新的環糊精·葡聚糖轉移酶及其製造方法和用該酶製造環糊精的方法

2023-10-05 18:37:44 3

專利名稱：新的環糊精·葡聚糖轉移酶及其製造方法和用該酶製造環糊精的方法
技術領域：
本發明涉及一種環糊精·葡聚糖轉移酶(glucanotransferase)(EC 2.4.1.19、以下稱為CGTase)及其製造方法以及使用它製造環糊精(以下稱為CD)的方法。
因為CD與許多的分子形成包合物，它的化學及物理的許多性質都可能改變，所以CGTase在食品、醫藥、化妝品工業中是重要的酶。因此，1939年開始用浸麻類芽孢桿菌進行CD合成反應(E.B.Tilden andS.J.Pirt，J.Am.Chem.Soc.，63，2900-2902，1939)。其後，進行了包括對產生CGTase的細菌的檢索或酶的精製等多方研究(Sumiokitahata，Naoto Tsuyama and Shigetaka Okada，Agr.Biol.Chem.，38(2)，387-393，1974、Sumio kitahata and Shigetaka Okada，Agr.Biol.Chem.，38(12)，2413-2417，1974、Sumio kitahata andShigetaka Okada，J.Jap.Soc.Starch Sci.，29(1)，13-18，1982、Michio Kubota，Yoshiki Matsuura，Shuzo Sakai and YukiteruKatsube，Denpun Kagaku，38(2)，141-146，1991、Lionel J.Bovetto，Daniel P.Backer，Jaques R.Villette，Philippe J.Sicard，andStephane J-L.Bouquelet，Biotechnology and Applied Biochemstry，15，48-58，1992、Shinske Fujiwara，Hirofumi Kakihara，Kim MyungWoo，Andre Lejeune，Mitsuhide Kanemoto，Keiji Sakaguchi，andTadayuki Imanaka，Applied and environmental microbiology，58(12)，4016-4025，1992、Florian Binder，Otto Huber and AugustBock，Gene，47，269-277，1986、Keiji Kainuma，Toshiya Takanoand Kunio Yamane，Appl.Microbiol.Biotechnol.，26，149-153，1987、Takahiro Kaneko，Tetsuo Hamamoto and Koki Horikoshi，J.general Microbiology，134，97-105，1988、Murai Makela，PekkaMattsson，M.Eugenia Schinina，and Timo Korpela，Biotechnologyand Applied biochemistry，10，414-427，1988、Ernest K.C.Yu，Hiroyuki Aoki，and MasanaruMisawa，Appl.Microbiol.Biotechnol.，28，377-379，1988)。
CGTase根據其合成的主要CD種類分為α-、β-CGTase及γ-CGTase。過去報告的許多都是α-或β-CGTase，報告的γ-CGTase酶數量很少(Shigeharu Mori，Susumu Hirose，Takaichi Oya，and SumioKitahata，Oyo Toshitsu Kagaku，41(2)，245-253，1994、YoshitoFujita，Hitoshi Tsubouchi，Yukio Inagi，Keiji Tomita，AkiraOzaki，and Kazuhiro Nakanishi，J.Fermentation andBioengineering，70(3)，150-154，1990、Takashi Kato and KokiHorikoshi，J.Jpn.Soc.Starch Sci.，33(2)，137-143，1986)。
