酶法合成膽紅素的製作方法

2023-10-05 18:28:54

專利名稱：酶法合成膽紅素的製作方法
酶法合成膽紅素屬於以動物血液為材料使用酶法合成膽紅素。
膽紅素為100多種中成藥製劑的主要成份，如人工牛黃、感冒清、撲熱息痛片、銀翹解毒丸等，因此市場需求量大。現國內外所用的膽紅素都是從動物膽汁中提取的，但膽汁中天然膽紅素含量相當低，豬膽汁為萬分之四左右，牛膽汁中僅有萬分之二。又由於膽汁原料缺乏，利用不充分，使膽紅素市場價格昂貴。
近年來，國際上的膽紅素的合成方面主要是化學合成法，如Bonne和McDonagn發表的用25mg氯化血紅素進行偶合氧化的方法，得到四種膽綠素異構體，其比例接近1∶1∶1∶1，然後用硼氫化鈉還原鹼解製備出膽紅素的四種異構體。這種化學合成法，操作繁雜，所用化學試劑昂貴，合成的四種異構體又不易分離，而適合藥用的只是膽紅素1Xα，其餘三種1Xβ、1Xγ、1Xδ不僅無藥理作用，而且對人體健康不利。1992年由Gosauer和Plieninger利用現代化技術的膽紅素全合成方法，採用吡咯化合物為原料，通過亞甲基橋連接成膽綠素再還原成膽紅素，這種方法要求的條件苛刻，成本昂貴。
國內對膽紅素的研究主要是從膽汁中提取膽紅素的工藝和方法的改進。如膽紅素鈣鹽間接提取法，該方法落後，生產周期長，但收率穩定在萬分之三左右，適合大規模生產，離子交換樹脂法適合於小規模生產，樹脂吸附不完全，收率低僅萬分之一點六左右，較好的方法是色層快速提取法，生產周期短，一般4小時左右，操作簡便，收率達萬分之三至四。國內也有學者在從事化學合成膽紅素的研究，利用血紅素為原料，化學合成得到膽紅素的四種異構體，但分離方法尚未很好解決，且成本高。
本發明旨在以動物血液為原料，用酶法一步合成無異構體的膽紅素產品，解決國內外在膽紅素合成上尚未解決的上述問題。
實現本發明的技術方案是，以動物血液為原料一步合成膽紅素的工藝如下(1)在新鮮動物血中加入8%檸檬酸鈉抗凝劑，在溫度為5～10℃，速率3000r.p.m條件下離心15』，得到的血紅蛋白液以10000r.p.m高速搗碎5』，破碎細胞成血紅蛋白漿;
(2)在血紅蛋白漿中，按新鮮血量的5%加入重組血紅素加氧酶系的混合酶液和3倍血紅蛋白漿量、pH為7.4的磷酸緩衝液上反應柱，同時在反應柱中加入2%的H2O2和5%葡萄糖液，在37℃溫度條件下反應5小時;
(3)在經酶解的反應液中加入1N的氫氧化鈉溶液，調節pH至11，並煮沸3』;
(4)鹼解液在5℃溫度條件下，以3000r.p.m速率離心15』去除蛋白;
(5)在上清液中按1∶1的重量比加入氯仿液，再調pH至4.5～5.0，分層，收集氯仿混合液;
(6)氯仿混合液經旋轉蒸發濃縮後減壓，在50℃溫度下回收氯仿得膽紅素液;
(7)膽紅素液用無水乙醇、乙醚洗滌除去雜質得到膽紅素，再在60℃溫度中真空乾燥為膽紅素成品。
重組血紅素加氧酶系混合酶液是從新鮮動物肝、脾製得的血紅素加氧酶、膽綠素還原酶和NAOPH-細胞色素C還原酶以1∶1∶1的比例混合，加入pH7.4的磷酸緩衝液配製成50mM的酶液，並加入5%的肝糜漿即成。
下面進一步詳述本發明。
關於血紅素的卟啉環氧化斷裂的機制雖然尚未完全了解，但已經知道，在生物體內網狀內皮系統(主要是脾和肝臟中的星形細胞)內含有活潑的血紅素加氧酶，它在氧分子(O2)和NAOpH存在下，可將鐵卟啉環上α-甲炔基(-CH＝)氧化斷裂，釋放出CO和Fe+2，並使兩側的吡咯環羥化，形成膽綠素，後者又在膽綠素還原酶的作用下，從NAOPH接受兩個質子(H+)和兩個電子(e-)而還原成膽紅素(見下列代謝途經)。

