200μg/只，隨後每隔2天注射不完全佐劑量，使其產生抗血清；隨後將免疫昆明小鼠肝細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選後進行克隆化和擴增，以備凍存保存；隨後將融合後的骨髓瘤細胞與慢病毒HIV-1進行再次融合，進行擴大培養；
（5）兔抗鼠抗體的製備：以兔作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體兔進行免疫，得到兔抗鼠抗體；
（6）免疫膠體金標記物的製備：以氯金酸為基體，將單克隆抗體進行包覆在氯金酸上，柱層析純化後即得；
（7）試紙條的製備：準備基板、襯板、金標墊、樣品墊、硝酸纖維素膜，其中金標墊中塗抹有單克隆抗體，硝酸纖維素膜上設有檢測線和質控線，檢測線上塗抹包被原，質控線上包被兔抗鼠抗體；接著，將硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊依次按照從下到上的順序粘附在襯板上；最後，將襯板和基板進行壓制，即得。
其中：
步驟（2）中3-甲基嗎啉鹽酸鹽溶液為含EDTA的鹽溶液。
步驟（6）中氯金酸的質量百分比濃度為1%。
步驟（7）中基板採用有機玻璃製成。
本發明的試紙板具有靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點，操作簡單、快速、安全， 將反應所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣後，抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短檢樣時間，且樣品無需特殊處理，成本低，易推廣，生產成本低廉，投資少，收效快。
上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利並不限於上述實施方式，在本領域的普通技術人員所具備的知識範圍內，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。