而且，即使在γ-CGTase酶的報告中，γ-CD的生成量也僅為5％以下，在反應後期β-CD的生成速度加快，生成與γ-CD同量或比它多量的β-CD，或者在10％以上的底物濃度範圍，γ-CD的產量顯著地低，作為對策，有必要使乙醇在反應液中共存等，不是工業上可利用的酶。
另外，也在嘗試改變α-或β-CGTase的構造遺傳基因，改善γ-CD的產量(Akira Nakamura，KeikoHaga，and Kunio Yamane，Biochemstry，32，6624-6631，1993、Michio Kubota，YoshikiMatsuura，Shuzo Sakai and Yukiteru Kutsume，Oyo ToshitsuKagaku，41(2)，245-253，1994)。可是，即使這能增加γ-CD的產量，也不能使以原來的活性產生的β-CD明顯減少，從工業的觀點考慮不能說是充分的方法。
所以，現狀是α-CD及β-CD被利用於各個領域而γ-CD卻是幾乎沒有被利用。含有CD的糖漿也是同樣，α-或β-CD為主要成分的CD糖漿應用於各個領域，以γ-CD為主要成分的CD糖漿的應用卻很少。
本發明的目的是提供一種能優先生成γ-CD的新γ-CGTase，因此提供有生產新γ-CGTase能力的微生物也是本發明的目的。
進而，本發明的目的還在於提供用上述γ-CGTase製造γ-CD的方法。
為實現上述目的，本發明的發明者們在廣闊的自然界中探索具有產生製造γ-CD的CGTase能力的微生物。結果發現在認定為屬於庫拉奇芽孢桿菌種的菌株中有能產生CGTase的菌株。而且，培養這種微生物，在培養物中使它產生CGTase，並採取它進行鑑定，結果發現這種CGTase是新的酶，完成了本發明。又發現使用這種CGTase能優先製造γ-CD，從而確立了γ-CD的工業製造法。
發明概述本發明是關於具有下述酶化學性質的環糊精·葡聚糖轉移酶。
①作用及底物特異性作用於澱粉、糊精、支鏈澱粉或直鏈澱粉，主要生成γ-環糊精，β-及α-環糊精的生成量比γ-環糊精的生成量低。
②最適當的pH10.5-11.0③最適當的溫度60℃左右④穩定的pH6-11⑤溫度穩定性50℃、經15分鐘處理表現為90％以上的殘存活性。
本發明製造環糊精·葡聚糖轉移酶的方法有如下特徵，培養屬於庫拉奇芽孢桿菌(Bacillus clarkii)種的有生產環糊精·葡聚糖轉移酶能力的微生物，使環糊精·葡聚糖轉移酶在培養物中產生，然後再獲取生成的環糊精·葡聚糖轉移酶。
在上述製造方法中屬於庫拉奇芽孢桿菌種的有生產環糊精·葡聚糖轉移酶能力的微生物，可以採用庫拉奇芽孢桿菌7364株(FERMBP-7156)。
進而，本發明的製造環糊精的方法有如下特徵，在含有選自澱粉、糊精、支鏈澱粉及直鏈澱粉中至少1種的溶液中，使庫拉奇芽孢桿菌種產生的環糊精·葡聚糖轉移酶進行反應，使其主要生成γ-環糊精，然後獲取生成的γ-環糊精。
在上述本發明的環糊精製造方法中的環糊精·葡聚糖轉移酶可以是本發明的環糊精·葡聚糖轉移酶。
本發明還涉及作為有產生環糊精·葡聚糖轉移酶能力的庫拉奇芽孢桿菌種菌的庫拉奇芽孢桿菌7364株(FERMBP-7156)。
附圖簡要說明

圖1為表示pH影響庫拉奇芽孢桿菌7364產生的γ-CGTase活性(Blue value法)的曲線圖。
圖2為表示溫度影響庫拉奇芽孢桿菌7364產生的γ-CGTase活性(Blue value法)的曲線圖。
圖3為以可溶性澱粉為底物的γ-CD生成反應的經時變化圖。
實施本發明的最佳形態[環糊精·葡聚糖轉移酶]表1歸納了本發明者們新發現、分離的菌株的菌學性質。
表1菌株的各種性質


再把這個菌株的16S rDNA的鹼基序列在序列表中用序列號1表示。
這個菌株是表現出伸長型的運動性革蘭氏陽性桿菌，對過氧化氫酶、氧化酶都顯示陽性，雖然確認芽孢的形成有困難，但可以看見長在伸長型末端的芽胞，而推定為芽孢桿菌(Bacillus)屬。同時進行了菌體脂肪酸組成(CFA)、16S rDNA的鹼基序列及糖化試驗。該菌株在鹼性領域能獲得最大增殖速度，而且在pH為pH7.0以下不能生育，所以屬於嗜鹼性細菌的範疇。雖然與已發表的報告AlkalophilicBacillus clarkii(Preben Nielsen，Dagmar Fritze and FergusG.Priest，Microbiology，141，1745-1761，1995)在16S rDNA鹼基序列上僅有96.12％的低相同率，但被推定為近親種。可是，在其它的生理性狀試驗中與I.Yumoto等的報告值(I.Yumoto et al.J.Syat.Bacteriol.，48，565-571，1998)顯示出良好的一致性，該菌株被推定為庫拉奇芽孢桿菌。
