一種用於水質生物毒性快速檢測的發光菌試紙及其製備方法
2023-10-06 05:29:49 2
專利名稱：一種用於水質生物毒性快速檢測的發光菌試紙及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物分析檢測技術領域，具體涉及一種能夠快速現場檢測水體生物毒性的發光菌試紙，並提供了該試紙的製備方法。
背景技術：
隨著工業化程度的升高以及各類化工產品汙染水體事件的突發，各種化學物質數量猛增，給人類生存環境造成很大影響，迫切需要對日益增多的環境汙染物進行急性毒性鑑定。傳統的化學分析方法能準確定量分析汙染物中主要成分的含量，但不能直接而又及時地反映各種有毒物質對環境和生物的綜合影響。傳統的動物毒性實驗以哺乳類、魚類等為受試對象，雖然能反映毒物對生物的直接影響，但方法繁瑣，實驗周期長，不滿足水質急性毒性檢測的需求。針對傳統毒性檢測方法的不足，目前國內外研究者建立了各種各樣的生物實驗方法，包括微生物、藻、底棲軟體動物、浮遊生物、魚等，用來監測環境汙染物對水生生物的毒性，其中發光菌因其獨特的生理特性，與現代光電檢測手段完美匹配的特點而倍受關注。發光菌最特別的生理代謝特徵是在其生長的一定時間內，能夠發射可見光，簡單來說，細菌發光可概括如下:
細菌身體內可以合成一種酶，該酶可以催化還原型的黃素單核苷酸(FMNH2)和長鏈脂肪醛(RCH0，至少含8個C)並在O2的參與下發生氧化反應而放出光子。該氧化反應並不放熱，所以發光菌發出的是典型的「冷」光。發光波長在490nm左右。這種發光過程極易受到外界條件的影響，凡是幹擾或損害細菌呼吸或生理過程的任何因素都能使細菌發光強度發生變化。當有毒有害物質與發光菌接觸時，發光強度立即改變，並隨著毒物濃度的增加而發光減弱。利用發光菌遇到毒性物質即減弱發光這一特性，可以快速而又相對準確地測試出水體的生物急性毒性。水凝膠(hydrogels)是一種親水性但不溶於水的高分子聚合物，是一類集吸水、保水、緩釋於一體並且發展迅速的功能高分子材料。水凝膠具有獨特的吸水、保水及仿生特性，因而被廣泛應用於工業、農業、醫藥和生物工程材料領域。水凝膠還具有優良生物相容性，親水性的水凝膠與被固定的酶或細胞的相互作用極弱，固定在水凝膠中的生物分子的活性能夠長時間保持。目前水凝膠已成功應用於固定哺乳動物細胞、DNA雜交分析等等。但是，目前還未見將發光細菌固定在水凝膠中，用於快速水體生物毒性的的報導。將發光細菌固定在水凝膠中，使得整個檢測過程更為簡便，測量結果更為穩定，由於細菌被固定在水凝膠中，因而對外界的條件變化適應性更好。此外由於試紙的便攜性，檢測時可將試紙直接投入待測水樣中，待反應時間結束後將試紙拿出然後進行發光度檢測。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能夠快速現場檢測水體生物毒性的發光菌試紙。該試紙同現行的檢測技術相比具有穩定、低價、便攜和靈敏性更高的特點。本發明提供的能夠快速現場檢測水體生物毒性的發光菌試紙，以普通試紙材料為基底，通過水凝膠包裹發光菌，在紫外燈的照射下凝固為固態，從而將發光菌固定在試紙上而得到。該發光菌試紙放於_20°C冰箱保存，待用。本發明提供的發光菌試紙的製備方法，具體步驟如下:
Ca)準備試紙基底，裁剪成需要的尺寸；
(b)將發光菌菌粉和水凝膠按混合；
(C)將發光菌菌粉和水凝膠的混合物滴加於試紙基底上；
Cd)將試紙置於紫外燈下照射固定。本發明提供的發光菌試紙的用於檢測的方法如下:將發光菌試紙放入2%的氯化鈉溶液進行復甦，(約13-18分鐘)復甦完畢後，將發光菌試紙投入待測水體，檢測發光菌試紙上發光菌的初始發光量和15分鐘(或30分鐘)後的發光量，對比得出抑光率，從而實現對該水體生物毒性的檢測。本發明中，用於凝固試紙上水凝膠和發光菌的紫外燈，可選用一般市面上售賣的可攜式手提紫外燈即可。用於檢測發光菌試紙上發光菌的發光量的裝置選用杭州綠潔公司的光子探測儀。本發明中，水凝膠可選用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，並用2-羥基_2_甲基苯基苯酮(HMPP)作為光引發劑，其中光引發劑為水凝膠體積的4%-6%，優選5% ;菌種:費氏弧菌凍乾粉(Vibrio fische ri)，市售的一般費氏弧菌凍乾粉都可以滿足實驗要求。該實驗在一般常溫條件下即可進行。本發明中，發光菌菌粉和水凝膠的混合物的用量比例範圍為:3 4mg菌粉和IOOuL的水凝膠混合。本發明中，紫外燈下照射固定時間為8 —15秒。本發明提供的發光菌試紙，大小可為IOcmX lcm。本方明中，抑光率測量步驟和數據處理方法參考IS011348。具體實驗參數和試紙製備見下文具體實施方式
