Fe3O4磁性納米粒子在製備抗衰老劑中的應用的製作方法

2023-10-05 17:28:00

本發明涉及Fe3O4磁性納米粒子的新用途領域，尤其涉及一種Fe3O4磁性納米粒子在製備抗衰老劑中的應用。所述的抗衰老劑可以是食品、藥品或保健品。

背景技術：

四氧化三鐵是一種具有鐵磁性的黑色固體，其化學式為Fe3O4。粒度為納米級別的Fe3O4通常被稱為Fe3O4磁性納米粒子，其製備方法主要有沉澱法、水熱法、溶膠-凝膠法、微乳化法、微波法、熱解羰基前軀體法、超聲法、空氣氧化法、熱解-還原法、多元醇還原法等。

Fe3O4磁性納米粒子不僅可以用於磁記錄、磁密封和塗料等領域，還可以用於生物醫藥領域。在現有技術中，Fe3O4磁性納米粒子在生物醫藥領域已知可用於生物分離、磁熱療、靶向給藥、磁共振造影和磁性粒子成像。

目前，已經報導的一個衰老因素是細胞內活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的濃度超出生理濃度，這會造成氧化應激、脂質體過度氧化、DNA損壞、蛋白質氧化、線粒體損傷，進而誘導細胞死亡，加速個體衰老，因此只要能夠降低或消除細胞內的ROS就可以達到抗衰老的目的。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種Fe3O4磁性納米粒子在生物醫藥領域的新用途，即在製備抗衰老劑中的應用。

實際上，本發明涉及Fe3O4磁性納米粒子在製備抗衰老劑中的應用，抗衰老劑以Fe3O4磁性納米粒子為活性成分。

優選地，所述的抗衰老劑是可食用營養物質包覆的Fe3O4磁性納米粒子。其中，所述可食用營養物質可以是糖類、脂類、蛋白質、維生素、無機鹽或膳食纖維中的至少一種，但最好為葉酸、聚乳酸、膠原蛋白、多肽、透明質酸、澱粉、殼聚糖或大豆卵磷脂中的至少一種。

優選地，Fe3O4磁性納米粒子與可食用營養物質的質量比為1:0.01～1:100。

優選地，抗衰老劑所使用的Fe3O4磁性納米粒子的水力學直徑為5～80nm，並且粒徑分布不大於15％。

可食用營養物質包覆的Fe3O4磁性納米粒子具有較高的水相穩定性和生物相容性，從而可以使Fe3O4磁性納米粒子進入細胞內；而進入細胞內的Fe3O4磁性納米粒子在一定劑量範圍內能夠顯著降低由雙氧水或神經毒素誘導的細胞內ROS水平上升和細胞凋亡，消除細胞內過量氧自由基，緩解由外界刺激、衰老或基因功能異常造成的氧化應激，從而能夠起到良好的抗衰老功效。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域的普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他附圖。

圖1為本發明所提供的10nm油溶性Fe3O4磁性納米粒子的透射電鏡照片。

圖2為本發明實施例1所提供的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子的透射電鏡照片。

圖3為本發明實施例1所提供的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子的水力學尺寸統計圖。

圖4為本發明實施例1所提供的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子的細胞毒性實驗結果圖。

圖5為本發明實施例1所提供的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子的流式細胞儀分析的實驗結果圖。

圖6為本發明實施例2所提供的20nm油溶性Fe3O4磁性納米粒子的透射電鏡照片。

圖7為本發明實施例2所提供的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子的透射電鏡照片。

圖8為本發明實施例2所提供的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子的水力學尺寸統計圖。

圖9為本發明實施例2所提供的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子的細胞毒性實驗結果圖。

圖10為本發明實施例2所提供的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子的流式細胞儀分析的實驗結果圖。

具體實施方式

下面結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明的實施例，本領域普通技術人員在沒有付出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明的保護範圍。