從以上結果得知這種菌株是新菌株，把它命名為庫拉奇芽孢桿菌7364株。這個菌株以FERM BP-7156保藏在工業技術院生命工程學工業技術研究所(目前在獨立行政法人工業技術綜合研究所專利生物保藏中心日本國茨城縣筑波市東1丁目1-1)。
另外，以前在庫拉奇芽孢桿菌種中還沒有報導過關於有產生CGTase能力的菌株，而且確認在近親種B.horti(JCM No.9943T)、B.clarkii(ATCC No.700162)及B.agaradhaerens(ATCC No.700163)中沒有CGTase活性。也就是說本菌株是有產生CGTase能力的第一個屬於庫拉奇芽孢桿菌種的菌株。
為了利用庫拉奇芽孢桿菌7364菌株製造CGTase，使該微生物良好地生育，順利地生產酶，在含有必要的碳源、氮源、無機鹽、必要的營養素等的合成培養基或天然培養基中培養它。碳源可以利用澱粉、或它的構成部分、焙燒糊精、加工澱粉、澱粉衍生物、物理處理澱粉及α-澱粉等碳水化合物。具體的有，可溶性澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、甘薯澱粉、糊精、支鏈澱粉、直鏈澱粉等。氮源有細菌培養基用的腖、酪蛋白、肉提取物、酵母提取物、玉米浸漬液或大豆或豆餅等提取物等有機氮源物質、硫酸銨、磷酸銨等無機氮化合物、穀氨酸等胺基酸類。無機鹽類可採用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽、硫酸鎂等鎂鹽、氯化鈣等鈣鹽、碳酸鈉等鈉鹽等。培養優選在震蕩培養或通氣攪拌培養等需氧條件下、培養基的pH為7以上的範圍優選調整在8～11的範圍、溫度在10～45℃的範圍優選在30～42℃的條件下實施，但即使在此條件外，只要是微生物生育、生成目的酶的條件即可，沒有特別限制。
在上述那樣的條件下培養，通常從培養開始經48小時左右在培養液中就會生產大量的CGTase。接著從培養液中除去菌體，得到培養濾液。用超濾膜脫鹽、濃縮、回收酶。這樣得到的粗提純酶也可直接用來進行CD生成反應。不過也可根據需要經過硫酸銨鹽析或有機溶劑沉澱、用DEAE-交聯葡聚糖、丁基離子交換樹脂(トョパ一ル)等吸附洗脫、經葡聚糖凝膠、離子交換樹脂(toyopearl)等進行柱分級、以γ-CD為配體經誘導的親合色譜法精製以後使用。
以下說明酶活性測定法。
(CGTase活性測定)CGTase活性測定用50mM甘氨酸-NaCl-NaOH(pH10.0)緩衝液，在40或50℃條件下進行。
(Blue value法)把50mg直鏈澱粉(林原制EX-III型)在2ml的1N NaOH中經1夜溶解後，用1N HCl中和，用50mM甘氨酸-NaCl-NaOH(pH10.0)緩衝液調為50ml，以其作為底物溶液。把300μl的底物液在40℃條件下保溫10分鐘，添加200μl適當稀釋的酶溶液，以此開始反應，在相同溫度反應10分鐘。添加4ml的0.2N HCl，以此停止反應。在同反應液中加入4ml的水及0.02％I2-0.2％KI溶液500μl測定700nm的吸光度。同樣，添加0.2N HCl後與添加酶溶液的進行對照。把在本條件下與700nm的吸光度對照的1分鐘減少10％的酶量定義為1U。
(γ-CD生成活性)使1ml溶解在25mM甘氨酸-NaCl-NaOH(pH10.0)緩衝液中的可溶性澱粉(nacalai tesque)在50℃條件下加溫10分鐘，成為10％(質量/體積)。添加200μl適當稀釋的酶溶液，以此開始反應，在相同溫度反應30分鐘，添加3ml的0.02N HCl，以此停止反應。20μl反應液供HPLC，測定生成的γ-CD量。把在本條件下1分鐘生成1μmol/mlγ-CD的酶量定義為1U。
本測定中使用的HPLC的條件如下，柱YMC-pack AQ-312(6×150mm)溶劑 10％MeOH流速 1.0ml/min溫度 R.T.