。
具體實施例方式試紙準備。將發光菌凍乾粉溶於水凝膠(95%的PEGDA和5%的HMPP)中，按一次檢測用量溶於IOOPL水凝膠進行溶解(例:如傳統實驗中該管凍乾粉用於三次測試，則在製備試紙時與300μ 水凝膠混合)。取IOOPL水凝膠和細菌凍乾粉混合物滴於試紙上，面積大約為I X Icm2，將試紙放於紫外燈下照射IOs左右，水凝膠即凝固，置於-20°C的冰箱內保存待用。菌粉復甦。需要進行水質生物毒性檢測時，將固定有水凝膠的試紙放入2%的NaCl溶液(至少ImL)中在室溫條件下先進行菌粉復甦，15分鐘即可復甦完畢，此時菌粉已溶解，發光菌也恢復活性並被固定於水凝膠中。生物毒性檢測。將復甦後的發光菌試紙放入待測水樣中，立即讀取發光量，然後等待15分鐘(或30分鐘)，待發光菌與水中毒性物質反應完畢，再次讀取發光量，然後根據IS011348提供的方法進行抑光率和EC50值的計算，從而評估出該水樣的生物毒性。
為了佐證該新型試紙的準確性和可靠性，我們利用三種毒性物質水樣(硫酸鋅、重鉻酸鉀以及3，5- 二氯苯酚)以及三種實際樣品(地表水、自來水廠進廠水和汙水廠進廠水)分別進行了傳統發光菌和發光菌試紙毒性測試。結果證明，兩種方法得出的結果相近，抑光率和水樣毒性之間的關係曲線趨勢一致。同時，在該試紙的條件優化實驗中，由於發光菌被固定在固態水凝膠中，因此受外界液體環境的滲透壓影響較小，在實際操作中，可以省去調節水樣滲透壓的步驟。實驗結果更為穩定且更具重現性。因此可以認定該方法可靠可行，具有實際應用價值。
權利要求
1.一種能夠快速現場檢測水體生物毒性的發光菌試紙，其特徵在於以普通試紙材料為基底，通過水凝膠包裹發光菌，在紫外燈的照射下凝固為固態，從而將發光菌固定在試紙上而得到。
2.如權利要求1所述的發光菌試紙的製備方法，其特徵在於具體步驟如下: Ca)準備試紙基底，裁剪成需要的尺寸； (b)將發光菌菌粉和水凝膠按混合； (c)將發光菌菌粉和水凝膠的混合物滴加於試紙基底上； Cd)將試紙置於紫外燈下照射固定。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述水凝膠選用聚乙二醇二丙烯酸酯，並用2-羥基-2-甲基苯基苯酮作為光引發劑，其中光引發劑為水凝膠體積的4%-6%。
4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述發光菌菌粉和水凝膠的混合物的用量比例範圍為:3 4mg菌粉對應和IOOuL的水凝膠混合。
5.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述紫外燈下照射固定時間為8—15秒。
6.如權利要求1所述發光菌試紙的用於檢測的方法如下:將發光菌試紙放入2%的氯化鈉溶液進行復甦，復甦完畢後，將發光菌試紙投入待測水體，檢測發光菌試紙上發光菌的初始發光量和15分鐘或30分鐘後的發光量，對比得出抑光率，從而實現對該水體生物毒性的檢測。
全文摘要
本發明屬生物分析檢測技術領域，具體是一種能夠快速現場檢測水體生物毒性的發光菌試紙及其製備方法。該種發光菌試紙以普通試紙材料為基底，通過水凝膠包裹發光菌，在紫外燈的照射下由液態凝固為固態，從而將發光菌固定在試紙上。將試紙投入待測水體，通過試紙上發光菌的初始發光量和15分鐘(或30分鐘)後發光量對比得出抑光率，從而實現對該水體生物毒性的檢測。本發明具有快速、高效、便捷、低價等特點，也具有高靈敏度和對外界條件變化的高耐受性，適用於各種水環境的毒性快速現場檢測。
文檔編號G01N21/76GK103105388SQ20131003342
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者隋國棟, 張金玲, 聶曉冬, 劉思秀 申請人:復旦大學