下面對本發明所提供的Fe3O4磁性納米粒子在製備抗衰老劑中的應用進行詳細描述。

實施例1

10nm油溶性Fe3O4磁性納米粒子的製備：將2mmol乙醯丙酮鐵、4mmol油酸和20mL十八烯加入到150mL的三口瓶中，並且邊加熱邊以1600rpm/min的轉速磁力攪拌混合均勻；當加熱到80℃時，對三口瓶抽真空30min，再向三口瓶內充入氮氣，繼續升溫至300℃，回流1小時進行反應；反應結束後，移除熱源，並自然冷卻到室溫。向反應結束後的產物中加入適量的乙醇，然後以6000rpm/min的轉速離心分離10min；取離心分離得到的沉澱物，加入適量的氯仿，使沉澱物溶解，然後以6000rpm/min的轉速再次離心分離10min；取再次離心分離得到的上層液體，重複加入乙醇—離心分離—加入氯仿—再次離心分離的過程3次，最後離心分離得到的沉澱物就是油溶性Fe3O4磁性納米粒子，將該油溶性Fe3O4磁性納米粒子倒入一個20mL的樣品瓶中備用。由於該油溶性Fe3O4磁性納米粒子的生物相容性不是很好，不便食用，因此需要採用可食用營養物質包覆的Fe3O4磁性納米粒子，以提高Fe3O4磁性納米粒子的生物相容性，例如：可以採用大豆卵磷脂包覆Fe3O4磁性納米粒子。

大豆卵磷脂包覆Fe3O4磁性納米粒子的製備：將本發明實施例1中製得的10nm油溶性Fe3O4磁性納米粒子以及市場購買的大豆卵磷脂一同分散在氯仿中，並在60℃的環境中旋轉蒸發，直至氯仿全部蒸發完全，然後加入去離子水超聲分散10分鐘，從而即可得到大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子而成的磁性水溶膠。

油溶性Fe3O4磁性納米粒子的形貌觀察：將本發明實施例1中製得的10nm油溶性Fe3O4磁性納米粒子滴加在300孔的銅網上，自然乾燥後採用透射電鏡(加速電壓為200kV)觀測其粒子的大小和形態，從而可以得到如圖1所示的透射電鏡照片。由圖1可以看出：該油溶性Fe3O4磁性納米粒子的尺寸為10nm左右，大小形貌均一。

大豆卵磷脂包覆Fe3O4磁性納米粒子的形貌觀察：將本發明實施例1中製得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子滴加在300孔的銅網上，自然乾燥後採用透射電鏡(加速電壓為200kV)觀測其粒子的大小和形態，從而可以得到如圖2所示的透射電鏡照片。對本發明實施例1中製得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子進行水力學尺寸統計，從而可以得到如圖3所示的水力學尺寸統計圖。由圖2和圖3可以看出：本發明實施例1中製得的大豆卵磷脂包覆Fe3O4磁性納米粒子的尺寸為10nm左右，大小形貌均一，尺寸分布窄，而且在水中具有較好的單分散性。

生物毒性試驗：本發明實施例1中Fe3O4磁性納米粒子與大豆卵磷脂可以採用不同的質量比，從而可以製得Fe濃度不同的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子。將不同Fe濃度的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子與人的子宮頸細胞共培養，然後採用CellCounting Kit-8(CCK-8)來檢測其生物毒性，從而可以得到如圖4所示的細胞毒性實驗結果圖。由圖4可以看出：培養時間為24小時後，在濃度為12.5μg/mL到200μg/mL的Fe之間，本發明實施例1中製得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子均有很好的生物相容性，細胞的毒性仍然很弱，細胞的活性約為1；大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子具有非常高的生物相容性，尤其是在用Fe濃度高的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4納米顆粒去培養子宮頸細胞時生物相容性更好。