血紅素加氧酶系引起血紅降解的產物是專一性的膽綠素1Xα，因血紅素加氧酶同血紅素的結合是通過血紅素-Fe並列結合到酶的組氨酸殘基上，結果使卟啉環α-甲炔基橋斷裂形成特異性的膽綠素1Xα，這種膽色素又被膽綠素還原酶催化還原成膽紅素1Xα。
在動物和人體細胞中血紅蛋白分解代謝產生的血紅素被血紅素加氧酶系(即NAOPH-細胞色素還原酶、血紅素加氧酶和膽綠素還原酶)催化降解成膽紅素1Xα。前兩種酶存在於網狀內皮系統中，後一種酶存在於胞漿中，以不均勻狀態分布。Hino等人報告，血紅素加氧酶分布在接近微粒體膜的表面，且催化的活性部位暴露到細胞膜的表面，血紅素被氧化成膽綠素發生在微粒體膜，膽綠素還原膽紅素可能發生在膜-胞漿界面。本發明從牛、豬等動物組織中提取純化得到NAOPH-細胞色素C還原酶、血紅素加氧酶及膽綠素還原酶，重組成血紅素加氧酶系，在體外生理條件下非膜重組的三種酶的混合物能使血紅素降解為膽紅素1Xα，Sepharose4B柱親和層析表明，三種酶混合後組成一個非單一性質的酶三元複合物;SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析表明，複合物中的三種酶可以分離，且分子量沒發生變化，組成的摩爾比為1∶1∶1，說明三種酶在形成三元複合物時，仍保留每一種酶的性質，以及三種酶各自在膽紅素合成過程中的作用。血紅素加氧酶與NAOPH-細胞色素C還原酶的混合使血紅素降解為專一性的膽綠素1Xα，這裡血紅素加氧酶提供專一性的結合部位，定點識別並結合血紅素的α位，而NAOPH-細胞色素C還原酶使血紅素氧化開環，然後再由血紅素加氧酶催化斷裂後的兩端羥化;而催化膽綠素還原成膽紅素是酶三元複合物中膽綠素還原酶的作用，其催化部位鄰近於前二種酶的活性部位。
血紅素加氧酶是參照Yoshinga等的方法從豬脾中分離純化的，純化後的活性為6550單位/mg蛋白(1個活力單位定為每小時轉化1nmol的膽綠素);NAOPH-Cyt.C還原酶是從豬脾中提取的，根據Yasukochi等的方法，利用2′、5′-AOP-Sepharose-48進行親和層析，酶的最低活性為62.8單位/mg蛋白(1個活力單位定為每分鐘還原1nmol的細胞色素C);膽綠素還原酶是從豬肝中分離純化的，純化後的活性為1100單位/mg蛋白(1個單位定為每分鐘催化生成1nmol膽紅素)。
分離純化血紅素加氧酶系的基本方法見附圖
，用該分離純化方法;每公斤豬肝或脾可獲得血紅素加氧酶4.54mg，NAOPH-細胞色素C還原酶9.25mg，膽綠素還原酶6.78mg。
血紅素降解含成膽紅素的過程與諸多因素有關，如溫度、保溫時間、緩衝液種類，如溫度、保溫時間、緩衝液種類、pH值及離子強度等，還需要O2和NAOPH，因此在血紅素加氧酶重組的混合酶液中加5%的肝糜漿，使其中的過氧化氫酶分解H2O2補充O2，磷酸戊糖途經酶系補充NAOPH。
本發明以動物血液(豬血、牛血、雞血等)為原料，採用血紅素加氧酶系粗酶混合液一步合成膽紅素，與國際通用方法比較，生產周期縮短三分之二，成本降低70%左右，收率高達總血量的千分之一，血紅素轉化率達65%以上，產品純度高，無對人體有害的異構體，藥物有效成份膽紅素1Xα含量高達92.00%至95.24%。原料資源廣泛，價格低廉，經濟效益顯著，還為動物血的綜合利用開闢了新途徑。
權利要求
1.一種以新鮮動物血為原料一步合成膽紅素的方法--酶法合成膽紅素，其特徵在於膽紅素的酶促降解合成工藝如下(1)在新鮮動物血中加入8%檸檬酸鈉抗凝劑，在溫度為5～10℃，速率3000r.p.m條件下離心15′，得到的血紅蛋白液以10000r.p.m高速搗碎5′，破碎細胞成血紅蛋白漿；(2)在血紅蛋白漿中，按新鮮血量的5%加入重組血紅素加氧酶系的混合酶液和3倍血紅蛋白漿量、PH為7.4的磷酸緩衝液上反應柱，同時在反應柱中加入2%的H2O2和5%葡萄糖液，在37℃溫度條件下反應5小時；(3)在經酶解的反應液中加入1N的氫氧化鈉溶液，調節PH至11，並煮沸3′；(4)鹼解液在5℃溫度條件下，以3000r.p.m速率離心15′去除蛋白；(5)在上清液中按1∶1的重量比加入氯仿液，再用2N鹽酸調溶液至PH至4.5～5.0，分層，收集氯仿混合液；(6)氯仿混合液經旋轉蒸發濃縮後，減壓，在50℃溫度下回收氯仿得膽紅素液；(7)膽紅素液用無水乙醇、乙醚洗滌除去雜質得到的膽紅素，再在60℃溫度中真空乾燥為膽紅素成品。
2.按權利要求1所述的酶法合成膽紅素，其特徵在於重組的血紅素加氧酶系混合酶液是從新鮮動物的肝、脾製得的血紅素加氧酶、膽綠素還原酶和NAOPH-細胞色素C還原酶以1∶1∶1的比例組合，加入pH7.4的磷酸緩衝液配製成50mM的酶液，並加入5%的肝糜漿即成混合酶液。
全文摘要
酶法合成膽紅素屬於以動物血液為材料使用酶法合成膽紅素。酶促降解合成膽紅素的工藝是將新鮮動物血離心、細胞破碎成血紅蛋白漿後加入一定量的重組血紅素加氧酶系混合液在37℃的反應柱中酶解5小時，酶解液加入氫氧化鈉鹼解，離心去除蛋白，上清液用氯仿萃取後蒸發濃縮，洗滌製成膽紅素，用本法合成的膽紅素生產周期縮短三分之二，成本降低70％，收率高達總血量的千分之一，血紅素轉化率達65％以上，產品純度高，膽紅素IXa含量高達92％以上，經濟效益顯著。
文檔編號C12N9/02GK1097026SQ9311147
公開日1995年1月4日 申請日期1993年6月30日 優先權日1993年6月30日
發明者龔興國, 曾冬雲, 易春光, 吳立安, 饒力群 申請人:吉首大學