檢測 RIATT 7在上述條件下，分析已知濃度的CD溶液，通過求CD含量與HPLC面積的關係得出下式校正曲線。
(HPLC面積)＝3.092×106×(γ-CD質量/體積％)R2＝0.999(CD生成量的分析)反應液中的CD含量用HPLC分析，分析條件如下，HPLC法-1柱Aminex HPX-42A(Bio-Rad Lab.7.8×300mm)溶劑H H2O流速 0.5ml/min溫度 55℃檢測 RIATT 9HPLC法-2用與分析CD生成活性同樣的方法進行。
用馬鈴薯可溶性澱粉(Sigma)為底物進行CD生成反應。
得到的CGTase的酶學方面的各種性質如下所示。
使200μl該酶(蛋白100μg)與溶解於pH3～11.9的各種緩衝液的1.0％(質量/體積)直鏈澱粉(DP117)在40℃條件下反應10分鐘，求其相對活性(Blue value法)。再將50μl的酶溶液(蛋白25μg)與500μl的pH在3-11.9範圍的各種緩衝液混合，在4℃條件下放置24小時，測定加入2.75ml的50mM甘氨酸-NaOH(pH10.0)緩衝液後的殘存活性(圖1)。其結果是該酶的最佳pH及pH穩定範圍分別為10.5-11.0和6-11.0。
使200μl該酶(蛋白100μg)與溶解於50mM甘氨酸-NaOH(pH10.0)緩衝液的1.0％(質量/體積)直鏈澱粉(DP117)在各種溫度條件下反應10分鐘，求其相對活性(Blue value法)。再將20μl的酶溶液和1180μl的50mM甘氨酸-NaOH(pH10.0)緩衝液混合，在各種溫度條件下保持15分鐘測定其殘存活性(圖2)。其結果是該酶的最佳溫度及溫度穩定範圍分別為60℃和30℃以下。這些結果在γ-CD生成活性方面也是同樣。
以上結果以及參照該酶的分子量、等電點的研究結果，就酶的各種性質與其它菌株產生的CGTase的比較如表2所示。
表2與已知的其它來源的CGTase的諸性質的比較

由庫拉奇芽孢桿菌7364株產生的CDTase的分子量按SDS-PAGE為66,000；等電點是3.98(聚焦電泳法)。
用本發明的CDTase製造CD可以在含1～30％澱粉(含澱粉或其構成部分、糊精、支鏈澱粉及直鏈澱粉等加工澱粉等)的水溶液中，添加0.5～300U(每1g幹澱粉)本酶液(精製酶或粗酶)，在pH為4.5～12，溫度為20～60℃的條件下，進行1～96小時酶反應。還可以根據需要對澱粉預先加熱、液化處理後再用。用上述那樣的方法調製的糖類(糖漿)中γ-CD比α-及β-CD含量多，除了這些CD以外，有時也會含有葡萄糖等單糖類、各種低聚糖(麥芽糖)或糊精等。也可以根據需要，把有所希望的單一聚合度的CD分離(利用結晶化、色譜分級、酵母等發酵處理及酶處理等)後再用。也就是說，也可以從上述生成物中分離、精製γ-CD。因為用本發明的方法獲得的反應液γ-CD比α-及β-CD含量多，所以可以比以往容易地分離、精製γ-CD。而且，除了用上述方法獲得的糖漿狀之外，還可以有結晶狀、凍結乾燥狀、粉末狀、顆粒狀等任意的形態。
用本發明的製造方法製造的CD(特別是γ-CD含量高的CD或高純度γ-CD)和以往市場出售的CD同樣可以用於可經口攝取的所有食品。這樣的食品有，茶類、清涼飲料等飲料類、糖果、膠凍、日本點心等和式及西式點心、酸奶、冰激凌等乳製品類；火腿、香腸等肉類加工品類；魚糕、海帶魚糕卷等水產加工品類及面類、鹹菜類、其它經過烹調加工的食品類、速食品類等。而且香料等的穩定或乳化作用及賦形劑等由於添加、含有由本發明的製造方法製造的CD，會極其簡便而有效地提高食品和飲料的可口性和功能性。另外，由本發明的製造方法製造的CD不僅能用於食品和飲料，還可以作為藥品或化妝品等有效成分的穩定劑、乳化劑、賦形劑等應用。
由本發明的製造方法製造的CD的使用方法，只要是在食品和飲料、藥品或化妝品中能使CD共存的條件即可，沒有特別的限定。例如可以在作為基礎的食品和飲料原料加工中同時添加CD，或了可在基礎食品和飲料加工完了之後添加，可採用適合各種食品的製造工序的實際情況的添加方法。
在食品和飲料中CD的添加量，只要無損於基礎食品和飲料本來的味道和風味，沒有特別的限制，一般優選20重量％以下的添加量添加。若在20重量％以上，由於CD具有的遮蔽效果，基礎食品和飲料的味道或風味可能會改變，從而降低可口性。在藥品、化妝品方面只要無損於有效成分的作用，不作限定，但建議使用50重量％以下。
本說明書介紹的發明是關於2000年5月23日在日本專利廳申請的日本專利申請2000-151053記載的發明，這裡援用了這個日本專利申請公開的全部內容。
實施例下面以實施例對本發明作詳細說明實施例1把庫拉奇芽孢桿菌7364菌株在含有作為碳源的1.0％(質量/體積)ネォタック#30T(日本食品化工公司(株)制)、作為氮源的0.5％(ソャフラヮ一)FT(日清制油公司制)、以及0.5％酵母提取物(Difco制)、0.1％K2HPO4、0.02％MgSO4·7H2O及0.8％Na2CO3的液體培養基中在37℃條件下進行48小時震蕩培養，在培養液中就分泌出CGTase(Blue value法20U/ml培養上清波)。
