用於細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器及其製備方法

2023-10-06 03:29:24 1

專利名稱：用於細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器及其製備方法。
背景技術：
1992年美國分子器件公司首次提出將活細胞與EIS(電解質/絕緣層/矽)結構的光尋址電位傳感器相結合，構成敏感測試儀器，檢測胞外微環境酸鹼度的變化，在此基礎上，又有研究人員改進傳感器結構和數據處理方法，使該類傳感器可以同時檢測幾種離子的變化。但是，這些細胞傳感器檢測的都是細胞群的代謝產物，所以很難確定藥物對單個細胞的作用機理，同時，也難以將測量精確定位到離子通道，無法確定藥物對細胞的作用靶點，對於實現藥物篩選的定量化是個不可迴避的難點。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於細胞動作電位檢測及藥物分析測量的單細胞傳感器及其製備方法，能夠對單個細胞外動作電位進行定性和定量檢測。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案如下1、本發明的系統結構在鋁板上固定敷銅板，敷銅板上粘附具有SiO2層的打磨的Si片，聚二甲基矽氧烷作的微型測量腔固定在SiO2層上，微型測量腔上覆蓋一層生物兼容性膠，與下表面鍍金膜參考電極的光學玻璃粘接，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養液的進液乳膠管和出液乳膠管，敷銅板上引出工作電極，對電極與金膜參考電極相連。
所說的微型測量腔為1～2個。
2、本發明的製備方法(1)光尋址電位傳感器的製備選用100n型單晶矽片作為光尋址電位傳感器的襯底，矽片經拋光清洗後，放入1000℃高溫爐中進行熱氧化20分鐘，使矽片正面生長一層厚度約為30nm的SiO2薄膜，從背面將矽片的厚度打磨至100μm，然後用導電膠將矽片粘在敷銅板上，160℃高溫固化2小時，通過歐姆接觸從敷銅板上引出工作電極；(2)矽器件表面處理兩種細胞固定的方案塗敷法即在晶片表面做增強貼附性的塗層；通過改變晶片表面的粗糙度，做誘導細胞生長的圖形；塗敷法過程如下將100μg/ml多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩衝液和8μg/ml層粘素的磷酸鹽緩衝液按1∶1混合，用0.22μm的微孔濾膜濾菌，將器件浸入該混合溶液中，37℃，5％CO2環境下，浸泡24小時，再用雙蒸水衝洗兩次，冷凍備用；改變晶片表面的粗糙度的過程如下用光刻技術在光尋址電位傳感器表面做2×2mm2的微腔圖形，改變矽片的表面粗糙度，然後再進行塗層的處理；(3)參考電極製備熱丙酮清洗增透光學玻璃，80℃烘乾，在玻璃表面，用坐標紙做掩模，採用磁控濺射技術在玻璃表面按掩模形狀鍍金，用導電膠將導線與金膜參考電極粘接，參考電極再與對電極連接；(4)安置微型測量腔用聚二甲基矽氧烷製備0.2×5×5cm3的薄膜結構，用模具在上刻出兩個測量腔，腔的尺寸為0.2×1.4×0.5cm3，用生物兼容性膠將此結構粘著於光尋址電位傳感器表面，在此腔中培養細胞，測量時，上面粘光學玻璃為上蓋，形成密封的微型測量腔。
本發明具有的優點是該單細胞傳感器提高了精度和穩定度，細胞貼附生長狀況良好，將測量定位於單個細胞，可以準確測量藥物刺激下，單細胞的胞外動作電位變化。本發明改善了光源設計，提高了精度和穩定度，可以將測量定位於單個細胞甚至單個離子通道，從而將精確測量藥物對單個細胞的作用及作用靶點。這種單細胞傳感器，可以實現神經細胞外動作電位的快速、實時監測，定性分析不同濃度不同藥物對細胞的興奮和抑制作用，主要應用於藥物篩選、分析和評價。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明。
圖1是單細胞傳感器沿圖2的I-I方向剖面結構圖；圖2是單細胞傳感器俯視圖；
圖3是採用塗敷法提高器件的靈敏度；圖4是矽器件表面處理後細胞生長狀況；圖5是改變矽器件表面粗糙度的顯微圖形；圖6是單細胞傳感器檢測實例系統示意圖；圖7是n型矽襯底LAPS的特性曲線示意圖；圖8是無藥物刺激時，單細胞傳感器的基線；圖9是低濃度乙醯膽鹼刺激時單細胞傳感器的響應；圖10是中濃度乙醯膽鹼刺激時單細胞傳感器的響應；圖11是高濃度乙醯膽鹼刺激時單細胞傳感器的響應。