抗衰老試驗：對本發明實施例1中製得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子進行抗衰老試驗：將人體子宮頸細胞種在6孔板中，每個孔種3×104個細胞，並且在37℃和5％CO2的細胞培養箱中過夜培養，待細胞貼壁後向6孔板中加入100μg/mL本發明實施例1中製得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子，共培養24小時；再向6孔板中加入800μM的雙氧水繼續共培養20小時；然後將細胞收集起來，用磷酸緩衝液PBS洗三次，接著用100μL的2,7-二氯螢光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)給細胞染色，20分鐘後染色結束，用DMEM細胞培養液洗兩次，再用流式細胞儀檢測細胞內的ROS水平，從而可以得到如圖5所示的流式細胞儀分析的實驗結果圖；其中，圖5中的「Ctrl」表示未加入雙氧水而只有人體子宮頸細胞和大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子進行共培養的，「Fe3O4+H2O2」表示人體子宮頸細胞、大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子以及雙氧水這三者進行共培養的，「H2O2」表示未加入大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子而只有人體子宮頸細胞和雙氧水進行共培養的。由圖5可以看出：「H2O2」組的細胞內ROS水平最高，當加入大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子後，Fe3O4磁性納米粒子能夠起到類似過氧化氫酶的作用，使細胞內ROS水平大幅降低。

由此可見，本發明實施例1中製得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe3O4磁性納米粒子具有較高的水相穩定性和生物相容性，可以使Fe3O4磁性納米粒子進入細胞內；而進入細胞內的Fe3O4磁性納米粒子在一定劑量範圍內能夠顯著降低由雙氧水或神經毒素誘導的細胞內ROS水平上升和細胞凋亡，消除細胞內過量氧自由基，緩解由外界刺激、衰老或基因功能異常造成的氧化應激，從而能夠起到良好的抗衰老功效。

實施例2

20nm油溶性Fe3O4磁性納米粒子的製備：將2mmol乙醯丙酮鐵、6mmol油酸、6mmol油胺和20mL十八烯加入到150mL的三口瓶中，並且邊加熱邊以1600rpm/min的轉速磁力攪拌混合均勻；當加熱到80℃時，對三口瓶抽真空30min，再向三口瓶內充入氮氣，繼續升溫至200℃，保溫30分鐘，然後升溫至300℃，回流30分鐘進行反應；反應結束後，移除熱源，並自然冷卻到室溫。向反應結束後的產物中加入適量的乙醇，然後以6000rpm/min的轉速離心分離10min；取離心分離得到的沉澱物，加入適量的氯仿，使沉澱物溶解，然後以6000rpm/min的轉速再次離心分離10min；取再次離心分離得到的上層液體，重複加入乙醇—離心分離—加入氯仿—再次離心分離的過程3次，最後離心分離得到的沉澱物就是Fe3O4磁性納米粒子，將該油溶性Fe3O4磁性納米粒子倒入一個20mL的樣品瓶中備用。由於該油溶性Fe3O4磁性納米粒子的生物相容性不是很好，不便食用，因此需要採用可食用營養物質包覆的Fe3O4磁性納米粒子，以提高Fe3O4磁性納米粒子的生物相容性，例如：可以採用大豆卵磷脂包覆Fe3O4磁性納米粒子。

大豆卵磷脂包覆Fe3O4磁性納米粒子的製備：將本發明實施例2中製得的20nm油溶性Fe3O4磁性納米粒子以及市場購買的大豆卵磷脂一同分散在氯仿中，並在50℃的環境中旋轉蒸發，直至氯仿全部蒸發完全，然後加入去離子水超聲分散10分鐘，從而即可得到大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子而成的磁性水溶膠。

油溶性Fe3O4磁性納米粒子的形貌觀察：將本發明實施例2中製得的20nm油溶性Fe3O4磁性納米粒子滴加在300孔的銅網上，自然乾燥後採用透射電鏡(加速電壓為200kV)觀測其粒子的大小和形態，從而可以得到如圖6所示的透射電鏡照片。由圖6可以看出：該油溶性Fe3O4磁性納米粒子的尺寸為20nm左右，大小形貌均一。