用親和性色譜法精製獲得的CGTase，其物性如表2所示。
實施例2把實施例1中記載的培養上清液用UF濃縮膜(PM-10)濃縮後，以此作為粗酶液進行糖化試驗。本濃縮液具有55U/ml(Blue value法)的活性。首先以可溶性澱粉為底物，使其溶解於50mM甘氨酸-NaCl-NaOH(pH10.0)緩衝液成為10％(質量/體積)並以此作為底物溶液。把粗酶液分別按照80、40、20、10及5U/g-DS添加於5ml底物溶液中，在50℃條件下進行反應。在反應開始後的第2、4、6、24、48小時取樣，用HPLC法-1和2，求γ-CD生成量(圖3)。其結果是按照DS為80U/g添加該酶時，48小時後γ-CD為9.7％；α-和β-CD分別是1.7和0.9％(HPLC面積)。
實施例3按照常法把玉米澱粉用α-澱粉酶液化，調製成濃度為20重量％葡萄糖當量為7的澱粉液化液。然後把它調整為pH7之後，把實施例1記載的培養上清液用UF濃縮膜(PM-10)濃縮成粗酶液，添加450單位/g底物，在55℃條件下，反應48小時。此後，把本反應液加熱，使其酶失去活性，進行脫色、離子交換等精製，調製出含CD的糖漿。其糖的成分如表3所示。CD的含量用HPLC法-1和2求出。
表3

實施例4把實施例2的反應液(添加80U/g的DS，進行48小時反應的反應液)用葡萄直鏈澱粉酶處理後，載荷於活性碳柱(Φ2.5×20cm)，用純水洗淨，除去由葡萄直鏈澱粉酶處理產生的葡萄糖。再用20％酒精洗淨後，用3倍量的25％酒精把吸附部分洗脫。把洗脫部分濃縮後，經4℃條件下冷卻15分鐘，使β-CD析出，通過離心分離除去。接著，把上清液提供給離子交換樹脂(toyopearl)HW-40S(Φ2.9×90cm)。測定每10ml部分的Brix，觀測1個主峰值(Tube23-28)。經HPLC對各部分分析，23-26部分是α-CD或α-CD和γ-CD的混合物，所以把27部分和28部分收集濃縮、凍結乾燥。通過HPLC檢驗的結果，該部分是純度為99.5％的γ-CD。最終離析出175mg的γ-CD。該γ-CD經NMR證實為γ-CD。
13C-NMR da ta104.30，83.08，75.56，74.93，74.40，62.86ppm工業上利用的可能性本發明可以提供有產生新γ-CGTase能力的微生物、優先生成γ-CD的新γ-CGTase。而且，由於本發明，可以提供用γ-CGTase有效製造γ-CD的方法。
序列表110日本食品化工株式會社120新的環糊精·葡聚糖轉移酶及其製造方法和用該酶製造環糊精的方法130A15085H160121012111547212DNA213庫拉奇芽孢桿菌73644001tggagagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt60cgagcggacc aaaggaagct tgcttccgga ggtcagcggc ggacgggtga gtaacacgtg120ggcaacctgc cttacagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatgaccg180atgggaccgc atggtcctgt cgtaaaagtt gggattacta acactgtaag atgggcccgc240ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg300agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag360tagggaatca tccgcaatgg gcgaaagcct gacggtgcaa cgccgcgtga acgaggaagg420tcttcggatt gtaaagttct gttgtcaggg aagaagaagt gccattcgaa yaggttggca480ccgtgacggt acctgacgag aaagccccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac540gtagggggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtttcttaa600gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag660tgtaggagag gaaagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa720caccagtggc