圖中，1.鋁板，2.敷銅板，3.光可尋址電位傳感器，3.1.打磨薄後的Si片，3.2.SiO2層，4.光學玻璃，5.金膜參考電極，6.紅光雷射器，7.聚二甲基矽氧烷微型腔，8.生物兼容性膠，9.多聚鳥胺酸與層粘素層，10.工作電極，11.對電極，12.進液乳膠管，13.出液乳膠管。
具體實施例方式
1、傳感器的檢測結構如圖1、圖2所示，本發明在鋁板1上固定敷銅板2，敷銅板2上粘附具有SiO2層3.2的打磨薄的Si片3.1，聚二甲基矽氧烷作的微型測量腔7固定在SiO2層3.2上，聚二甲基矽氧烷微型測量腔7上覆蓋一層生物兼容性膠8，與下表面鍍金膜參考電極5的光學玻璃4粘接，微型測量腔7內塗敷一層多聚鳥胺酸與層粘素層9，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養液的進液乳膠管12和出液乳膠管13，敷銅板上引出工作電極10，對電極11與金膜參考電極5相連。測量時，微型測量腔上面粘光學玻璃為上蓋，形成密封測量腔。紅光雷射器6選擇照射某一細胞正上方，進液乳膠管與蠕動泵連接，通過泵的通斷控制藥物刺激，工作電極、參考電極、對電極與恆電位/電流儀相連，恆電位/電流儀通過鎖相放大器與數字補償電路相連，接入計算機，與計算機實現雙向通訊，控制溫度並實現數據採集處理，計算機與數字/模擬轉換器相連，控制蠕動泵通斷，檢測系統框圖如圖6所示。
2、傳感器的製備(1)光尋址電位傳感器的製備選用100n型單晶矽片作為LAPS的襯底。矽片經拋光清洗後，放入1000℃高溫爐中進行熱氧化20分鐘，使矽片正面生長一層厚度約為30nm的SiO2薄膜，利用打磨技術從背面將矽片的厚度打磨至100μm，然後用導電膠將矽片粘在敷銅板上，160℃高溫固化2小時，通過歐姆從敷銅板上接觸引出工作電極。
(2)矽器件表面處理本發明設計了兩種細胞固定的方案一，塗敷法，即在晶片表面做增強貼附性的塗層；二，通過改變晶片表面的粗糙度，做誘導細胞生長的圖形。
塗敷法過程如下將100μg/ml多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩衝液和8μg/ml層粘素的磷酸鹽緩衝液按1∶1混合，用0.22μm的微孔濾膜濾菌，將器件浸入該混合溶液(PLOL)中，37℃，5％CO2環境下，浸泡24小時，再用雙蒸水衝洗兩次，冷凍備用。實驗結果證明做了表面處理後的單細胞傳感器，斜率明顯增大，因此器件敏感性提高，從而提高了測量的靈敏度，如圖3所示，而且，細胞形態正常，突觸明顯，生長情況良好，如圖4所示。
改變晶片表面的粗糙度的過程如下用光刻技術在LAPS表面做2×2mm2的微腔圖形，改變矽片的表面粗糙度，然後再進行塗層的處理，如圖5所示。
(3)參考電極製備熱丙酮清洗增透光學玻璃，80℃烘乾。在玻璃表面，用坐標紙做掩模，採用磁控濺射技術在玻璃表面按掩模形狀鍍金，用導電膠將導線與金膜粘接，引出參考電極。
(4)微型測量腔設計用聚二甲基矽氧烷製備一0.2×5×5cm3的薄膜結構，用模具在上刻出與參考金電極類似的兩個測量腔，腔的尺寸為0.2×1.4×0.5cm3。用生物兼容性膠將此結構粘著於LAPS傳感器表面，在此腔中培養細胞，測量時，上面粘光學玻璃為上蓋，形成密封測量腔。
傳感器的原理由於要測量的是細胞外液體環境的生理參數，所以採用的是具有EIS結構的LAPS系統。它的基本原理是半導體的內光電效應，即當半導體受到一定波長的光照射時，半導體吸收光子，發生禁帶到導帶的躍遷，即產生電子空穴對。在一般情況下，電子空穴對很快複合，在外電路中是測不到電流的。如果，給LAPS外加反向偏置電壓時(n型矽加負壓，P型矽加正壓)，半導體中產生耗盡層，這時靠近耗盡層的電子空穴對就被耗盡層拉開。當固定光強時，就會產生光電壓，LAPS採用強度調製的光照射在器件的正面或背面，就可以在外電路中測量到電流。電流的大小，與光強、耗盡層的厚度(即外偏壓)等有關。
如圖7所示是n型矽襯底光尋址電位傳感器的特性曲線示意圖，該曲線可以分為截止區、過渡區(工作區)和飽和區，這是由矽的特性決定的。特性曲線沿偏壓軸的平移就是膜響應值，特性曲線決定了偏壓的選擇點、LAPS靈敏度、膜響應與測量值的對應關係等。
單細胞傳感器檢測細胞動作電位實施例選擇了1∶10000、1∶100000、1∶1000000(g/ml)三種濃度的乙醯膽鹼(Ach)作為神經元的刺激藥物，實驗結果表明，乙醯膽鹼對於大腦皮層的神經元是興奮作用。