大豆卵磷脂包覆Fe3O4磁性納米粒子的形貌觀察：將本發明實施例2中製得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子滴加在親水性300孔的銅網上，自然乾燥後採用透射電鏡(加速電壓為200kV)觀測其粒子的大小和形態，從而可得到如圖7所示的透射電鏡照片。對本發明實施例2中製得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子進行水力學尺寸統計，從而可以得到如圖8所示的水力學尺寸統計圖。由圖7和圖8可以看出：本發明實施例2中製得的大豆卵磷脂包覆Fe3O4磁性納米粒子的尺寸為20nm左右，大小形貌均一，尺寸分布窄，而且在水中具有較好的單分散性。

生物毒性試驗：本發明實施例2中Fe3O4磁性納米粒子與大豆卵磷脂可以採用不同的質量比，從而可以製得Fe濃度不同的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子。將不同Fe濃度的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子與人的子宮頸細胞共培養，然後採用CellCounting Kit-8(CCK-8)來檢測其生物毒性，從而可以得到如圖9所示的細胞毒性實驗結果圖。由圖9可以看出：培養時間為24小時後，在濃度為15.5μg/mL到200μg/mL的Fe之間，本發明實施例2中製得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子均有很好的生物相容性，細胞的毒性仍然很弱，細胞的活性約為1；大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子具有非常高的生物相容性，尤其是在用Fe濃度高的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4納米顆粒去培養子宮頸細胞時生物相容性更好。

抗衰老試驗：對本發明實施例2中製得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子進行抗衰老試驗：將人體子宮頸細胞種在6孔板中，每個孔種3×104個細胞，並且在37℃和5％CO2的細胞培養箱中過夜培養，待細胞貼壁後向6孔板中加入100μg/mL本發明實施例2中製得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子，共培養24小時；再向6孔板中加入800μM的雙氧水繼續共培養20小時；然後將細胞收集起來，用磷酸緩衝液PBS洗三次，接著用100μL的2,7-二氯螢光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)給細胞染色，20分鐘後染色結束，用DMEM細胞培養液洗兩次，再用流式細胞儀檢測細胞內的ROS水平，從而可以得到如圖10所示的流式細胞儀分析的實驗結果圖；其中，圖10中的「Ctrl」表示未加入雙氧水而只有人體子宮頸細胞和大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子進行共培養的，「Fe3O4+H2O2」表示人體子宮頸細胞、大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子以及雙氧水這三者進行共培養的，「H2O2」表示未加入大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子而只有人體子宮頸細胞和雙氧水進行共培養的。由圖10可以看出：「H2O2」組的細胞內ROS水平最高，當加入大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子後，Fe3O4磁性納米粒子能夠起到類似過氧化氫酶的作用，使細胞內ROS水平大幅降低。

由此可見，本發明實施例2中製得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe3O4磁性納米粒子具有較高的水相穩定性和生物相容性，可以使Fe3O4磁性納米粒子進入細胞內；而進入細胞內的Fe3O4磁性納米粒子在一定劑量範圍內能夠顯著降低由雙氧水或神經毒素誘導的細胞內ROS水平上升和細胞凋亡，消除細胞內過量氧自由基，緩解由外界刺激、衰老或基因功能異常造成的氧化應激，從而能夠起到良好的抗衰老功效。

綜上可見，可食用營養物質包覆的Fe3O4磁性納米粒子具有較高的水相穩定性和生物相容性，可以使Fe3O4磁性納米粒子進入細胞內；而進入細胞內的Fe3O4磁性納米粒子在一定劑量範圍內能夠顯著降低由雙氧水或神經毒素誘導的細胞內ROS水平上升和細胞凋亡，消除細胞內過量氧自由基，緩解由外界刺激、衰老或基因功能異常造成的氧化應激，從而能夠起到良好的抗衰老功效。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應該以權利要求書的保護範圍為準。