gaaggcgact ttctggccta taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg780agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttag840gggtttcgat acccttagtg ccgcagttaa cacattaagc actccgcctg gggagtacgg900ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcagtgg agcatgtggt960ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgcc actcctggag1020acaggacgtt ccccttcggg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt1080gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca1140ttgagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt1200caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatgggt ggtacaaagg1260gcagcaacgc cgcgaggccg agcgaatccc agaaagccac tctcagttcg gattgcaggc1320tgcaactcgc ctgcatgaag ccggaattgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga1380atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa1440gtcggtgagg taaccttttg gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtgaag1500tcgtaacaag gtatccctac cggaaggtgc ggytggatca cctcctt154權利要求
1.環糊精·葡聚糖轉移酶，其特徵在於所述的環糊精·葡聚糖轉移酶有下述酶化學性質，①作用及底物特異性作用於澱粉、糊精、支鏈澱粉或直鏈澱粉，主要生成γ-環糊精，β-及α-環糊精的生成量比γ-環糊精的生成量低，②最佳pH10.5-11.0，③最佳溫度60℃左右，④穩定pH6-11，⑤溫度穩定性在50℃條件下、處理15分鐘顯示90％以上的殘存活性。
2.製造環糊精·葡聚糖轉移酶的方法，其特徵在於，培養屬於庫拉奇芽孢桿菌的有生產環糊精·葡聚糖轉移酶能力的微生物，在培養物中產生環糊精·葡聚糖轉移酶，然後獲取生成的環糊精·葡聚糖轉移酶。
3.根據權利要求2的製造方法，其中屬於庫拉奇芽孢桿菌種的有生產環糊精·葡聚糖轉移酶能力的微生物是庫拉奇芽孢桿菌7364株(FERM BP-7156)。
4.製造環糊精的方法，其特徵在於，使庫拉奇芽孢桿菌種產生的環糊精·葡聚糖轉移酶在含有選自澱粉、糊精、支鏈澱粉及直鏈澱粉中至少1種的溶液中進行反應，使其主要生成γ-環糊精。
5.根據權利要求4的製造方法，其中所述的環糊精·葡聚糖轉移酶是權利要求1所述的環糊精·葡聚糖轉移酶。
6.根據權利要求4或5的製造方法，其特徵在於，把生成的γ-環糊精從其它的環糊精中分離出來。
7.庫拉奇芽孢桿菌7364株(FERM BP-7156)，其為有產生環糊精·葡聚糖轉移酶能力的庫拉奇芽孢桿菌種菌。
全文摘要
本發明公開了一種有下述酶化學性質的CGTase。①作用及底物特異性作用於澱粉、糊精、支鏈澱粉或直鏈澱粉，主要生成γ－環糊精，β－及α－環糊精的生成量比γ－環糊精的生成量低。②最佳pH10.5－11.0③最佳溫度60℃左右④穩定pH6－11⑤溫度穩定性在50℃條件下、處理15分鐘顯示90％以上的殘存活性。CGTase的製造方法是培養屬於庫拉奇芽孢桿菌種的有產生CGTase能力的微生物(例如FERM BP－7156)，使其在培養物中產生CGTase，然後獲取生成的CGTase。CD的製造方法是在含有澱粉等的溶液中使庫拉奇芽孢桿菌種產生的CGTase進行反應，使其主要生成γ－CD。提供能優先生成γ－CD的γ－環糊精·葡聚糖轉移酶(CGTase)、有生產γ－CGTase能力的微生物、用γ－CGTase製造γ－CD的方法。
文檔編號C12N9/10GK1430669SQ01809990
公開日2003年7月16日 申請日期2001年5月23日 優先權日2000年5月23日
發明者高田正保, 井出貴啟, 山本健, 海野剛裕, 渡邊純未, 曾根博信, 山本幹男 申請人:日本食品化工株式會社