如圖8所示，為未加任何藥物刺激時，細胞傳感器測得的信號，是信號分析的基線，圖中可以看出，有很小不規則的擾動，主要是由於測量系統同軸纜線未能起到很好的屏蔽作用以及環境的微小震動所引起的。如圖9所示，是在1∶1000000低濃度Ach作用下，細胞傳感器的響應，圖中曲線與基線相似，幾乎沒有變化，說明在該濃度下，Ach還未能引起細胞產生動作電位。如圖10所示，是在1∶100000中濃度Ach作用下，細胞傳感器的響應，由此圖可以看出，胞外的電位頻度和幅度都發生變化，檢測到有一頻率約為1Hz幅度約為1.8mV的電信號，初步判定為細胞的動作電位。如圖11所示，是在1∶10000高濃度Ach作用下，細胞傳感器的響應，該信號頻度和幅度都有很大的變化。
該結果說明，當Ach溶液在一定濃度範圍內變化，會引起細胞的胞外電位的改變，單細胞傳感器可以檢測到電信號頻度和幅度變化，而且，隨Ach濃度增加，電位的幅度增大。
權利要求
1.一種用於細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器，其特徵在於在鋁板(1)上固定敷銅板(2)，敷銅板(2)上粘附具有SiO2層(3.2)的打磨的Si片(3.1)，聚二甲基矽氧烷作的微型測量腔(7)固定在SiO2層(3.2)上，微型測量腔(7)上覆蓋一層生物兼容性膠(8)，與下表面鍍金膜參考電極(5)的光學玻璃(4)粘接，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養液的進液乳膠管(12)和出液乳膠管(13)，敷銅板上引出工作電極(10)，對電極(11)與金膜參考電極(5)相連。
2.根據權利要求1所述的一種用於細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器，其特徵在於所說的微型測量腔(7)為1～2個。
3.根據權利要求1所述的一種用於細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器的製備方法，其特徵在於(1)光尋址電位傳感器的製備選用100n型單晶矽片作為光尋址電位傳感器的襯底，矽片經拋光清洗後，放入1000℃高溫爐中進行熱氧化20分鐘，使矽片正面生長一層厚度約為30nm的SiO2薄膜，從背面將矽片的厚度打磨至100μm，然後用導電膠將矽片粘在敷銅板上，160℃高溫固化2小時，通過歐姆接觸從敷銅板上引出工作電極；(2)矽器件表面處理兩種細胞固定的方案塗敷法即在晶片表面做增強貼附性的塗層；通過改變晶片表面的粗糙度，做誘導細胞生長的圖形；塗敷法過程如下將100μg/ml多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩衝液和8μg/ml層粘素的磷酸鹽緩衝液按1∶1混合，用0.22μm的微孔濾膜濾菌，將器件浸入該混合溶液中，37℃，5％CO2環境下，浸泡24小時，再用雙蒸水衝洗兩次，冷凍備用；改變晶片表面的粗糙度的過程如下用光刻技術在光尋址電位傳感器表面做2×2mm2的微腔圖形，改變矽片的表面粗糙度，然後再進行塗層的處理；(3)參考電極製備熱丙酮清洗增透光學玻璃，80℃烘乾，在玻璃表面，用坐標紙做掩模，採用磁控濺射技術在玻璃表面按掩模形狀鍍金，用導電膠將導線與金膜參考電極粘接，參考電極再與對電極連接；(4)安置微型測量腔用聚二甲基矽氧烷製備0.2×5×5cm3的薄膜結構，用模具在上刻出兩個測量腔，腔的尺寸為0.2×1.4×0.5cm3，用生物兼容性膠將此結構粘著於光尋址電位傳感器表面，在此腔中培養細胞，測量時，上面粘光學玻璃為上蓋，形成密封的微型測量腔。
全文摘要
本發明公開了一種用於細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器及其製備方法。在早期多光源細胞微生理計的基礎上，利用光尋址電位傳感器(LAPS)技術，克服傳感器幾何特性對細胞培養的限制，採用光源移動尋址，對隨機培養的單個細胞跟蹤定位測量。本發明配套改進的光源系統，提高了精度和穩定度，可以將測量定位於單個細胞甚至單個離子通道，從而將精確測量藥物對單個細胞的作用及作用靶點。這種單細胞傳感器，可以實現神經細胞外動作電位的快速、實時監測，定性分析不同濃度不同藥物對細胞的興奮和抑制作用，主要應用於藥物篩選、分析和評價。
文檔編號G01N27/403GK1554942SQ200310122949
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月25日 優先權日2003年12月25日
發明者王平, 許改霞, 秦利鋒, 徐瑩, 王 平 申請人:浙江大學